一种超声-微波协同提取硫酸软骨素的方法转让专利
申请号 : CN201110218137.0
文献号 : CN102321193B
文献日 : 2013-01-30
发明人 : 段振华 , 成长玉 , 樊洁
申请人 : 海南大学
摘要 :
本发明公开了一种超声-微波协同提取硫酸软骨素的方法，先将罗非鱼加工下脚料经清洗、烘干、粉碎、脱脂后，过60目筛，得到鱼骨粉末；在超声-微波协同提取仪中进行提取；提取完成后浸提、过滤、冷却、调节pH，加入2%的复合蛋白酶进行酶解，酶解时间2h；待酶解结束后，进行灭酶、脱色、离心处理，所得上清液用超滤设备进行纯化浓缩，经乙醇沉淀后得到的不溶物，即为硫酸软骨素。该方法充分利用了超声波振动的空穴作用以及微波的高能作用，既缩短了提取时间，又显著提高了提取效率，从而大大的降低了生产成本，具有操作简便，提取周期短，提取率高，产品纯度高的优点。
权利要求 :
1.一种超声-微波协同提取硫酸软骨素的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：步骤1，
将鱼的下脚料依次经过蒸煮、清洗、烘干、粉碎、脱脂、过筛后得到鱼骨粉末；
步骤2，
在鱼骨粉末中加入体积百分浓度为1～3%的NaOH溶液，鱼骨粉末与NaOH溶液的质量比为1：40～70；将鱼骨粉末和NaOH溶液的混合物放置在超声波-微波协同提取仪中进行提取，设置其参数为：超声波30～50w，微波60～300w，提取时间90～270s；提取完成后，将提取物于50～70℃水浴锅中浸提20～40min，过滤，回收的滤液为提取液；
步骤3，
待提取液自然冷却至室温后，调节提取液的pH值至5～7；然后向提取液中加入复合蛋白酶，其添加量为提取液质量的2%，于40～60℃下恒温酶解2～4h，酶解结束后，灭酶，灭酶时间为5～10min；
步骤4，
待灭酶后的提取液自然冷却至室温后，加入粉末活性炭于50～60℃水浴锅中进行脱色20～30min，粉末活性炭的用量是灭酶后提取液质量的2%；对脱色后的提取液进行离心分离，将离心后所得上清液进行超滤处理，使其体积浓缩至原体积的1/2～1/3，得到浓缩液；
步骤5，
将浓缩液的pH值调节至5～7，再加入体积百分浓度为95%的乙醇，使最终的乙醇浓度控制在60～70%；然后静置至沉淀完全后，离心，将离心后所得的醇沉物用丙酮及石油醚脱水脱脂后干燥，即得到硫酸软骨素。
2.根据权利要求1所述提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述步骤1中，将鱼的下脚料于70～80℃水浴锅中蒸煮15～20min，清洗后，在50～60℃下烘干，经粉碎后，用丙酮进行脱脂，过50～60目筛，得到鱼骨粉末。
3.根据权利要求2所述提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述步骤1中，用丙酮对下脚料粉末进行脱脂的具体方法为：通过向下脚料粉末中加入4～5倍量的丙酮，充分搅拌后静置15～30min。
4.根据权利要求1所述提取硫酸软骨素的方法，其特征在于，所述步骤5中将离心后所得的醇沉物用丙酮及石油醚脱水脱脂，其具体方法为：首先向醇沉物中加入2～3倍量的丙酮，待醇沉物与丙酮充分反应后，离心，离心机的转速为4000～5000 rpm ，离心时间为
10～20min；随后取出沉淀物并加入2～3倍量的石油醚，待两者充分反应后离心，离心机的转速为4000～5000 rpm ，离心时间为10～20min。
说明书 :
一种超声-微波协同提取硫酸软骨素的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种硫酸软骨素的提取方法，特别涉及一种超声-微波协同提取硫酸软骨素的方法。
背景技术
[0002] 硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS) 是一类糖胺聚糖（GAGs），它是由D-乙酰-D-氨基半乳糖以1,3糖苷键同D-葡萄糖醛酸结合的双糖为基本单位聚合而成的大分子多糖，根据硫酸基团在N-乙酰-D-氨基半乳糖上的位置不同可分为硫酸软骨素A（CS-A）、硫酸软骨素C（CS-C）等。广泛存在于动物结缔组织中，具有防止血管硬化、降血脂、抗凝血、抗肿瘤、保护眼角膜以及保湿等作用，已经大量的应用于医药、生物材料以及化妆品等领域。
[0003] 硫酸软骨素的提取工艺很多，主要有：浓碱提取、稀碱浓盐提取、稀碱提取、稀碱-酶解提取法及双酶法等，其中最常用的是稀碱-酶解法，其主要的提取步骤为：碱提、酶解、脱色、醇沉、干燥。但这些方法普通具有提取周期长，提取率较低等缺点，比如采用浓碱提取时，虽然提取率相应有所提高，但高浓度的碱液会破坏硫酸软骨素的结构，进而影响其质量与提取率；但稀碱浓盐提取硫酸软骨素时，由于大量盐的存在，导致在最后一步纯沉的工艺中大量的盐类也会随之沉淀下来，因此后期工作中如何脱盐而不损失硫酸软骨素是关键，从而使提取工艺变的繁琐耗时，增加成本。
[0004] 为了获得更为经济有效的硫酸软骨素提取方法，本研究探索了一种超声-微波协同提取硫酸软骨素的方法。
[0005] 超声-微波协同提取新技术是直接将超声振动与开放式微波两种作用方式相结合，充分利用超声波振动的空穴作用以及微波的高能作用，弥补了常规超声波和微波提取之不足，保留了超声波提取或微波提取方法的优点，如振动匀化使样品介质内各点受到的作用一致，可供选择的提取溶剂种类多，目标提取物范围广泛，降低目标物与样品基体的结合力，加速目标物从固相进入溶剂相的过程,处理样品量大等优点。与传统提取方法相比，超声-微波协同提取克服了普通溶剂法加热时间长、能耗较高、产率较低的缺点，有利于极性和热不稳定性组分的提取，能避免长时间高温高压条件下提取或合成反应引起的分解，并不破坏所提取的有机物分子的结构。
[0006] 目前还未有用超声-微波协同提取的方法提取硫酸软骨素的报道。
[0007] 发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种提取硫酸软骨素的方法，操作简便、生产安全可靠、提取率高、能耗低、成本低、周期短，并且能获得纯度较高的硫酸软骨素。
[0009] 本发明所采用的技术方案为，一种超声-微波协同提取硫酸软骨素的方法，包括以下操作步骤：
[0010] 步骤1，
[0011] 将鱼的下脚料依次经过蒸煮、清洗、烘干、粉碎、脱脂、过筛后得到鱼骨粉末；
[0012] 步骤2，
[0013] 在鱼骨粉末中加入体积百分浓度为1～3%的NaOH溶液，鱼骨粉末与NaOH溶液的质量比为1：40～70；将鱼骨粉末和NaOH溶液的混合物放置在超声波-微波协同提取仪中进行提取，设置其参数为：超声波30～50w，微波60～300w，提取时间90～270s；提取完成后，将提取物于50～70℃水浴锅中浸提20～40min，过滤，回收的滤液为提取液；
[0014] 步骤3，
[0015] 待提取液自然冷却至室温后，调节提取液的pH值至5～7；然后向提取液中加入复合蛋白酶，其添加量为提取液质量的2%，于40～60℃下恒温酶解2～4h，酶解结束后，灭酶，灭酶时间为5～10min；
[0016] 步骤4，
[0017] 待灭酶后的提取液自然冷却至室温后，加入粉末活性炭于50～60℃水浴锅中进行脱色20～30min，粉末活性炭的用量是灭酶后提取液质量的2%；对脱色后的提取液进行离心分离，将离心后所得上清液进行超滤处理，使其体积浓缩至原体积的1/2～1/3，得到浓缩液；
[0018] 步骤5，
[0019] 将浓缩液的pH值调节至5～7，再加入体积百分浓度为95%的乙醇，使最终的乙醇浓度控制在60～70%；然后静置至沉淀完全后，离心，将离心后所得的醇沉物用丙酮及石油醚脱水脱脂后干燥，即得到硫酸软骨素。
[0020] 上述步骤1中，将鱼的下脚料于70～80℃水浴锅中蒸煮15～20min，清洗后，在50～60℃下烘干，经粉碎后，用丙酮进行脱脂，过50～60目筛，得到鱼骨粉末。
[0021] 上述步骤1中，用丙酮对下脚料粉末进行脱脂的具体方法为：通过向下脚料粉末中加入4～5倍量的丙酮，充分搅拌后静置15～30min。
[0022] 上述步骤5中将离心后所得的醇沉物用丙酮及石油醚脱水脱脂，其具体方法为：首先向醇沉物中加入2～3倍量的丙酮，待醇沉物与丙酮充分反应后，离心，离心机的转速为4000～5000 rpm ，离心时间为10～20min；随后取出沉淀物并加入2～3倍量的石油醚，待两者充分反应后离心，离心机的转速为4000～5000 rpm ，离心时间为10～20min。
[0023] 本发明的有益效果，将超声波和微波很好的结合起来，充分利用超声波的空化效应和微波的高能作用，既缩短了提取时间，又显著提高了提取效率，从而大大的降低了生产成本；同时实现了在碱液浓度很低（1～3%）的情况下保证硫酸软骨素的提取率较高。本发明中还用了超滤设备，不仅解决了纯化和浓缩问题，而且还能达到脱盐的目的，避免使用如旋转蒸发仪和透析袋之类操作繁琐，而且处理量少的仪器设备。本发明从根本上克服了传统方法大量使用强碱、高盐、提取时间较长等缺点，提取过程简单方便，易于操作，生产所得硫酸软骨素产品质量稳定，纯度较高。
附图说明
[0024] 图1是硫酸软骨素标准品的红外光谱图；
[0025] 图2 是利用本发明提供的方法制备的硫酸软骨素样品的红外光谱图。
[0026] 具体实施方式
[0027] 以下以具体实施例来说明本发明的技术方案。
[0028] 实施例1
[0029] 将罗非鱼的下脚料（含鱼头、鱼鳍、鱼尾）于80℃水浴锅中蒸煮20min，清洗后，于60℃下烘干，经粉碎后，向下脚料粉末中加入体积百分浓度为99%的丙酮，加入丙酮的重量是下脚料粉末重量的4倍，充分搅拌后静置20min进行脱脂，然后过60目筛，得到鱼骨粉末；精确称取5.000g鱼骨粉末，再向鱼骨粉末中加入300g体积百分浓度为2%的NaOH溶液；将鱼骨粉末和NaOH溶液的混合物在超声波-微波协同提取仪中提取，设置其参数为：
超声波50w，微波200w，提取时间120s；提取完成后，将提取物于60℃水浴锅中浸提30min，过滤，得到294g提取液；待提取液自然冷却至室温后，调节提取液的pH值至6，然后向提取液中加入6g复合蛋白酶，于60℃下恒温酶解2h，酶解结束后，在90℃下灭酶5min，灭酶后的提取液为290g；待灭酶后的提取液自然冷却至室温后，加入5.8g粉末活性炭于60℃水浴锅中脱色20min；对脱色后的提取液进行离心分离，将离心后所得上清液进行超滤处理，使其体积浓缩至原体积的1/3，得到浓缩液；将浓缩液pH值调节至6，再加入体积百分浓度为
95%的乙醇，使最终的乙醇浓度控制在70%；然后静置至沉淀完全后，离心，将离心后所得的醇沉物中加入体积百分浓度为99%的丙酮，加入丙酮的重量是醇沉淀物重量的2倍，待醇沉物与丙酮充分反应后，离心，离心机的转速为4000 rpm ，离心时间为15min；随后取出沉淀物并加入石油醚，加入石油醚的重量是沉淀物重量的3倍，待两者充分反应后离心，离心机的转速均为4000rpm，离心时间为15min，完成脱水脱脂后，干燥，即得到0.1200g硫酸软骨素。经计算硫酸软骨素的提取率2.4%，纯度88.4%。
超声波50w，微波200w，提取时间120s；提取完成后，将提取物于60℃水浴锅中浸提30min，过滤，得到294g提取液；待提取液自然冷却至室温后，调节提取液的pH值至6，然后向提取液中加入6g复合蛋白酶，于60℃下恒温酶解2h，酶解结束后，在90℃下灭酶5min，灭酶后的提取液为290g；待灭酶后的提取液自然冷却至室温后，加入5.8g粉末活性炭于60℃水浴锅中脱色20min；对脱色后的提取液进行离心分离，将离心后所得上清液进行超滤处理，使其体积浓缩至原体积的1/3，得到浓缩液；将浓缩液pH值调节至6，再加入体积百分浓度为
95%的乙醇，使最终的乙醇浓度控制在70%；然后静置至沉淀完全后，离心，将离心后所得的醇沉物中加入体积百分浓度为99%的丙酮，加入丙酮的重量是醇沉淀物重量的2倍，待醇沉物与丙酮充分反应后，离心，离心机的转速为4000 rpm ，离心时间为15min；随后取出沉淀物并加入石油醚，加入石油醚的重量是沉淀物重量的3倍，待两者充分反应后离心，离心机的转速均为4000rpm，离心时间为15min，完成脱水脱脂后，干燥，即得到0.1200g硫酸软骨素。经计算硫酸软骨素的提取率2.4%，纯度88.4%。
[0030] 实施例2
[0031] 将罗非鱼的下脚料（仅含鱼头）于70℃水浴锅中蒸煮15min，清洗后，于55℃下烘干，经粉碎后，向下脚料粉末中加入体积百分浓度为99%的丙酮，加入丙酮的重量是下脚料粉末重量的5倍，充分搅拌后静置30min进行脱脂，然后过50目筛，得到鱼骨粉末；精确称取4.000g鱼骨粉末，再向鱼骨粉末中加入280g体积百分浓度为1%的NaOH溶液；将鱼骨粉末和NaOH溶液的混合物在超声波-微波协同提取仪中提取，设置其参数为：超声波40w，微波300w，提取时间90s；提取完成后，将提取物于50℃水浴锅中浸提20min，过滤，得到272g提取液；待提取液自然冷却至室温后，调节提取液的pH值至5，然后向提取液中加入5.6g复合蛋白酶，于40℃下恒温酶解3h，酶解结束后，在90℃下灭酶8min，灭酶后的提取液为278g；待灭酶后的提取液自然冷却至室温后，加入5.56g粉末活性炭于58℃水浴锅中脱色
23min；对脱色后的提取液进行离心分离，将离心后所得上清液进行超滤处理，使其体积浓缩至原体积的1/3，得到浓缩液；将浓缩液pH值调节至5，再加入体积百分浓度为95%乙醇，使最终的乙醇浓度控制在68%；然后静置至沉淀完全后，离心，将离心后所得的醇沉物中加入体积百分浓度为99%的丙酮，加入丙酮的重量是醇沉淀物重量的2.5倍，待醇沉物与丙酮充分反应后，离心，离心机的转速为4200rpm，离心时间为20min；随后取出沉淀物并加入石油醚，加入石油醚的重量是沉淀物重量的2倍，待两者充分反应后离心，离心机的转速均为
4200rpm，离心时间为20min，完成脱水脱脂后，干燥，即得到0.1084g硫酸软骨素。经计算硫酸软骨素的提取率2.71%，纯度89.2%。
23min；对脱色后的提取液进行离心分离，将离心后所得上清液进行超滤处理，使其体积浓缩至原体积的1/3，得到浓缩液；将浓缩液pH值调节至5，再加入体积百分浓度为95%乙醇，使最终的乙醇浓度控制在68%；然后静置至沉淀完全后，离心，将离心后所得的醇沉物中加入体积百分浓度为99%的丙酮，加入丙酮的重量是醇沉淀物重量的2.5倍，待醇沉物与丙酮充分反应后，离心，离心机的转速为4200rpm，离心时间为20min；随后取出沉淀物并加入石油醚，加入石油醚的重量是沉淀物重量的2倍，待两者充分反应后离心，离心机的转速均为
4200rpm，离心时间为20min，完成脱水脱脂后，干燥，即得到0.1084g硫酸软骨素。经计算硫酸软骨素的提取率2.71%，纯度89.2%。
[0032] 实施例3
[0033] 将罗非鱼的下脚料（含鱼头、鱼鳍、鱼尾）于75℃水浴锅中蒸煮18min，清洗后，于50℃下烘干，经粉碎后，向下脚料粉末中加入体积百分浓度为99%的丙酮，加入丙酮的重量是下脚料粉末重量的4.4倍，充分搅拌后静置15min进行脱脂，然后过55目筛，得到鱼骨粉末；精确称取5.000g鱼骨粉末，再向鱼骨粉末中加入200g体积百分浓度为3%的NaOH溶液；
将鱼骨粉末和NaOH溶液的混合物在超声波-微波协同提取仪中提取，设置其参数为：超声波30w，微波60w，提取时间270s；提取完成后，将提取物于70℃水浴锅中浸提40min，过滤，得到194g提取液；待提取液自然冷却至室温后，调节提取液的pH值至7，然后向提取液中加入4g复合蛋白酶，于50℃下恒温酶解4h，酶解结束后，在90℃下灭酶10min，灭酶后的提取液为200g；待灭酶后提取液自然冷却至室温后，加入4g粉末活性炭于50℃水浴锅中脱色
30min；对脱色后的提取液进行离心分离，将离心后所得上清液进行超滤处理，使其体积浓缩至原体积的1/2，得到浓缩液；将浓缩液pH值调节至7，再加入体积百分浓度为95%乙醇，使最终的乙醇浓度控制在60%；然后静置至沉淀完全后，离心，将离心后所得的醇沉物中加入体积百分浓度为99%的丙酮，加入丙酮的重量是醇沉淀物重量的3倍，待醇沉物与丙酮充分反应后，离心，离心机的转速为5000rpm ，离心时间为10min；随后取出沉淀物并加入石油醚，加入石油醚的重量是沉淀物重量的2.3倍，待两者充分反应后离心，离心机的转速均为5000 rpm，离心时间为10min，完成脱水脱脂后，干燥，即得到0.1065g硫酸软骨素。经计算硫酸软骨素的提取率2.13%，纯度87.9%。
将鱼骨粉末和NaOH溶液的混合物在超声波-微波协同提取仪中提取，设置其参数为：超声波30w，微波60w，提取时间270s；提取完成后，将提取物于70℃水浴锅中浸提40min，过滤，得到194g提取液；待提取液自然冷却至室温后，调节提取液的pH值至7，然后向提取液中加入4g复合蛋白酶，于50℃下恒温酶解4h，酶解结束后，在90℃下灭酶10min，灭酶后的提取液为200g；待灭酶后提取液自然冷却至室温后，加入4g粉末活性炭于50℃水浴锅中脱色
30min；对脱色后的提取液进行离心分离，将离心后所得上清液进行超滤处理，使其体积浓缩至原体积的1/2，得到浓缩液；将浓缩液pH值调节至7，再加入体积百分浓度为95%乙醇，使最终的乙醇浓度控制在60%；然后静置至沉淀完全后，离心，将离心后所得的醇沉物中加入体积百分浓度为99%的丙酮，加入丙酮的重量是醇沉淀物重量的3倍，待醇沉物与丙酮充分反应后，离心，离心机的转速为5000rpm ，离心时间为10min；随后取出沉淀物并加入石油醚，加入石油醚的重量是沉淀物重量的2.3倍，待两者充分反应后离心，离心机的转速均为5000 rpm，离心时间为10min，完成脱水脱脂后，干燥，即得到0.1065g硫酸软骨素。经计算硫酸软骨素的提取率2.13%，纯度87.9%。
[0034] 利用本发明制备方法所测得的样品红外光谱如图2所示，整个红外光谱大致分为-1 -1两个区域：官能团区（4000～1300cm ）、指纹区（1300～400cm ），与图1所示标准品的红外光谱比较，二者非常接近, 初步断定利用超声-微波协同萃取所得的样品为硫酸软骨素。
[0035] 如图2所示，样品的红外光谱在3424cm-1附近有强吸收，说明含有多糖羟基（—-1 -1OH）；在1630cm 附近有强吸收，说明有乙酰氨基（—NHCOCH3）存在；在1412cm 附近有吸-1 -1
收，说明有羧基（—COOH）的存在。而在1240cm 及858cm 附近有吸收，表明有硫酸基（—O-SO3）存在。
收，说明有羧基（—COOH）的存在。而在1240cm 及858cm 附近有吸收，表明有硫酸基（—O-SO3）存在。
[0036] 图1和图2中的横坐标表示波数（cm-1），纵坐标表示透光率（%）。