一种生物活性壳聚糖基多孔支架的制备方法

摘要

本发明公开了一种生物活性壳聚糖基多孔支架的制备方法，以壳聚糖和具有生物活性的无机微/纳米粒为原料制成浆料，以水溶性醛基化多糖聚合物为交联剂，通过希夫碱交联过程和冷冻干燥法制成一类生物活性壳聚糖基复合材料多孔支架，其孔隙率、孔径大小、力学性能、降解性能和骨传导性/骨诱导性等可通过配方和工艺条件来调控。本发明的多孔支架未使用有害的化学交联剂，不会对细胞造成不利影响；交联的多孔结构和大量亲水基团如氨基、羧基和羟基等，使其在宽pH范围(pH5～9)内的水相中具有较高的化学稳定性，具有柔软、高弹性和达30倍的溶胀比等突出优点；在多孔结构、物质化学成分和表面化学等方面具有仿自然骨细胞外微环境的优点。

权利要求

1.一种生物活性壳聚糖基多孔支架的制备方法，其特征在于：在壳聚糖和无机生物活性微/纳米粒浆料中加入水溶性醛基化多糖聚合物的溶液，经冷冻干燥法制得生物活性壳聚糖基多孔支架；其中，无机生物活性材料和水溶性醛基化多糖聚合物分别占壳聚糖的质量百分比5~40%和3~10%；

具体包括以下步骤：

1）水溶性醛基化多糖聚合物的合成

首先将水溶性多糖聚合物溶于水中形成质量百分比浓度为2~25%的多糖聚合物溶液，然后用5mol/L的硫酸调节多糖聚合物溶液的pH值为1~4后在避光条件下分批加入水溶性多糖聚合物质量1~5倍的高碘酸钠，在搅拌下于35~60°C反应3~8h后再加入过量的乙二醇继续反应30min；反应结束后，用冷乙醇沉淀出产物，用水和乙醇混合物充分洗涤至无碘检出；最后，经室温真空干燥得到水溶性醛基化多糖聚合物；

所述的水溶性多糖聚合物为羧甲基纤维素钠、透明质酸、右旋糖酐、海藻酸钠或硫酸软骨素；

2）壳聚糖-生物活性无机微/纳米粒浆料制备

在搅拌条件下，将壳聚糖溶于体积分数为2%的乙酸水溶液中形成质量百分比浓度为

1~3%的壳聚糖溶液，然后向其中加入壳聚糖质量5~40%的生物活性微/纳米粒，经行星式球磨机球磨后得到稳定的壳聚糖-生物活性无机微/纳米粒浆料；

所述的壳聚糖是脱乙酰度为55~95%、分子量为10~50万的壳聚糖；

所述的生物活性微/纳米粒为纳米羟基磷灰石、亚微米级α-磷酸三钙、亚微米级β-磷酸三钙或微米级45S5玻璃粉；

3）希夫碱交联过程

将步骤1）中得到的水溶性醛基化多糖聚合物溶于蒸馏水中制成质量百分比浓度为

2~8%的醛基化多糖聚合物溶液，在剧烈搅拌下以10~200μl/min的速度将醛基化多糖聚合物溶液滴加至步骤2）的壳聚糖-生物活性无机微/纳米粒浆料中，控制醛基化多糖聚合物与壳聚糖的质量比为3∶100~10∶100，滴加结束后继续搅拌10~30min，然后将其注入24孔培养板中，于-0.06~-0.03MPa环境中静置12小时，以彻底脱泡和使交联反应充分，得到凝胶状试样；

4）冷冻-干燥

将步骤3）制成的凝胶状试样置于冷冻干燥机中，以-50°C/10h、-40°C/8h、-30°C/8h、-20°C/12h、-10°C/12h和5°C/8h冻干工艺进行冷冻-干燥，从24孔培养板中脱模即得到初步多孔支架；

5）后处理

先用质量百分比浓度为2%的氢氧化钠的乙醇溶液浸泡得到的初步多孔支架以中和其中的乙酸，接着用体积比为1∶9~4∶6的蒸馏水：乙醇混合溶液对初步多孔支架进行清洗，使混合溶液pH为7，再用纯蒸馏水洗两次后进行冷冻-干燥得到生物活性壳聚糖基多孔支架。

2.根据权利要求1所述的生物活性壳聚糖基多孔支架的制备方法，其特征在于：所述的步骤3）中剧烈搅拌的转速为1000转/分以上。

说明书

一种生物活性壳聚糖基多孔支架的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于再生医学技术中的生物医用材料领域，涉及一种组织工程多孔支架及制备方法，具体涉及一种适用于骨等硬组织修复的生物活性壳聚糖基多孔支架的制备方法。

背景技术

[0002] 组织工程技术是近些年发展起来的、最富前景的缺损组织再生修复新手段，已成为再生医学领域中研究最活跃的方向。其本质是通过在体外构建模拟自然组织中细胞外基质的微环境，即多孔支架，包括空间上的多孔结构、基质化学成分和组成、生物活性因子等，为种子细胞提供高度仿真的三维环境，以利于细胞粘附、分化、增殖，在特定的动态物理、化学和生物信号调控下形成具有一定功能的组织。用于制备多孔支架的生物材料主要包括合成高分子材料、天然高分子材料和无机材料三大类。其中，合成生物高分子材料由于具有分子结构和性能可设计性，一直是研究的重点，然而它们存在着亲水性较差、缺乏细胞识别的生物信号等不足；天然生物高分子具有良好的亲水性、生物相容性和生物降解性以及独特的生物活性等优点，但它们存在降解过快、力学性能不够理想等缺点；而无机生物材料通常具有生物活性如骨传导性甚至骨诱导性，但存在脆性大等问题，主要应用于骨等硬组织缺损的修复。

[0003] 在临床上，由各种原因导致的骨缺损十分常见，但欲获得理想的结构修复和功能恢复仍具有很大的挑战性，已成为再生医学研究的重点领域之一。骨组织工程作为一种新的缺损骨再生修复技术，被寄予了厚望。为制备综合性能优良的骨组织工程多孔支架，以壳聚糖为代表的天然生物高分子材料为基础原料，通过与生物活性材料复合制成复合材料支架，已受到越来越多的重视。

[0004] 壳聚糖是天然高分子甲壳质的脱乙酰化产物，它是一种线性的、由D-氨基葡萄糖经β-1，4糖苷键结合而成的阳离子性聚合物。由于它具有反应性官能团、凝胶形成能力、抗微生物、抗肿瘤和低免疫原性等优点，已在生物医学、药学、环境、食品等工业领域得到应用。有关壳聚糖的基础生物医学研究和实际临床应用业已证明，壳聚糖具有优异的生物相容性和生物可降解性以及无免疫原性等性能。近来的一些研究表明，壳聚糖具有类似细胞外基质粘多糖的许多性质，因此，壳聚糖被认为是理想的细胞外基质候选材料。然而，壳聚糖及其制备的多孔支架存在明显的不足，如仅溶于酸性水溶液而在中性和碱性环境中不溶、力学强度和水相中化学稳定性较差、缺乏生物活性等，限制了其在骨等硬组织工程中的应用。为解决这些问题，目前文献报道(Zhu Y X，et al.Collagen-chitosan polymer as a scaffold for the proliferation of human adipose tissue-derived stem cells[J].J Mater Sci：Mater Med，2009，20：799；Zhu A M，et al.Controlled release of berberine hydrochloride from alginate microspheres embedded within carboxymethyl chitosan hydrogels[J].J Appl Polym Sci，2011，120：2374；Yan L P，et al.Genipin-cross-linked collagen/chitosan biomimetic scaffolds for articular cartilage tissue engineering applications[J].J Biomed Mater Res Part A，2010，95A：465；杨荣华，等.一种多孔羟基磷灰石/壳聚糖-明胶复合材料支架[P].专利申请号：200910250313.1)中主要采用小分子交联剂如戊二醛、碳二亚胺、京尼平等对壳聚糖进行化学交联，以提高壳聚糖基多孔支架力学性能和化学稳定性。然而，这些交联剂对细胞有潜在的毒性，制约了壳聚糖基多孔支架的发展。近几年，研究表明醛基化多糖类聚合物比小分子量醛类具有更快的胶凝效果和更好的生物相容性(Nair S，et al.A biodegradable in situ injectable hydrogel based on chitosan and oxidized hyaluronic acid for tissue engineering applications [J].Carbohyd Polym，2011，85：838；Hoffmann B，et al.Glutaraldehyde and oxidised dextran as crosslinker reagents for chitosan-based scaffolds for cartilage tissue engineering[J].J Mater Sci：Mater Med，2009，20：1495；E J缇吉斯玛，等.基于壳聚糖和氧化多糖的保护性凝胶[P].专利申请号200980118461.6)。

[0005] 无机生物材料，如羟基磷灰石、磷酸三钙和各种生物活性玻璃等，已成为增强高分子材料力学性能和生物活性的主要手段。对壳聚糖而言，由于其在碱性条件下不溶，难以采用原位形成无机材料的方法制备复合材料，通常只能采用壳聚糖溶液和无机材料悬液混合的方法制备。然而，这种简单复合虽然可提高干态壳聚糖复合材料的生物活性，改善力学性能，但无机材料的加入干扰了壳聚糖分子间的氢键作用，降低了结晶度，从而降低了其在水相中的稳定性，使降解速度加快。为此，有研究者(Jiang L Y，et al.Preparation and properties of nano-hydroxyapatite/chitosan/carboxymethyl cellulose composite scaffold[J].Carbohyd Polym，2008，74：680)通过添加一定量聚阴离子，以离子交联方法获得稳定的复合材料，但这种方法降低了支架孔隙率，而且该交联方法得到的支架稳定性受pH影响较大。最近，有文献报道(Wang G C，et al.Construction of a fluorescent nanostructured chitosan-hydroxyapatite scaffold by nano-crystallon induced biomimetic mineralization and its cellbiocompatibility[J].ACS Appl Mater Interfaces，2011，3(5)：1692)利用京尼平交联壳聚糖/羟基磷灰石浆料制备壳聚糖基复合材料多孔支架，并用骨髓基质干细胞进行了生物学评价，取得了较好的初步结果。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服现有壳聚糖基多孔支架的缺陷，提供了一种生物活性壳聚糖基多孔支架的制备方法。本发明的多孔支架具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，可广泛应用于组织工程技术修复骨等硬组织缺损。

[0007] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：在壳聚糖和无机生物活性微/纳米粒浆料中加入水溶性醛基化多糖聚合物的溶液，经冷冻干燥法制得生物活性壳聚糖基多孔支架；其中，无机生物活性材料和醛基化多糖聚合物分别占壳聚糖的质量百分比5～40％和3～10％。

[0008] 具体步骤如下：

[0009] 1)水溶性醛基化多糖聚合物的合成

[0010] 首先将水溶性多糖聚合物溶于水中形成质量百分比浓度为2～25％的多糖聚合物溶液，然后用5mol/L的硫酸调节多糖聚合物溶液的pH值为1～4后在避光条件下分批加入多糖聚合物质量1～5倍的高碘酸钠，在搅拌下于35～60℃反应3～8h后再加入过量的乙二醇继续反应30min；反应结束后，用冷乙醇沉淀出产物，用水和乙醇混合物充分洗涤至无碘检出；最后，经室温真空干燥得到水溶性醛基化多糖聚合物；

[0011] 2)壳聚糖-生物活性无机微/纳米粒浆料制备

[0012] 在搅拌条件下，将壳聚糖溶于体积分数为2％的乙酸水溶液中形成质量百分比浓度为1～3％的壳聚糖溶液，然后向其中加入壳聚糖质量5～40％的生物活性微/纳米粒，经行星式球磨机球磨后得到稳定的壳聚糖-生物活性无机微/纳米粒浆料；

[0013] 3)希夫碱交联过程

[0014] 将步骤1)中得到的水溶性醛基化多糖聚合物溶于蒸馏水中制成质量百分比浓度为2～8％的醛基化多糖聚合物溶液，在剧烈搅拌下以10～200μl/min的速度将醛基化多糖聚合物溶液滴加至步骤2)的壳聚糖-生物活性无机微/纳米粒浆料中，控制醛基化多糖聚合物与壳聚糖的质量比为3∶100～10∶100，滴加结束后继续搅拌10～30min，然后将其注入24孔培养板中，于-0.06～-0.03MPa环境中静置12小时，以彻底脱泡和使交联反应充分，得到凝胶状试样；

[0015] 4)冷冻-干燥

[0016] 将步骤3)制成的凝胶状试样置于冷冻干燥机中，以-50℃/10h、-40℃/8h、-30℃/8h、-20℃/12h、-10℃/12h和5℃/8h冻干工艺进行冷冻-干燥，从24孔培养板中脱模即得到初步多孔支架；

[0017] 5)后处理

[0018] 先用质量百分比浓度为2％的氢氧化钠的乙醇溶液浸泡得到的初步多孔支架以中和其中的乙酸，接着用体积比为1∶9～4∶6的蒸馏水∶乙醇混合溶液对初步多孔支架进行清洗，使混合溶液pH为7，再用纯蒸馏水洗两次后进行冷冻-干燥得到生物活性壳聚糖基多孔支架。

[0019] 所述的水溶性多糖聚合物为羧甲基纤维素钠、透明质酸、右旋糖酐、海藻酸钠或硫酸软骨素。

[0020] 所述的壳聚糖为脱乙酰度为55～95％、分子量为10～50万的壳聚糖。

[0021] 所述的生物活性微/纳米粒为纳米羟基磷灰石、亚微米级α-磷酸三钙、亚微米级β-磷酸三钙或微米级45S5玻璃粉。

[0022] 所述的剧烈搅拌的转速为1000转/分以上。

[0023] 本发明将生物相容性和生物降解性好的壳聚糖和具有生物活性的无机微/纳米粒复合，利用生物相容性好的水溶性醛基化多糖聚合物为希夫碱交联剂，经希夫碱交联和冷冻干燥制成多孔支架。该多孔支架综合性能满足骨等组织工程技术的基本应用要求。该支架孔径范围为80～300μm，孔隙率约为90％，压缩强度范围为300～700kPa，并具有良好的孔连通性和的孔壁粗糙度，利于细胞粘附和生长。

[0024] 本发明相对于现有技术所具有的优点及有益效果：

[0025] (1)以生物相容性好的水溶性醛基化多糖聚合物为交联剂，通过希夫碱形成实现壳聚糖交联，避免了使用戊二醛等对细胞有害的小分子化学交联剂，提高了多孔支架的生物相容性。

[0026] (2)水溶性醛基化多糖聚合物交联剂的使用，不仅提高了壳聚糖基多孔支架的强度和水相中的稳定性，而且赋予多孔支架更好的亲水性，利于细胞粘附和多孔支架内外物质传输，进而利于细胞的增殖和生长。

[0027] (3)无机生物活性微/纳米粒作为复合材料组分之一，既赋予了支架生物活性，又实现了在不改变冻干法制备多孔支架形貌的情况下增加了孔壁表面粗糙度，人成骨样细胞MG-63细胞的培养研究已证实细胞在该多孔支架上粘附和生长效果良好。

[0028] (4)利用希夫碱交联-冻干法制备的壳聚糖基多孔支架，干态时表现为坚硬、无弹性的多孔体，而在水相中呈现柔软、高弹性和高溶胀特点，其降解性、孔径范围、孔连通性和力学强度等性质能满足骨等硬组织的组织工程技术应用要求。

[0029] (5)本发明的制备方法具有工艺不复杂、操作方便、原料丰富、成本低等优点。

附图说明

[0030] 图1是生物活性壳聚糖基多孔支架制备原理示意图。

[0031] 该交联反应发生在壳聚糖分子链上氨基和醛基化多糖聚合物上醛基之间，二者反应形成希夫碱键，获得三维交联空间网络。与此同时，生物活性的无机粒子被嵌入网络之中。

[0032] 图2是醛基化羧甲基纤维素希夫碱交联壳聚糖的红外光谱图。

[0033] 在壳聚糖的红外光谱中，1656cm-1和1596cm-1处分别是酰胺I和II的特征振动-1 -1峰；在醛基化羧甲纤维素的红外光谱图中，1737cm 和885cm 两个吸收峰分别是醛基和半缩醛的特征吸收峰，表明多糖聚合物已被成功氧化出醛基基团；在交联产物的红外光谱中，-1
1640cm 处的吸收峰是希夫碱(-C＝N-)的特征吸收峰，这证实了壳聚糖上氨基基团和醛基化多糖聚合物上醛基之间发生了化学反应，形成了希夫碱键。

[0034] 图3是壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合支架的扫描电镜图。

[0035] 扫描电镜照片表明，该多孔支架孔径范围为80～300μm，孔间连通性好，复合的羟基磷灰石粉体被嵌入壳聚糖基体中，使孔壁表面呈铺路石样的粗糙结构；阿基米德法测得的孔隙率为91％，压缩强度为750kPa。

[0036] 图4是壳聚糖/亚微米β-磷酸三钙复合支架的扫描电镜图。

[0037] 扫描电镜的结果与图3的类似，不同之处孔壁粗糙度更大一些，这是因为添加的亚微米级β-磷酸三钙粒度大于纳米级羟基磷灰石造成的；阿基米德法测得的孔隙率为87％，压缩强度为680kPa。

[0038] 图5是人成骨样细胞MG-63细胞在壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合支架上培养5天的扫描电镜图。

[0039] 扫描电镜表明，MG-63细胞在支架上形成了团簇状的细胞球，表明该多孔支架具有很好的生物相容性。

[0040] 图6是人成骨样细胞MG-63细胞在壳聚糖/亚微米β-磷酸三钙复合支架上培养3天的扫描电镜图。

[0041] 扫描电镜结果类似图5，表明这种多孔支架也具有很好的生物相容性。

[0042] 图7是MTT法测得的人成骨样细胞MG-63细胞在壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合支架上的增殖情况MTT法结果表明，MG-63细胞在该支架上生长良好，在培养第3天后，增殖生长更加明显，这表明该多孔支架能支持细胞生长和促进细胞增殖，用作骨组织工程多孔支架的潜力大。

具体实施方式

[0043] 以下通过实施例对本发明技术方案进一步说明，不是对本发明保护范围的限制。图1是生物活性壳聚糖基多孔支架制备原理示意图。

[0044] 实施例1：壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合多孔支架制备

[0045] 1)水溶性醛基化羧甲基纤维素的合成

[0046] 首先将水溶性多糖聚合物羧甲基纤维素钠溶于水中形成质量百分比浓度为5％的多糖聚合物溶液，然后用5mol/L的硫酸调节多糖聚合物溶液的pH值为3后在避光条件下分批加入多糖聚合物质量5倍的高碘酸钠，在搅拌下于45℃反应6h后再加入过量的乙二醇继续反应30min；反应结束后，用冷乙醇沉淀出产物，用水和乙醇混合物充分洗涤至无碘检出；最后，经室温真空干燥得到水溶性醛基化羧甲基纤维素；

[0047] 2)壳聚糖-羟基磷灰石浆料制备

[0048] 在搅拌条件下，将脱乙酰度为90％、分子量为20万的壳聚糖溶于体积分数为2％的乙酸水溶液中形成质量百分比浓度为2％的壳聚糖溶液，然后向其中加入壳聚糖质量20％的纳米羟基磷灰石，经行星式球磨机球磨后得到稳定的壳聚糖-羟基磷灰石浆料；

[0049] 3)希夫碱交联过程

[0050] 将步骤1)中得到的水溶性醛基化羧甲基纤维素溶于蒸馏水中制成质量百分比浓度为4％的水溶性醛基化羧甲基纤维素溶液，在1200转/分剧烈搅拌下以100μl/min的速度将水溶性醛基化羧甲基纤维素溶液滴加至步骤2)的壳聚糖-羟基磷灰石浆料中，控制醛基化羧甲基纤维素与壳聚糖的质量比为5∶100，滴加结束后继续搅拌30min，然后将其注入24孔培养板中，于-0.04MPa环境中静置12小时，以彻底脱泡和使交联反应充分，得到凝胶状试样；该希夫碱交联过程验证的红外光谱图见图2。

[0051] 4)冷冻-干燥

[0052] 将步骤3)制成的凝胶状试样置于冷冻干燥机中，以-50℃/10h、-40℃/8h、-30℃/8h、-20℃/12h、-10℃/12h和5℃/8h冻干工艺进行冷冻-干燥，从24孔培养板中脱模即得到初步多孔支架；

[0053] 5)后处理

[0054] 先用质量百分比浓度为2％的氢氧化钠的乙醇溶液浸泡得到的初步多孔支架以中和其中的乙酸，接着用体积比为2∶8的蒸馏水∶乙醇混合溶液对初步多孔支架进行清洗，使混合溶液pH为7，再用纯蒸馏水洗两次后进行冷冻-干燥得到生物活性壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合多孔支架。见图3。

[0055] 细胞培养

[0056] 将制备的生物活性壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合多孔支架加成厚度为3mm、直径为4mm的圆片，经75％(v/v)的乙醇和紫外线照射对进行灭菌处理后，置于96孔板内，用4
DMEM培养液浸泡4h，去除培养液后在每孔中种植5×10 个人成骨样细胞MG-63细胞，置于
37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱内孵育8h，待细胞贴壁后补加培养基，继续进行培养。每天更换新鲜培养液。培养1、3和5天后，去除培养液，用磷酸盐缓冲液淋洗后用2.5％(v/v)戊二醛固定1h，再用梯度浓度酒精进行脱水处理，室温真空干燥两天或冻干，用于电镜观察。培养细胞5天的电镜照片见图5，培养1、3和5天的细胞增殖情况见图7。

[0057] 实施例2：壳聚糖/β-磷酸三钙复合多孔支架制备

[0058] 1)水溶性醛基化多糖透明质酸的合成

[0059] 首先将水溶性多糖聚合物透明质酸溶于水中形成质量百分比浓度为2％的多糖聚合物溶液，然后用5mol/L的硫酸调节多糖聚合物溶液的pH值为4后在避光条件下分批加入多糖聚合物质量3倍的高碘酸钠，在搅拌下于60℃反应4h后再加入过量的乙二醇继续反应30min；反应结束后，用冷乙醇沉淀出产物，用水和乙醇混合物充分洗涤至无碘检出；最后，经室温真空干燥得到水溶性醛基化多糖透明质酸；

[0060] 2)壳聚糖-β-磷酸三钙浆料制备

[0061] 在搅拌条件下，将脱乙酰度为90％、分子量为30万的壳聚糖溶于体积分数为2％的乙酸水溶液中形成质量百分比浓度为3％的壳聚糖溶液，然后向其中加入壳聚糖质量24％的生物活性亚微米级β-磷酸三钙，经行星式球磨机球磨后得到稳定的壳聚糖-β-磷酸三钙浆料；

[0062] 3)希夫碱交联过程

[0063] 将步骤1)中得到的水溶性醛基化多糖透明质酸溶于蒸馏水中制成质量百分比浓度为6％的水溶性醛基化多糖透明质酸溶液，在1500转/分剧烈搅拌下以50μl/min的速度将水溶性醛基化多糖透明质酸溶液滴加至步骤2)的壳聚糖-β-磷酸三钙浆料中，控制水溶性醛基化多糖透明质酸与壳聚糖的质量比为8∶100，滴加结束后继续搅拌20min，然后将其注入24孔培养板中，于-0.05MPa环境中静置12小时，以彻底脱泡和使交联反应充分，得到凝胶状试样；

[0064] 4)冷冻-干燥

[0065] 将步骤3)制成的凝胶状试样置于冷冻干燥机中，以-50℃/10h、-40℃/8h、-30℃/8h、-20℃/12h、-10℃/12h和5℃/8h冻干工艺进行冷冻-干燥，从24孔培养板中脱模即得到初步多孔支架；

[0066] 5)后处理

[0067] 先用质量百分比浓度为2％的氢氧化钠的乙醇溶液浸泡得到的初步多孔支架以中和其中的乙酸，接着用体积比为3∶7的蒸馏水∶乙醇混合溶液对初步多孔支架进行清洗，使混合溶液pH为7，再用纯蒸馏水洗两次后进行冷冻-干燥得到壳聚糖/β-磷酸三钙复合多孔支架。见图4。

[0068] 细胞培养

[0069] 将壳聚糖/β-磷酸三钙复合多孔支架加成厚度为3mm、直径为4mm的圆片，经75％(v/v)的乙醇和紫外线照射对进行灭菌处理后，置于96孔板内，用DMEM培养液浸泡
4
4h，去除培养液后在每孔中种植5×10 个人成骨样细胞MG-63细胞，置于37℃、饱和湿度、
5％CO2的培养箱内孵育8h，待细胞贴壁后补加培养基，继续进行培养。每天更换新鲜培养液。培养3天后，去除培养液，用磷酸盐缓冲液淋洗后用2.5％(v/v)戊二醛固定1h，再用梯度浓度酒精进行脱水处理，室温真空干燥两天或冻干，用于电镜观察。见图6。

[0070] 实施例3：壳聚糖/α-磷酸三钙复合多孔支架制备

[0071] 1)水溶性醛基化多糖海藻酸的合成

[0072] 首先将水溶性多糖聚合物海藻酸钠溶于水中形成质量百分比浓度为6％的多糖聚合物溶液，然后用5mol/L的硫酸调节多糖聚合物溶液的pH值为1后在避光条件下分批加入多糖聚合物质量4倍的高碘酸钠，在搅拌下于50℃反应5h后再加入过量的乙二醇继续反应30min；反应结束后，用冷乙醇沉淀出产物，用水和乙醇混合物充分洗涤至无碘检出；最后，经室温真空干燥得到水溶性醛基化多糖海藻酸；

[0073] 2)壳聚糖-α-磷酸三钙浆料制备

[0074] 在搅拌条件下，将脱乙酰度为90％、分子量为40万的壳聚糖溶于体积分数为2％的乙酸水溶液中形成质量百分比浓度为2％的壳聚糖溶液，然后向其中加入壳聚糖质量30％的生物活性亚微米级α-磷酸三钙，经行星式球磨机球磨后得到稳定的壳聚糖-α-磷酸三钙浆料；

[0075] 3)希夫碱交联过程

[0076] 将步骤1)中得到的水溶性醛基化多糖海藻酸溶于蒸馏水中制成质量百分比浓度为5％的水溶性醛基化多糖海藻酸溶液，在1200转/分剧烈搅拌下以30μl/min的速度将水溶性醛基化多糖海藻酸溶液滴加至步骤2)的壳聚糖-α-磷酸三钙浆料中，控制水溶性醛基化多糖海藻酸与壳聚糖的质量比为3∶100，滴加结束后继续搅拌10min，然后将其注入24孔培养板中，于-0.03MPa环境中静置12小时，以彻底脱泡和使交联反应充分，得到凝胶状试样；

[0077] 4)冷冻-干燥

[0078] 将步骤3)制成的凝胶状试样置于冷冻干燥机中，以-50℃/10h、-40℃/8h、-30℃/8h、-20℃/12h、-10℃/12h和5℃/8h冻干工艺进行冷冻-干燥，从24孔培养板中脱模即得到初步多孔支架；

[0079] 5)后处理

[0080] 先用质量百分比浓度为2％的氢氧化钠的乙醇溶液浸泡得到的初步多孔支架以中和其中的乙酸，接着用体积比为4∶6的蒸馏水∶乙醇混合溶液对初步多孔支架进行清洗，使混合溶液pH为7，再用纯蒸馏水洗两次后进行冷冻-干燥得到生物活性壳聚糖/α-磷酸三钙复合多孔支架。

[0081] 细胞培养方法同实施例1。

[0082] 实施例4：壳聚糖/45S5玻璃复合多孔支架制备

[0083] 1)水溶性醛基化右旋糖酐的合成

[0084] 首先将水溶性多糖聚合物右旋糖酐溶于水中形成质量百分比浓度为10％的多糖聚合物溶液，然后用5mol/L的硫酸调节多糖聚合物溶液的pH值为3后在避光条件下分批加入多糖聚合物质量2倍的高碘酸钠，在搅拌下于45℃反应3h后再加入过量的乙二醇继续反应30min；反应结束后，用冷乙醇沉淀出产物，用水和乙醇混合物充分洗涤至无碘检出；最后，经室温真空干燥得到水溶性醛基化右旋糖酐；

[0085] 2)壳聚糖-45S5玻璃浆料制备

[0086] 在搅拌条件下，将脱乙酰度为65％、分子量为50万的壳聚糖溶于体积分数为2％的乙酸水溶液中形成质量百分比浓度为1％的壳聚糖溶液，然后向其中加入壳聚糖质量40％的生物活性微米45S5玻璃粉，经行星式球磨机球磨后得到稳定的壳聚糖-45S5玻璃浆料；

[0087] 3)希夫碱交联过程

[0088] 将步骤1)中得到的水溶性醛基化右旋糖酐溶于蒸馏水中制成质量百分比浓度为2％的水溶性醛基化右旋糖酐溶液，在1700转/分剧烈搅拌下以200μl/min的速度将水溶性醛基化右旋糖酐溶液滴加至步骤2)的壳聚糖-45S5玻璃浆料中，控制水溶性醛基化右旋糖酐与壳聚糖的质量比为10∶100，滴加结束后继续搅拌30min，然后将其注入24孔培养板中，于-0.06MPa环境中静置12小时，以彻底脱泡和使交联反应充分，得到凝胶状试样；

[0089] 4)冷冻-干燥

[0090] 将步骤3)制成的凝胶状试样置于冷冻干燥机中，以-50℃/10h、-40℃/8h、-30℃/8h、-20℃/12h、-10℃/12h和5℃/8h冻干工艺进行冷冻-干燥，从24孔培养板中脱模即得到初步多孔支架；

[0091] 5)后处理

[0092] 先用质量百分比浓度为2％的氢氧化钠的乙醇溶液浸泡得到的初步多孔支架以中和其中的乙酸，接着用体积比为1∶6的蒸馏水∶乙醇混合溶液对初步多孔支架进行清洗，使混合溶液pH为7，再用纯蒸馏水洗两次后进行冷冻-干燥得到生物活性壳聚糖/45S5玻璃复合多孔支架。

[0093] 细胞培养过程同实施例1。

[0094] 实施例5：壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合多孔支架制备

[0095] 1)水溶性醛基化硫酸软骨素的合成

[0096] 首先将水溶性多糖聚合物硫酸软骨素溶于水中形成质量百分比浓度为25％的多糖聚合物溶液，然后用5mol/L的硫酸调节多糖聚合物溶液的pH值为2后在避光条件下分批加入多糖聚合物质量1倍的高碘酸钠，在搅拌下于35℃反应8h后再加入过量的乙二醇继续反应30min；反应结束后，用冷乙醇沉淀出产物，用水和乙醇混合物充分洗涤至无碘检出；最后，经室温真空干燥得到水溶性醛基化硫酸软骨素；

[0097] 2)壳聚糖-羟基磷灰石浆料制备

[0098] 在搅拌条件下，将脱乙酰度为95％、分子量为10万的壳聚糖溶于体积分数为2％的乙酸水溶液中形成质量百分比浓度为3％的壳聚糖溶液，然后向其中加入壳聚糖质量5％的生物活性纳米羟基磷灰石，经行星式球磨机球磨后得到稳定的壳聚糖-羟基磷灰石浆料；

[0099] 3)希夫碱交联过程

[0100] 将步骤1)中得到的水溶性醛基化硫酸软骨素溶于蒸馏水中制成质量百分比浓度为8％的水溶性醛基化硫酸软骨素溶液，在1000转/分剧烈搅拌下以10μl/min的速度将水溶性醛基化硫酸软骨素溶液滴加至步骤2)的壳聚糖-羟基磷灰石浆料中，控制水溶性醛基化硫酸软骨素与壳聚糖的质量比为6∶100，滴加结束后继续搅拌25min，然后将其注入24孔培养板中，于-0.04MPa环境中静置12小时，以彻底脱泡和使交联反应充分，得到凝胶状试样；

[0101] 4)冷冻-干燥

[0102] 将步骤3)制成的凝胶状试样置于冷冻干燥机中，以-50℃/10h、-40℃/8h、-30℃/8h、-20℃/12h、-10℃/12h和5℃/8h冻干工艺进行冷冻-干燥，从24孔培养板中脱模即得到初步多孔支架；

[0103] 5)后处理

[0104] 先用质量百分比浓度为2％的氢氧化钠的乙醇溶液浸泡得到的初步多孔支架以中和其中的乙酸，接着用体积比为1∶9的蒸馏水∶乙醇混合溶液对初步多孔支架进行清洗，使混合溶液pH为7，再用纯蒸馏水洗两次后进行冷冻-干燥得到生物活性壳聚糖基多孔支架。

[0105] 本发明是一种生物活性壳聚糖基多孔支架和制备方法，以及在人成骨样细胞MG-63细胞培养方面的用途为例来描述的，但这种描述并不意味着对本发明构成限制。参照本发明多孔支架的描述、其他种类的细胞以及对实施例的等效改变，对本领域技术人员都是可以预料的。因此，这种简单改变均不脱离本发明限定的范围和精神本质。