表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90蛋白的重组酵母工程菌、其构建方法及应用

摘要

本发明公开了一种表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90蛋白的重组酵母工程菌株、其构建方法及应用。本发明的重组酵母工程菌株，其菌种保藏编号为：CGMCC 5046。对工程菌进行大规模诱导，Gp90蛋白表达量达到373mg/L的水平。经SDS-PAGE及Western blot检测证明表达的重组蛋白具有禽网状内皮组织增生病病毒天然蛋白的生物学活性和抗原性。将重组蛋白制成重组抗原疫苗，免疫SPF鸡，实验结果表明：该重组抗原疫苗能有效诱导机体产生特异性的体液免疫应答，使免疫鸡获得抗REV攻击的保护，并可有效阻止病毒在体内的增殖。

权利要求

1.表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90蛋白的重组酵母工程菌株，其特征在于所述菌株为重组巴斯德毕赤酵母（Pichia.pastoris）SMD1168工程菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC 5046。

2.构建权利要求1所述的重组酵母工程菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）Gp90基因的扩增

以禽网状内皮组织增生病病毒REV/HLJR0901的基因组为模板，GenBank登录号为GQ415646，设计特异性扩增引物，扩增出Gp90基因序列，如SEQ IDNO:1所示；所述的HLJR0901株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC 5015；

（2）将扩增出的片段插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建成重组质粒pPIC9k-Gp90，电转化巴斯德毕赤酵母SMD1168感受态细胞，抗生素筛选，PCR鉴定，得到重组酵母菌株；

（3）对重组酵母菌株进行诱导表达，筛选得到稳定表达的高表达菌株，并将其驯化为工程菌株，即得。

3.权利要求1所述的重组酵母工程菌株在表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90重组蛋白中的应用。

4.由权利要求1所述的重组酵母基因工程菌株表达的禽网状内皮组织增生病病毒Gp90重组蛋白。

5.权利要求4所述的重组蛋白在制备预防禽网状内皮组织增生病疫苗药物中的应用。

6.一种预防禽网状内皮组织增生病的重组抗原疫苗，其特征在于包含有效剂量的权利要求4所述的重组蛋白和药学上可接受的载体。

7.权利要求6所述的重组抗原疫苗在制备预防禽网状内皮组织增生病药物中的应用。

8.一种使用权利要求1所述的重组酵母工程菌株发酵的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）取权利要求1所述的重组酵母工程菌株1ml接种于50ml MGY培养基中，

30℃300rpm培养至OD600为2-6时，接入发酵罐中，用基础盐培养基进行发酵培养；

（2）转速级联到溶氧控制上，维持溶氧40%，温度30℃，pH 6.0，培养20-24h，待溶氧升高，转速下降时补加50%甘油，补加速度为15ml/L·h，补加4个小时，随后进入甲醇诱导期，开始甲醇补量为3.5ml/L·h，此阶段持续2~5h，随后根据发酵情况适度增加甲醇补量；

（3）发酵72小时后收获上清，进行SDS-PAGE和Western blot分析，并进行蛋白浓度测定；

其中，所述的基础盐培养基按照以下方法配制：26.7mL 85%H3PO4，0.93gCaSO4·2H2O，

18.2g K2SO4，14.9g MgSO4·7H2O，4.13g KOH，40g甘油溶解于去离子水中，定容至1L；高压灭菌后，pH为1~1.5，温度降到30℃后，用30%NH4OH调pH至5.0。

说明书

表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90蛋白的重组酵母工

程菌、其构建方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种利用基因工程技术构建的重组酵母基因工程菌株，特别涉及一种表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90蛋白的重组酵母工程菌，还涉及其构建方法，进一步涉及所表达的重组蛋白及其在研制新型抗禽网状内皮组织增生病病毒的重组抗原疫苗中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

[0002] 禽 网 状 内 皮 组 织 增 生 病 是 由 禽 网 状 内 皮 组 织 增 生 病 病 毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)感染引起的，能够导致鸡体免疫抑制的一种重要的病毒病，严重危害着世界的养鸡业。随着该病近年来呈现的新的变化，如发病日龄升高，感染发病后死亡率升高，混合感染和继发感染严重等，使得对该病的防治越来越棘手，但传统疫苗生产难度大，病毒弱化困难，而且致弱的病毒很容易返强，使其很难在生产中安全应用。

[0003] REV基因组编码Gag、Pol和Env三种蛋白，囊膜蛋白env进一步分为Gp90和Gp20两种蛋白，其中Gp90蛋白在病毒刺激机体产生中和抗体方面具有重要作用，人们利用大肠杆菌原核表达系统及杆状病毒等真核表达系统对Gp90基因均进行了体外表达，但是由于表达产物或者不能刺激机体产生中和抗体，或者蛋白表达量低，要产生高滴度抗体需要多次加强免疫，因此，从经济的角度考虑，不适合用于大规模商业化生产。

[0004] 本项目所利用的甲醇酵母具有表达产物活性高，生产规模容易放大，成本低廉等特点，使得利用该系统开发禽网状内皮组织增生病亚单位疫苗具有很好应用前景。本申请所应用的疫苗具有上述价廉，生物活性好等优点，能够为防制当前流行的禽网状内皮组织增生病提供确实、有效的工具和手段，并可为防制禽类免疫抑制病提供有效的参考和经验。由于新型疫苗相对于传统疫苗具有更低的成本，这将为该疫苗的应用创造了一个很好的条件，投入应用后既能有效的防止疫病造成的损失，同时也降低了养殖成本。该疫苗的研制将创造更大的经济效益和社会效益。

发明内容

[0005] 针对上述问题，本发明所解决的第一个技术问题是提供一种表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90蛋白的重组酵母工程菌株，其特征在于所述菌株为重组巴斯德毕赤酵母(Pichia.pastoris)SMD1168工程菌株，该菌株(pPIC9KrREVgp90/SMD1168)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC 5046，保藏日期为2011年7月8日；

[0006] 本发明所解决的第二个技术问题是提供一种构建以上所述的重组酵母工程菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：

[0007] (1)Gp90基因的扩增

[0008] 以禽网状内皮组织增生病病毒REV/HLJR0901的基因组为模板，GenBank登录号为GQ415646，设计特异性扩增引物，扩增出Gp90基因序列，如SEQ IDNO：1所示；所述的HLJR0901株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC 5015，保藏日期为2011年7月8日；

[0009] (2)将扩增出的片段插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建成重组质粒pPIC9k-Gp90，电转化酵母SMD1168感受态细胞，抗生素筛选，PCR鉴定，得到重组酵母菌株；

[0010] (3)对重组酵母菌株进行诱导表达，筛选得到稳定表达的高表达菌株，并将其驯化为工程菌株，即得。

[0011] 其中所述的引物序列可为：

[0012] Gp90F：5’AGCTACGTAATGGACTGTCTCACC 3’

[0013] Gp90R：5’AGAGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCTTATGACGCCCAGC3’

[0014] 本发明所解决的第三个技术问题是提供所述的重组酵母工程菌株在表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90重组蛋白中的应用。

[0015] 本发明所解决的第四个技术问题是提供一种由所述的重组酵母基因工程菌株表达的禽网状内皮组织增生病病毒Gp90重组蛋白；及所述的重组蛋白在制备预防禽网状内皮组织增生病疫苗药物中的应用。

[0016] 本发明所解决的第五个技术问题是提供一种预防禽网状内皮组织增生病的重组抗原疫苗，其特征在于包含有效剂量的本发明所述的重组酵母基因工程菌株表达的重组蛋白和药学上可接受的载体以及所述的重组抗原疫苗在制备预防禽网状内皮组织增生病药物中的应用。

[0017] 本发明所解决的第六个技术问题是提供了一种使用本发明所述的重组酵母菌株进行发酵的方法，其特征在于包括以下步骤：

[0018] (1)取以上所述的重组酵母工程菌株1ml接种于50ml MGY培养基中，30℃300rpm培养至OD600为2-6时，接入发酵罐中，用基础盐培养基进行发酵培养；

[0019] (2)转速级联到溶氧控制上，维持溶氧40％，温度30℃，pH 6.0，培养20-24h，待溶氧升高，转速下降时补加50％甘油，补加速度为15ml/L·h，补加4个小时，随后进入甲醇诱导期，开始甲醇补量为3.5ml/L·h，此阶段持续2～5h，随后根据发酵情况适度增加甲醇补量；

[0020] (3)发酵72小时后收获上清，进行SDS-PAGE和Western blot分析，并进行蛋白浓度测定。

[0021] 其中，所述的基础盐培养基按照以下方法配制：26.7mL 85％H3PO4，0.93gCaSO4·2H2O，18.2g K2SO4，14.9g MgSO4·7H2O，4.13g KOH，40g甘油溶解于去离子水中，定容至1L；高压灭菌后，pH为1～1.5，温度降到30℃后，用30％NH4OH调pH至5.0。

[0022] MGY培养基按现有常规方法配制。

[0023] 转速级联到溶氧控制上，机器根据溶氧的高低自动调整转速，溶氧升高超过设定值，则转速下降，反之升高。

[0024] 所述的“根据发酵情况适度增加甲醇补量”是指以3.5mL/L·h甲醇补料速度调节甲醇补料泵泵速，此阶段持续2～5h，使酵母适应甲醇。酵母适应甲醇后DO(溶解氧)会升高，提高补料速度到5mL/L·h，持续2h，进行DO升高操作，DO升高操作在30s或更短的时间内完成，补料速度提高1mL/L·h，1h后进行DO升高操作，如果升高操作时间在30s内，则补料速度再继续提高1mL/L·h，如果升高操作时间超过35s，则补料速度维持不变，直至升高操作时间少于30s再继续提高补料速度。以后一个小时左右进行一次补料速度的调整，直至补料速度达到12mL/L·h。如果DO升高操作时间超过1min，则减少补料速度1～2mL/L·h。DO升高操作：关闭补料泵，DO升高，当升高超过设定值的10％，重新开启补料泵。

[0025] 对工程菌进行大规模诱导后发现，Gp90蛋白表达量达到373mg/L的水平。经SDS-PAGE及Western blot检测证明表达的重组蛋白具有禽网状内皮组织增生病病毒天然蛋白的生物学活性和抗原性。

[0026] 本实验将重组蛋白制成重组抗原疫苗，免疫SPF鸡实验结果表明：该禽网状内皮组织增生病重组抗原疫苗能有效诱导机体产生特异性的体液免疫应答，使免疫鸡获得抵抗REV攻击的保护，并可有效阻止病毒在体内的增殖。此疫苗的研制成功将会加速新型基因工程疫苗替代传统疫苗的步伐，并将为禽网状内皮组织增生病的防治带来新的技术手段。

附图说明

[0027] 图1为禽网状内皮组织增生病病毒Gp90基因与载体构建图谱；

[0028] 图2为pMD18T-Env载体构建酶切鉴定结果；

[0029] M：1kb DNA Marker(Fermentas)；1：pMD18T-env酶切结果；2：pMD18T载体酶切结果；

[0030] 图3为REV Gp90基因扩增图；

[0031] M：2000 DNA Marker；1：Gp90基因；2：阴性对照

[0032] 图4为pPIC9k-Gp90酶切鉴定结果；

[0033] M：DL15000 Marker；1：pPIC9k-Gp90；2：Gp90基因

[0034] 图5为酵母转化子的PCR鉴定；

[0035] M：2000 DNA markers；1：阴性对照；2：阳性对照

[0036] 图6为表达产物的SDS-PAGE分析；

[0037] M：蛋白分子量Marker；1：SMD1168/pPIC9k表达对照；

[0038] 2：SMD1168/REV-Gp90摇瓶诱导上清；3：SMD1168/REV-Gp90发酵上清

[0039] 图7为表达产物的Western blot分析；

[0040] M：蛋白分子量Marker；1：SMD1168/pPIC9k对照；

[0041] 2-3：SMD1168/pPIC9k-Gp90表达蛋白上清

[0042] 图8为抗体消长曲线；

[0043] 图9为抗体阳性率；

[0044] 图10为Real-time PCR检测结果；

[0045] 图11为免疫组化试验检测结果图。

具体实施方式

[0046] 下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

[0047] 实施例1重组酵母工程菌株的构建方法

[0048] 1材料和方法

[0049] 1.1质粒、菌株、细胞

[0050] pMD18T-Env重组质粒、REV Gp90单克隆抗体由本实验室保存。大肠杆菌感受态细胞DH10F’由本实验室制作。毕赤酵母菌种SMD1168和载体pPIC9K购自Invitrogen公司。HRP标记兔抗鼠IgG抗体、FITC标记的兔抗鼠二抗购买自Sigma公司。

[0051] 1.2试验试剂

[0052] ExTaq聚合酶，限制性内切酶SaLI、SnaBI、NotI、SacI，rTaq酶，Primestar HS DNA Polymerase，DNA Marker，T4 DNA连接酶，pMD18T载体均购自大连宝生物工程有限公司，核酸凝胶回收试剂盒购自Axygen公司，组织DNA提取试剂盒购自Omega公司。其他试剂为分析纯。

[0053] 1.3仪器设备

[0054] 低温高速离心机CS-15RCentrifuge(BECKMAN)、PCR仪(Takara PCR Thermal cycler)、2301型电泳仪(KLB)、Imagemaster R VDS凝胶扫描仪(Pharmacia Biotech)、倒置显微镜(Nikon TS100)、荧光显微镜(LEICAHC)、酶标仪Model-680(BIO-RAD)、二氧化碳培养箱(FORMA SCIENTIFIC)、生物安全柜(北京东联哈尔仪器制造有限公司)、BIO-RAD(Serial NO.411BR 3336)电转仪、空气浴振荡器HZQ-C(哈尔滨市东明医疗仪器厂)。

[0055] 1.4REV Gp90基因的克隆与表达

[0056] 1.4.1重组质粒pMD18T-Env的构建

[0057] 设计并合成特异性扩增Env基因的引物引物：

[0058] EnvF：5’-ACGGAATTCATGGACTGTCTCACCAACCTC-3’

[0059] EnvR：5’-TTTGTCGACTCATTGACCTAGGGTATCCAT-3’

[0060] 构建方法：

[0061] 取CEF原代细胞接毒REV-HLJR0901，7天后收毒，利用组织DNA提取试剂盒(Omega)提取基因组DNA。以该基因组DNA样品为模板，以envF和envR为上下游引物进行常规PCR，扩增得到env基因。PCR反应体系为25μL，其中含5μL 5×PS Buffer、2μL dNTP(2.5mmol/L)、envF和envR各1μL(10pmol/L)、Prime Star HS 1u，DNA模板1μL，用ddH2O补足25μL。反应条件：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR反应结束后，直接向上述反应体系中加入1μLrTaq酶，72℃10min加入polyA。用Axgen试剂盒回收PCR产物。取PCR产物连接pMD18T载体(TAKARA)，连接体系如下：5μL Solution 1，4μL PCR回收产物，1μL pMD18T载体，于16℃连接过夜。常法转化Top10F’感受态细胞，37℃温箱培养过夜。挑取单个菌落，37℃摇床培养10-12h后保存菌种，提取质粒，用EcoR1和Sal1进行酶切鉴定，并测序验证。

[0062] 1.4.2Gp90基因引物设计

[0063] 引物的设计与合成：根据本实验室已测定的REV/HLJR0901株的Gp90基因序列，利用Oligo6.0分子生物学软件分别设计扩增引物，同时在引物中引入相应的限制性酶切位点，引物由北京英俊生物有限公司合成，引物序列如下所示：

[0064] Gp90F：5’AGCTACGTAATGGACTGTCTCACC 3’

[0065] Gp90R：5’AGAGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCTTATGACGCCCAGC3’

[0066] 1.4.3Gp90基因各片段的获得

[0067] 以重组质粒pMD18T-env为模板，用Gp90特异性引物扩增Gp90基因。反应体系为：ddH2O 33.2μL、5×PS Buffer 10μL、dNTP Mixture 4μL、上、下游引物各1μL、Primestar HS DNA Polymerase 0.5μL、模板0.3μL。PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃30s，
55℃30s，72℃1.5min，35个循环；72℃延伸10min，反应结束后用琼脂糖凝胶试剂盒回收PCR产物，按说明书操作。

[0068] 1.4.4表达载体的构建

[0069] 将回收的PCR产物与载体pPIC9K分别用SnaBI和NotI双酶切，回收，凝胶回收操作按试剂盒说明书进行。将载体与外源片段以摩尔比1∶3的比例混合，用T4DNA连接酶于22℃连接过夜，然后转化E.coli DH10F’感受态细胞，提取质粒，以SnaBI和NotI双酶切及PCR进行鉴定，并测序确证(北京英俊)，鉴定阳性克隆，获得重组质粒pPIC9k-Gp90，禽网状内皮组织增生病病毒Gp90基因与载体构建图谱如图1所示。

[0070] 1.4.5酵母细胞的转化

[0071] 用限制性内切酶SacI对制备的重组表达质粒进行单酶切，酚-氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀回收后，与毕赤酵母SMD1168感受态细胞混合，用BIO-RAD(Serial NO.411BR3336)电转仪在参数为2.0kV、25μF、200Ω条件下进行电击，立即加入1ml预冷的1mol/L山梨醇，温浴后将内容物涂布于含100μg/mlG418抗性的YPDS平板，30℃培养3-7d。

[0072] 1.4.6重组酵母菌株的PCR筛选

[0073] 1.4.6.1重组酵母菌PCR鉴定引物的设计与合成

[0074] 根据目的基因插入两侧的表达载体核苷酸序列设计一对特异引物，并由上海博亚生物技术公司合成。引物序列为：

[0075] 5’AOX1引物：5’-gactggttccaattgagaagc-3’

[0076] 3’AOX1引物：5’-gcaaatggcattctgacatcc-3’

[0077] 1.4.6.2重组酵母基因组DNA的提取

[0078] 取少量转化菌单个菌落培养物置Ep管中，加100μL灭菌水，100℃煮沸10min以消解酵母菌细胞壁，液氮冰冻30min，100℃煮沸10min，12000r/min离心10min，取上清液，即为重组酵母基因组DNA。

[0079] 1.4.6.3PCR扩增鉴定

[0080] 以重组酵母基因组DNA为模板，用特异引物对整合到巴斯德毕赤酵母SMD1168染色体DNA中的Gp90基因进行PCR扩增，取5μL PCR扩增产物作1％琼脂糖凝胶电泳观察。PCR扩增反应体系：10×PCR Buffer 5.0μL、25mmol/LMgCl2 3.0μL、5’AOX1引物(20pmol/μL)0.5μL、3’AOX1引物(20pmol/μL)0.5μL、Tap酶0.5μL、dNTP(10mmol/L)1.0μL、基因组DNA模板5.0μL，以灭菌水补体积至50μL。扩增反应条件：94℃5min；94℃0.5min、
55℃0.5min、72℃2min，30个循环；72℃10min。

[0081] 1.4.7重组酵母菌株的小量诱导表达

[0082] 将PCR鉴定阳性的酵母转化子接种于50ml BMGY培养基中，30℃300rpm培养至OD600为2-6时，1500g离心5min收集菌体，换10ml BMMY培养基继续培养5d，每隔24h取样并同时加入0.5％的甲醇。甲醇诱导5d后收集上清，保存于-70℃备检，表达的重组蛋白其序列如SEQ ID NO.2所示。

[0083] 1.4.8重组酵母菌株的发酵

[0084] 取保存菌种1ml接种于50mlMGY培养基中，30℃300rpm培养至OD600为2-6时，接入发酵罐中，用基础盐培养基进行发酵培养。维持溶氧40％，温度30℃，pH6.0，培养20-24h，待溶氧升高，转速下降时补加50％甘油，补加速度为15ml/L·h，补加4个小时，随后进入甲醇诱导期，开始甲醇补量为3.5ml/L·h，此阶段持续2～5h，使酵母适应甲醇。酵母适应甲醇后DO会升高，提高补料速度到5mL/L·h，持续2h，进行DO升高操作，DO升高操作在30s或更短的时间内完成，补料速度提高1mL/L·h，1h后进行DO升高操作，如果升高操作时间在30s内，则补料速度再继续提高1mL/L·h，如果升高操作时间超过35s，则补料速度维持不变，直至升高操作时间少于30s再继续提高补料速度。以后一个小时左右进行一次补料速度的调整，直至补料速度达到12mL/L·h。如果DO升高操作时间超过1min，则减少补料速度1～2mL/L·h。

[0085] 随时观察罐内泡沫情况，泡沫过多需滴加无菌的消泡剂。发酵72后收获上清，进行SDS-PAGE和Western blot分析，并进行蛋白浓度测定。

[0086] 1.4.9重组蛋白的SDS-PAGE检测

[0087] 取等体积诱导上清与2×上样缓冲液混合，100℃煮沸10min，取10μL处理好的蛋白样品用10％分离胶进行SDS-PAGE分析。

[0088] 1.4.10重组蛋白的Westernblot检测

[0089] 目的蛋白电泳后，转至硝酸纤维素膜(NC)上，将膜封闭，加入1∶500稀释的REV Gp90单克隆抗体，轻轻摇动混匀，于37℃作用1h后，洗涤NC膜，将洗涤后的膜置于适量1∶5000稀释的HRP标记兔抗鼠IgG为二抗液中，室温作用37℃作用45min，洗涤NC膜3次，二氨基联苯胺(DAB)显色。

[0090] 1.4.11蛋白浓度的测定

[0091] 总蛋白浓度以BSA为标准品，用Bradford法进行测定，并进行薄层扫描，确定目的蛋白含量，进而换算得到目的蛋白浓度。

[0092] 1.5重组蛋白免疫原性的检测

[0093] 1.5.1免疫动物

[0094] 疫苗的制备：将发酵上清用PBS(PH7.4)分别稀释至5μg/0.3ml、10μg/0.3ml、20μg/0.3ml、40μg/0.3ml、80μg/0.3ml，与等体积法国佐剂((ISA50 V2)购自SEPPIC公司)乳化。

[0095] 取3周龄SPF鸡60只，分6组，每组10只。1、2、3、4、5组为表达蛋白免疫组：1组免疫剂量为5μg/0.3ml/只，2组免疫剂量为10μg/0.3ml/只，3组免疫剂量为20μg/0.3ml/只；4组免疫剂量为40μg/0.3ml/只；5组免疫剂量为80μg/0.3ml/只；6组为非免疫对照组，免疫途径均为肌肉注射，一免后3w进行二免。

[0096] 1.5.2REV抗体检测及攻毒试验

[0097] 各组免疫后每周采血，用REV抗体检测试剂盒(IDEXX公司)检测抗体滴度，并5
于二免后3周各组取5只以1×10TCID50剂量攻击REV/HLJR0901病毒(REV/HLJR0901病毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：
CGMCC 5015)，攻毒后观察7-10天，剖杀，采集血液、肝脏、脾脏、法氏囊及胸腺，提取DNA，用Real-time PCR方法检测血液中的病毒载量，并用免疫组化试验对肝脏、脾脏、法氏囊及胸腺中的病毒含量进行检测。各组余下的5只仍每周定期采血至第22周，检测抗体。试验在负压隔离器(澳大利亚进口)中进行。

[0098] 2结果

[0099] 2.1pMD18T-Env载体构建结果

[0100] 挑取单个菌落，37℃摇床培养10-12h后保存菌种，提取质粒，用EcoR1和Sal1进行酶切鉴定，并测序验证。酶切鉴定结果如图2所示。

[0101] 2.2REV Gp90基因的扩增

[0102] 以pMD18T-env为模板，用Gp90特异性引物进行PCR扩增后获得与预期大小一致的1191bp的DNA条带，结果如图3所示。

[0103] 2.3重组表达质粒的构建

[0104] PCR和双酶切鉴定均显示重组表达质粒pPIC9k-Gp90构建正确，测序结果证实目的片段Gp90及阅读框均正确。酶切鉴定结果如图4所示。

[0105] 2.4重组酵母菌株的PCR筛选

[0106] 以His+转化子的基因组DNA为模板，用酵母5’AOX1和3’AOX1通用引物PCR验证目的DNA与酵母基因组整合情况，结果有11个转化子能扩增出1.7kb的片段，说明重组菌株中整合了Rev Gp90基因，如图5所示。阴性转化子仅可以扩增得到AOX1基因(2.2kb)；阳性转化子可以扩增得到整合的Gp90(1.7kb)和AOX1基因(2.2kb)。

[0107] 2.5重组酵母菌株的诱导表达

[0108] 2.5.1表达产物的SDS-PAGE分析

[0109] 表达上清经10％SDS-PAGE分析，由图6所示，在90kDa处由明显目的蛋白条带，而阴性对照在此处没有条带，证明Gp90蛋白得到分泌表达。蛋白浓度测定表明，Gp90小量诱导表达量为65mg/L，发酵培养表达量为373mg/L。

[0110] 2.4.2表达产物的Western blot分析

[0111] 以制备的REV Gp90为一抗，对表达的REV Gp90蛋白进行Western blot(图7所示)分析，结果显示表达产物可以与Gp90单抗发生特异性反应，表明所表达的Gp90蛋白具有良好的反应活性。

[0112] 2.5表达产物免疫原性的检测

[0113] 2.5.1抗体滴度的检测

[0114] SPF鸡于3周龄一免，一免后3周二免，免疫剂量分为5、10、20、40、80μg/只，免疫后采血检测抗体滴度。由抗体消长曲线可知，免疫后1-5周为抗体滴度增长期，二免后2周抗体滴度快速升高，并于2-3周达到最高，分别为5μg：2186，10μg：2776，20μg：3851；40μg：4557；80μg：5435，阳转率为：80％，80％，100％，100％，100％。5-8周为高抗体滴度维持期，持续约4周，然后开始下降；9-12周为抗体滴度下降期，3-4周后下降趋势结束，抗体滴度进入维持阶段；13-18周为平台期，各剂量组抗体滴度维持在：5μg：1600，10μg：
2300，20μg：2800；40μg：3500；80μg：4200，阳转率为：50％，60％，80％，80％，80％。抗体消长曲线和抗体阳性率如图8、9所示。

[0115] 2.5.2攻毒保护试验

[0116] 二免后3周，对各试验组鸡腹腔注射REV(HLJR0901株)1×105TCID50，采集攻毒后7d、10d抗凝血，提取血液DNA，用Real time PCR检测血液中的病毒含量；于攻毒后10d剖杀，制作病理切片，利用免疫组化试验检测体内脏器中的病毒含量。Real-time PCR结果表
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明(图10所示)，与未免疫组(6.89×10copies/ml)相比，5μg和10μg免疫组血液中病
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毒载量有所降低，分别为7.21×10copies/ml血液和6.49×10copies/ml血液，但仍可检出；而20、40、80μg免疫组在血液中未检到病毒。免疫组化试验表明，未免疫组攻毒后法氏囊、肝脏、脾脏、胸腺中均有大量阳性信号；5-10μg免疫组仅有少量阳性信号；20-80μg免疫组未见明显阳性信号。其结果与病毒载量检测结果相符，结果如图11所示。

[0117] 以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。