气单胞菌及在(R)-α-羟基苯乙酸生物转化中的应用，涉及(R)-α-羟基苯乙酸。提供一种豚鼠气单胞菌Aeromonas caviaeB18及其在(R)-α-羟基苯乙酸生物转化中的应用。豚鼠气单胞菌Aeromonas caviaeB18是以苯乙酮酸为底物，经初筛、诱变及分离纯化获得，该菌株能选择性转化(R)-α-羟基苯乙酸。将豚鼠气单胞菌接入转化培养基中，加底物苯乙酮酸，催化底物苯乙酮酸中羰基的不对称还原，然后从发酵液中分离纯化反应产物(R)-α-羟基苯乙酸。利用提供的菌株转化(R)-α-羟基苯乙酸专一性强、产率高、工艺操作简单、成本低廉、目标产物容易分离。
1.豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18，其特征在于所述豚鼠气单胞菌Aeromonas caviaeB18已于2010年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该中心登记入册编号为CGMCC No.4382；
所述豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18的16S rRNA的序列如下所示：
cgcctgcagt cgagcggcag cgggaaagta gcttgctact tttgccggcg agcggcggac 60gggtgagtaa tgcctgggaa attgcccagt cgagggggat aacagttgga aacgactgct 120aataccgcat acgccctacg ggggaaagca ggggaccttc gggccttgcg cgattggata 180tgcccaggtg ggattagcta gttggtgagg taatggctca ccaaggcgac gatccctagc 240tggtctgaga ggatgatcag ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag 300gcagcagtgg ggaatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagccatgc cgcgtgtgtg 360aagaaggcct tcgggttgta aagcactttc agcgaggagg aaaggtcagt agctaatatc 420tgctgactgt gacgttactc gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg 480taatacggag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac gcaggcggtt 540ggataagtta gatgtgaaag ccccgggctc aacctgggaa ttgcatttaa aactgtccag 600ctagagtctt gtagaggggg gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg 660gaggaatacc ggtggcgaag gcggccccct ggacaaagac tgacgctcag gtgcgaaagc 720gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcgatttgg 780aggctgtgtc cttgagacgt ggcttccgga gctaacgcgt taaatcgacc gcctggggag 840tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat 900gtggtttaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggcc ttgacatgtc tggaatcctg 960tagagatacg ggagtgcctt cgggaatcag aacacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct 1020cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccctgtcc tttgttgcca 1080gcacgtaatg gtgggaactc aagggagact gccggtgata aaccggagga aggtggggat 1140gacgtcaagt catcatggcc cttacggcca gggctacaca cgtgctacaa tggcgcgtac 1200agagggctgc aagctagcga tagtgagcga atcccaaaaa gcgcgtcgta gtccggattg 1260gagtctgcaa ctcgactcca tgaagtcgga atcgctagta atcgcaaatc agaatgttgc 1320ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tgggttgcac 1380cagaagtaga tagcttaacc ttcggagggc gtact 1415。
2.如权利要求1所述豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18在制备(R)-α-羟基苯乙酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述制备(R)-α-羟基苯乙酸的方法为：将豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18接入转化培养基中，加入底物苯乙酮酸，催化底物苯乙酮酸中羰基的不对称还原，然后从发酵液中分离纯化反应产物(R)-α-羟基苯乙酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化培养基中，细胞浓度湿重为75～
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18的接种量按体积比4%的接种量转接至转化培养基。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述不对称还原的条件为转化培养基的温度30～36℃，摇床转速200r/min，反应时间为19h，转化培养基pH7.2，离心除去菌体，得(R)-α-羟基苯乙酸发酵液，调节pH为1.0，乙酸乙酯萃取，经微波真空干燥得(R)-α-羟基苯乙酸。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述转化培养基的温度为32℃。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述微波真空干燥的条件为微波功率5kW，干燥温度为45℃，真空度为-0.08MPa，干燥时间为1h。
气单胞菌及在(R)-α-羟基苯乙酸生物转化中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及(R)-α-羟基苯乙酸，尤其是涉及一种豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18及其在(R)-α-羟基苯乙酸生物不对称转化中的应用。
背景技术
[0002] (R)-α-羟基苯乙酸是一种重要的药物中间体，广泛地应用于多种药物的合成，如青霉素、头孢菌素、抗肥胖药物、抗肿瘤制剂、光学纯的氨基酸、辅酶A、血管紧张肽转化酶抑制剂等，还可以用来制成手性拆分试剂。目前，国际市场上光学活性的α-羟基苯乙酸需求量约以年均10%以上的速度增长，已成为重要的药物与精细化工中间体。
[0003] 辛梅华（辛梅华，分析化学，2001,29(8):990）报道了色谱柱直接拆分制备α-羟基苯乙酸的方法，该方法具有简便、快速、产品纯度高等优点，但需采用手性分离介质，并且处理量小、成本高，仅限于检测及实验室制备。
[0004] Tanaka K（Tanaka K,.J Chem Research,2002(9):446-447）利用手性拆分剂麻黄碱、二-甲基节胺、辛可宁以及苯甘氨酸丁酯等与α-羟基苯乙酸的两种对映体形成非对映体盐类增加物理性质差异，然后结晶分离。但该法不仅存在产率低、手性拆分剂价格昂贵等缺点，而且拆分后的S对映体无法利用，对环境将造成较大的污染。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18。
[0006] 本发明的另一目的是提供豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18在(R)-α-羟基苯乙酸生物转化中的应用。
[0007] 所述豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18已于2010年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该中心登记入册编号为CGMCC No.4382。
[0008] 所述豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18是以苯乙酮酸为底物，经初筛、诱变及分离纯化获得，该菌株能选择性转化(R)-α-羟基苯乙酸。
[0009] 所述豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18的16S rRNA的序列如下所示：
[0010] cgcctgcagt cgagcggcag cgggaaagta gcttgctact tttgccggcg agcggcggac 60[0011] gggtgagtaa tgcctgggaa attgcccagt cgagggggat aacagttgga aacgactgct 120[0012] aataccgcat acgccctacg ggggaaagca ggggaccttc gggccttgcg cgattggata 180[0013] tgcccaggtg ggattagcta gttggtgagg taatggctca ccaaggcgac gatccctagc 240[0014] tggtctgaga ggatgatcag ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag 300[0015] gcagcagtgg ggaatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagccatgc cgcgtgtgtg 360[0016] aagaaggcct tcgggttgta aagcactttc agcgaggagg aaaggtcagt agctaatatc 420[0017] tgctgactgt gacgttactc gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg 480[0018] taatacggag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac gcaggcggtt 540[0019] ggataagtta gatgtgaaag ccccgggctc aacctgggaa ttgcatttaa aactgtccag 600[0020] ctagagtctt gtagaggggg gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg 660[0021] gaggaatacc ggtggcgaag gcggccccct ggacaaagac tgacgctcag gtgcgaaagc 720[0022] gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcgatttgg 780[0023] aggctgtgtc cttgagacgt ggcttccgga gctaacgcgt taaatcgacc gcctggggag 840[0024] tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat 900[0025] gtggtttaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggcc ttgacatgtc tggaatcctg 960[0026] tagagatacg ggagtgcctt cgggaatcag aacacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct 1020[0027] cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccctgtcc tttgttgcca 1080[0028] gcacgtaatg gtgggaactc aagggagact gccggtgata aaccggagga aggtggggat 1140[0029] gacgtcaagt catcatggcc cttacggcca gggctacaca cgtgctacaa tggcgcgtac 1200[0030] agagggctgc aagctagcga tagtgagcga atcccaaaaa gcgcgtcgta gtccggattg 1260[0031] gagtctgcaa ctcgactcca tgaagtcgga atcgctagta atcgcaaatc agaatgttgc 1320[0032] ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tgggttgcac 1380[0033] cagaagtaga tagcttaacc ttcggagggc gtact 1415[0034] 所述豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18在制备(R)-α-羟基苯乙酸中的应用。
[0035] 所述制备(R)-α-羟基苯乙酸的方法为：将豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18接入转化培养基中，加入底物苯乙酮酸，催化底物苯乙酮酸中羰基的不对称还原，然后从发酵液中分离纯化反应产物(R)-α-羟基苯乙酸；所述底物苯乙酮酸的浓度可为5～165mmol。
[0036] 所述转化培养基为：淀粉12.81g，酪蛋白胨12.74g，KH2PO42.97g，K2HPO41.2g，MgSO40.15g，CaCl20.125g，MnSO40.015g，ZnSO40.01g，定容至1L，pH7.2；所述转化培养基中，细胞浓度湿重可为75～100g/L。
[0037] 所述豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18的接种量可按体积比4%的接种量转接至转化培养基；所述不对称还原的条件可为将转化培养基于30～36℃，最好为32℃，摇床转速200r/min的条件下，反应时间为19h，转化培养基pH7.2，离心除去菌体，得(R)-α-羟基苯乙酸发酵液，调节pH为1.0，乙酸乙酯萃取，经微波真空干燥得(R)-α-羟基苯乙酸；所述微波真空干燥的条件可为微波功率5kW，干燥温度为45℃，真空度为-0.08MPa，干燥时间为1h。
[0038] 本发明的显著优点是：本发明所用的发酵工艺，不仅能获得高纯度的(R)-α-羟基苯乙酸，而且生产成本比现有的低廉，并且产物无需拆分，效率高、污染少，是一种具有广泛应用前景的生产方法，可以满足迅速发展的医药工业的需要。
具体实施方式
[0039] 该豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18在(R)-α-羟基苯乙酸不对称转化中的应用为制备(R)-α-羟基苯乙酸，所述制备方法步骤为将豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18按体积比4%的接种量转接至转化培养基，在转化培养基加底物苯乙酮酸，将转化培养基于30～36℃，摇床转速200r/min的条件下，反应时间为19h，转化培养基pH7.2，离心除去菌体，得(R)-α-羟基苯乙酸发酵液，调节pH为1，在微波功率5kW、干燥温度为45℃,真空度为-0.08MPa的条件下，经微波真空干燥1h得纯度为99.5%的(R)-α-羟基苯乙酸。
[0040] 其中(R)-α-羟基苯乙酸转化培养基的制备方法为：将淀粉12.81g，酪蛋白胨12.74g，KH2PO42.97g，K2HPO41.2g，MgSO40.15g，CaCl20.125g，MnSO40.015g，ZnSO40.01g，定容至1L，pH7.2。
[0041] 转化的最佳温度为32℃。
[0042] 转化培养基中，细胞浓度湿重为75～100g/L；底物苯乙酮酸浓度为5～165mmol。
[0043] 实施例
[0044] 菌株的筛选
[0045] 取池塘底泥1g悬浮于10mL无菌水中，进行梯度稀释，取0.2mL稀释液涂布于选择性平板（含培养基：KH2PO41g，NaCl1g,K2HPO41g，MgSO40.15g，CaCl20.125g，MnSO40.015g，ZnSO40.01g，底物苯乙酮酸5mM，自来水定容至1L，pH7.2）。在选择性平板中加入50U/mL制霉菌素,32℃培养2～3天，观察菌的生长情况，并将菌群划线分离。用无菌牙签挑取不同形态菌落，接入装有2mL发酵培养基（淀粉12.81g，酪蛋白胨12.74g，KH2PO42.97g，K2HPO41.2g，MgSO40.15g，CaCl20.125g，MnSO40.015g，ZnSO40.01g，pH7.2）的试管内，32℃，200r/min摇床条件下培养19h，加入底物苯乙酮酸5mM,转化20h，转化后的发酵液10000rpm离心10min，离心收集菌株豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18。
[0046] 豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18的16S rRNA的测定
[0047] 1）取1mL培养至对数生长期（约19h）的菌液于1.5mL Eppendorf（EP）管中，5000rpm冷冻离心5min，倒掉上清液，收集菌体.往沉淀的菌体中加入500μl的TE缓冲液，置于漩涡混合器上，使之重悬，离心洗涤，重复两遍，去除上清。
[0048] 2）加入500μl的溶菌酶(6mg·mL-1)重悬细胞，用剪掉尖头的枪头吹打混匀，于37℃水浴锅水浴30～60miN。
[0049] 3）加入25μl10%SDS充分混匀，于55℃水浴锅中保温30min，再加入5μl蛋白酶K充分摇匀，继续水浴1h。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混匀后室温放置5～10min，12000rpm离心10min。
[0050] 4）吸取上清液，再用等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提两次。
[0051] 5）吸取上清液，加入1/5体积的NaAc缓冲液(pH5.2)，轻轻摇匀，再加入等体积的异丙醇于-20℃冰箱中放置15～20min以沉淀DNA，10000rpm离心2min后去上清。
[0052] 6）沉淀用70%的乙醇洗涤两次后空气晾干以除去乙醇。最后将沉淀溶解于50μl含500μg/mL RNaseA的TE buffer中，于4℃温度下置过夜后，置于-20℃保存备用。
[0053] 7）使用上海生工生物工程有限公司的DNA基因组提纯试剂盒提取该转化菌株基因组DNA。16S rRNA基因序列的PCR反应，以细菌基因组DNA为模板，选择细菌16S rRNA基因特异性引物，上游引物27F:5′-AGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物1492R:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′，使用大连宝生生物工程公司的TaKaRa PCR相关试剂，根据产品说明设置反应条件为：50mmol/LMgCl2、200μmol/LdNTP、正反引物各500pmol/L、2.5μTaq polymerase,94℃变性5min后进入循环，94℃1min→55℃40s→72℃1min，共
30个循环，最后72℃延伸10min。PCR仪为ABI公司的2720型。使用TaKaRa garose Gel DNAPurification Kit切胶回收试剂盒对PCR产物进行回收。16S rRNA基因序列测定采用ABI公司3730XL型DNA测序仪。以Forward Primer/Reverse Primer为引物，扩增获得分子量约为1415bp的单一DNA片段。将该序列提交NCBI进行同源性比对，与气单胞菌属（Aeromonas caviae）的16S rRNA序列的同源性达到97%。确定所筛选的菌株属于Aeromonas caviae。因此将菌株命名为豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae B18。
[0054] (R)-α-羟基苯乙酸的手性生物转化
[0055] 斜面各菌株分别接到各自的液体培养基中（酪蛋白胨10g，牛肉膏5g，麦芽糖10g，NaCl2g，定容至1L，pH7.2），摇瓶培养至对数生长期。移取1%V/V种子液，置于50mL的转化培养基中，在32℃，200r/min条件下振荡培养10h至较高菌浓(OD600约为1.0)后，加入1mM的苯乙酮酸作为诱导物，继续培养5h。以该培养液为种子培养液，按4％接种量接种至
300mL的转化培养基（淀粉12.81g，酪蛋白胨12.74g，KH2PO42.97g，K2HPO41.2g，MgSO40.15g，CaCl20.125g，MnSO40.015g，ZnSO40.01g，定容至1L，pH7.2）。在32℃，200r/min条件下振荡培养19h。底物苯乙酮酸采用间歇流加补料，浓度维持在100mmol/L左右。产物(R)-α-羟基苯乙酸采用反相离子对高效液相色谱法测定，其中流动相为甲醇-25mmol/L磷酸缓冲液(内含5mmol/L庚烷磺酸钠，pH7.0)(20∶80,V/V)，检测波长：220nm，流速：1mL/min，柱温：
室温，进样量：20μl。产物(R)-α-羟基苯乙酸的光学纯度（e.e）采用毛细管电泳分析。电泳条件为：缓冲液为含150g/L羟丙基-β-环糊精的100mmol/L Tris磷酸溶液(pH7.6)，分
3
离电压20kV；分离柱温20℃；进样压力3.0×10Pa，进样时间10sec；紫外检测波长214nm。
标准样品用超纯水配制（Milli.-QII型超纯水系统）。毛细管预处理为：每次使用前分别用
4 4
超纯水(13.78×10Pa)淋洗5min、0.1mol/L NaOH（6.89×10Pa）淋洗5min、超纯水淋洗
5min。每次进样前用超纯水和缓冲液各淋洗3min。
[0056] 反应结束之后，将发酵液离心(12000rpm，10min)除去细胞，收集上清液250mL，用浓硫酸调节pH至1.0，再用入乙酸乙酯萃取，合并萃取液，接着用无水硫酸钠干燥，最后在微波功率5kW、干燥温度为45℃，真空度为-0.08MPa的条件下，经微波真空干燥1h获得纯度为99.5%的R)-α-羟基苯乙酸，产物(R)-α-羟基苯乙酸得率为49%。
