本发明公开了一种从葱白中提取葱酶的方法，它是将葱白在-4℃至4℃冷却后，加入提取液在-4℃至4℃均浆后，过滤，在0℃至5℃分离得第一固相和第一液相；在0℃至5℃下，向第一液相中加入第一液相质量的15％～30％聚乙二醇，静置，0℃至5℃离心，得到第二固相和第二液相；将第二固相用pH6～pH6.8的磷酸盐缓冲液溶解，经透析后冷冻干燥便可得到葱酶。提取得到的葱酶经过SDS-PAGE分析得到的图谱显示，该葱酶为混合物，其中浓度较高的成分主要集中在相对分子量40～55kDa之间。本发明葱白中酶的方法操作简便易行工艺质量稳定。
1.从葱白中提取葱酶的方法，它是将葱白在-4℃至4℃冷却后，加入提取液在-4℃至
4℃均浆后，过滤，在0℃至5℃分离得第一固相和第一液相；在0℃至5℃下，向第一液相中加入第一液相质量的15%～30%聚乙二醇，静置，0℃至5℃离心，得到第二固相和第二液相；将第二固相用pH6～pH6.8的磷酸盐缓冲液溶解，经透析后冷冻干燥便可得到葱酶；所述提取液由pH6～pH6.8的磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液体积9％～12％的甘油， 1～4克／千毫升磷酸盐缓冲液的乙二胺四乙酸二钠和0.002～0.01 克／千毫升磷酸盐缓冲液的5’-磷酸吡哆醛组成；所述加入提取液在-4℃至4℃均浆是：先将pH6～pH6.8的磷酸盐缓冲液、甘油，乙二胺四乙酸二钠与葱白混合，在-4℃至4℃冷却不少于5小时后，再加入
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述磷酸盐缓冲液是Na2HPO4和KH 2PO4的混合液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是所述Na2HPO4和KH2PO4的磷酸盐缓冲液中：1000毫升磷酸盐缓冲液含7～12克Na2HPO4、含3～8克KH2PO4。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述透析的温度为-4℃至4℃，使用的透析袋截留分子量为8000-14000。
（1）将新鲜小葱洗去杂质，除去葱皮，剪取葱白，葱白在-4℃至4℃的温度下均浆，均浆时间为5小时至24小时；
（2）在冷却的葱白加入pH6～pH6.8的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液，及磷酸盐缓冲液体积9％～12％的甘油， 1～4克／千毫升磷酸盐缓冲液的乙二胺四乙酸二钠混合，-4℃至4℃预冷5小时至24小时，再加入0.002～0.01 克／千毫升磷酸盐缓冲液的5’-磷酸吡哆醛；在-4℃至4℃匀浆后；0℃至5℃离心，得到第一固相和第一液相；
（3）在第一液相中加入第一液相质量的15%～30%聚乙二醇，搅拌后静置；0℃至5℃离心，得到第二固相和第二液相；
（4）将第二固相用pH6～pH6.8的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液溶解后；使用的透析袋截留分子量为8000-14000；透析 操作的温度为-4℃至4℃； （5）将步骤（4）透析后的溶液在低于-45℃～-30℃温度冷冻后，升华，升华最高温度＜35℃；得到葱酶。
6.如权利要求5所述的方法，其特征是：步骤（4）中：透析过程中更换pH6～pH6.8的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液。
7.如权利要求1或5所述的方法，其特征是所述聚乙二醇采用聚乙二醇8000。
从葱白中提取葱酶的方法
技术领域
[0001] 本发明属于葱白提取物的方法，具体涉及一种从葱白中提取葱酶的方法。
背景技术
[0002] 葱白是百合科(Liliaceae)植物分葱Allium fistulosum L.var.caespitosum Makino.的鳞茎。药理学研究表明，葱白中所含的化学成分主要是有机含硫化合物和不饱和脂肪酸。葱白提取物能够明显改善冠心病心绞痛患者心绞痛发作的次数和程度，具有良好的扩张冠状动脉，改善心肌缺血作用；降血脂和胆固醇，抗氧化损伤、保护血管内皮，抗动脉粥样硬化的作用；具有明显的抗氧化损伤，抑制血管平滑肌细胞增生，保护内皮细胞，减轻球囊损伤后再狭窄的功效，葱白提取物中有效物质的其作用机理尚不得而知。
[0003] 葱白中存在着一种酶，和其相应有机硫化物底物，当葱白细胞破碎的条件下，二者即结合，反应生成丙酮酸和硫代亚磺酸酯类物质。硫代亚磺酸酯类化合物是葱属众多植物中含硫化合物的前体物质，也是该属物质中众多生物活性的关键物质。该物质非常不稳定，很容易分解为各种含硫化合物。因此对葱白生物活性的研究及开发利用过程中，对含硫化合物的前体物质的研究则成了关键之一，所以对其起重要作用的酶的研究具有重要的意义。而如何从葱白提取得到葱酶上没有任何文献报道。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种从葱白中提取葱酶的方法，以解决上述问题。
[0005] 本发明的技术方案是：从葱白中提取葱酶的方法，它是将葱白在-4℃至4℃冷却后，加入提取液在-4℃至4℃均浆后，过滤，在0℃至5℃分离得第一固相和第一液相；在0℃至5℃下，向第一液相中加入第一液相质量的15％～30％聚乙二醇，静置，0℃至5℃离心，得到第二固相和第二液相；将第二固相用pH6～pH6.8的磷酸盐缓冲液溶解，经透析后冷冻干燥便可得到葱酶；所述提取液由pH6～pH6.8的磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲液体积
9％～12％的甘油，1～4克/千毫升磷酸盐缓冲液的乙二胺四乙酸二钠和0.002～0.01克/千毫升磷酸盐缓冲液的5’-磷酸吡哆醛和/或磷酸吡哆醛组成。
[0006] 所述加入提取液在-4℃至4℃均浆是：先将pH6～pH6.8的磷酸盐缓冲液、甘油，乙二胺四乙酸二钠与葱白混合，在-4℃至4℃冷却不少于5小时后，再加入5’-磷酸吡哆醛和/或磷酸吡哆醛。所述磷酸盐缓冲液是Na2HPO4和KH2PO4的混合液。
[0007] 所述Na2HPO4和KH2PO4的磷酸盐缓冲液中：1000毫升磷酸盐缓冲液含7～12克Na2HPO4、含3～8克KH2PO4。
[0008] 所述透析是在-4℃至4℃利用透析袋截留分子量8000-14000的分子。
[0009] 其步骤是：
[0010] (1)葱白在温度为-4℃至4℃，时间为5小时至24小时；
[0011] (2)在冷却的葱白加入pH6～pH6.8的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液，及磷酸缓冲液体积9％～12％的甘油，1～4克/千毫升磷酸盐缓冲液的乙二胺四乙酸二钠混合，-4℃至4℃预冷5小时至24小时，再加入0.002～0.01克/千毫升磷酸盐缓冲液的5’-磷酸吡哆醛和/或磷酸吡哆醛；在-4℃至4℃匀浆后；0℃至5℃在离心，得到第一固相和第一液相；
[0012] (3)在第一液相中加入第一液相质量的15％～30％聚乙二醇，搅拌后静置；0℃至5℃在离心，得到第二固相和第二液相；
[0013] (4)将第二固相用pH6～pH6.8的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液溶解后；使用的透析袋截留分子量8000-14000分子；透析操作的温度为-4℃至4℃；
[0014] (5)将步骤(4)透析后的溶液在是低于-45℃～-30℃温度冷冻后，升华，升华最高温度＜35℃；得到葱酶。
[0015] 步骤(4)中：透析过程中更换pH6～pH6.8的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲。
[0016] 提取得到的葱酶经过SDS-PAGE分析得到的图谱显示，该葱酶为混合物，其中浓度较高的成分主要集中在相对分子量40～55kDa之间。本发明葱白中酶的方法操作简便易行工艺质量稳定。
附图说明
[0017] 图1葱白中提取葱酶的SDS-PAGE图。
具体实施方式
[0018] 实施例1
[0019] (1)将葱白在温度为-4℃至4℃，时间为12小时至24小时；
[0020] (2)在冷却的葱白350克加入pH6.5的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液500毫升，45毫升的甘油，0.5克乙二胺四乙酸二钠(EDTA)混合，-4℃至4℃预冷12小时，再加入0.001克5’-磷酸吡哆醛；在-4℃至4℃匀浆后；0℃至5℃在转速为6000转/分至8000转/分，时间为20分钟至30分钟进行离心，得到第一固相和第一液相；500毫升的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液含有Na2HPO43.5克，含KH2PO41.5克。
[0021] (3)在第一液相中加入第一液相质量的15％聚乙二醇8000，搅拌后静置；0℃至5℃在转速为6000转/分至8000转/分，时间为20分钟至30分钟进行离心，得到蛋白质沉淀和上清液；
[0022] (4)将蛋白质沉淀用pH6.5的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液250毫升溶解后；使用的透析袋截留分子量8000-14000分子；透析操作的温度为-4℃至4℃；透析2次，总透析时间为6小时至8小时。250毫升的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液含有Na2HPO41.25克，含KH2PO40.75克。
[0023] (5)将步骤(4)透析后的溶液在是低于-45℃～-30℃温度冷冻后，升华，升华最高温度＜35℃；得到葱酶。得葱酶冻干粉末4.8g
[0024] 实施例2
[0025] 按上述工艺步骤
[0026] 步骤2中，原料：葱白350克，pH6.5的500毫升的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液含有Na2HPO46克，含KH2PO44克；60毫升的甘油，2克乙二胺四乙酸二钠，0.005克5’-磷酸吡哆醛
[0027] 步骤3中第一液相质量的25％聚乙二醇.
[0028] 步骤4中pH6.5的250毫升的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液含有Na2HPO46克，含KH2PO44克。透析3次。
[0029] 得葱酶冻干粉末6.0g
[0030] 实施例3
[0031] 按上述工艺步骤
[0032] 步骤2中，原料：葱白350克，pH6.5的500毫升的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液含有Na2HPO44.8克，含KH2PO42.8克；100毫升的甘油，1克乙二胺四乙酸二钠，0.0025克5’-磷酸吡哆醛
[0033] 步骤3中第一液相质量的30％聚乙二醇8000
[0034] 步骤4中pH6.5的500毫升的Na2HPO4和KH2PO4磷酸盐缓冲液含有Na2HPO44.8克，含KH2PO42.8克。
[0035] 得葱酶冻干粉末5.3g。
[0036] 上述实施例中聚乙二醇可优选采用聚乙二醇8000(PEG8000)。
[0037] 上述工艺表明：采用提取液由pH6～pH6.8的磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲液体积9％～12％的甘油，1～4克/千毫升磷酸盐缓冲液的乙二胺四乙酸二钠和0.002～0.01克/千毫升磷酸盐缓冲液的5’-磷酸吡哆醛和/或磷酸吡哆醛进行均浆后，平均蛋白质量
7.381克，平均酶活(U)93.478。
[0038] 采用15％～30％聚乙二醇分离后的酶的活性相对稳定。
[0039] 透析6h后，透析基本已经达到平衡。
[0040] 提取得到的葱酶经过SDS-PAGE分析得到的图谱显示，该葱酶为混合物，其中浓度较高的成分主要集中在相对分子量40～55kDa之间，如图1所示。
