碳硼烷衍生物的应用、纳米复合物制剂及其应用

摘要

本发明提供了碳硼烷衍生物及其应用。相关三种新型碳硼烷衍生物的结构式如（1）（2）（3）所示，作为药物活性成分的抗菌药物，不仅能对临床上常见的病原菌（金黄色葡萄球菌，鲍曼不动杆菌，肺炎克雷伯氏菌，奇异变形杆菌）具有抗菌活性，而且对多药耐药金黄色葡萄球菌菌株具有相同程度的抗菌活性，能够抑制其多药耐药性。其中化合物（2）能够与耐药金黄色葡萄球菌胞外蛋白的发生作用，降低细菌对生物表面的粘附性，抑制耐药菌株生物膜的形成。对降低金黄色葡萄球菌的毒力和侵袭力，增加治疗有效率，避免大剂量使用抗生素造成的不良反应，为寻求新型的抗耐药菌药物提供了一类新的化合物。

权利要求

1.碳硼烷衍生物与纳米银颗粒组合的纳米复合物制剂在制备抗菌药物中的应用，按重量份计，其包括碳硼烷衍生物一份、纳米银颗粒一份，其中所述的碳硼烷衍生物结构式为（1）、（2）或（3），

其特征在于所述的病菌为金黄色葡萄球菌临床耐药菌。

说明书

碳硼烷衍生物的应用、纳米复合物制剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及纳米药物领域，具体涉及碳硼烷衍生物及其纳米复合制剂，其为药物活性成分或药物组合物，其抗菌作用，以及在抗菌药物研制中的应用。

背景技术

[0002] 抗菌药物一般是指在一定浓度下对病原体具有杀菌或抑菌活性的药物，包括各种抗生素和化学合成药物。目前国际上用于临床的常用抗菌药物按结构分类主要分为八大类：β-内酰胺类；氨基糖苷类；四环素类；氟喹诺酮类；叶酸途径抑制剂类；氯霉素；糖肽类；大环内酯类。其主要作用机制有: 干扰细胞壁的形成; 抑制核酸的合成; 抑制蛋白质合成; 改变细胞膜的通透性; 作用于能量代谢系统和作为抗代谢物。然而，随着抗生素的广泛应用，越来越多的病原菌对常用抗生素产生一定的耐药性，且耐药程度日趋严重。自从1961年英国首先报道世界上第一株耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌 (MRSA) 以来, 不同克隆的MRSA菌株急剧增多并遍及全球。MRSA具有传播速度快和广泛耐药性的特点,已居医院感染病原菌的首位。万古霉素被认为是治疗MRSA感染的最后一道防线，但近几年又发现了对万古霉素耐药的MRSA, 这给临床MRSA感染的治疗带来巨大难题。细菌产生耐药性的生化机制主要有: 钝化酶的产生; 药物作用靶位的改变; 外膜通透性的改变和主动外排机制。其中细菌生物膜的形成与细菌的群体耐药有着密切的联系，据统计：临床上约有65%的细菌感染与细菌生物膜感染有关。细菌生物膜引起的感染多表现为复发性、难治性和慢性持续性特征。其关键在于：1.即使宿主的细胞和体液免疫防御反应很强也难以完全清除生物膜感染。2.抗生素可以杀死膜内游出的细菌而减轻感染症状却不能杀死生物膜内菌而治愈感染。3.生物膜有规律的释放浮游态的细菌到周围组织，如果宿主免疫防御体系不能及时清除这些细菌，临床即表现为急性感染，生物膜便成为内源性感染原。

[0003] 因此对细菌生物耐药机理进行深入研究,以指导对现有药物进行结构改造或开发新型抗菌药物是十分有必要的。我们研究发现这三种新型碳硼烷衍生物及其纳米复合物制剂均具有较好的抗菌活性, 特别是其通过特异性与蛋白疏水微区结合,以及诱导耐药金黄色葡萄球菌胞外蛋白表达量的减少,从而降低对生物组织或细胞的粘附性,降低细菌生物膜的形成, 从而抑制因细菌形成生物膜而使药物无法杀死膜内菌而使治疗失败或易复发这一机理造成的多药耐药性。由于这三种新型碳硼烷衍生物及其纳米复合物制剂为本研究组首次合成,因此国内外专利及其他文献没有涉及新型碳硼烷衍生物及其纳米复合物制剂抗菌活性的有关报道。

发明内容

[0004] 技术问题：本发明提供了三种新型碳硼烷衍生物及其纳米复合物制剂作为抗菌药物的应用,以及在治疗耐药细菌生物膜感染中的应用。

[0005] 技术方案：

[0006] 碳硼烷衍生物在制备治疗抗菌药物中的应用，其特征在于所述的碳硼烷衍生物结构式为（1）、（2）或（3）及其药物上可接受的盐类或载体

[0007] 。

[0008] 所述的碳硼烷衍生物在制备治疗纳米抗菌药物中的应用，其特征在于所述的病菌为对抗生素药物有抗性的病原菌。

[0009] 所述的碳硼烷衍生物与纳米银颗粒组合的纳米复合物制剂，其特征在于按重量份计，其包括碳硼烷衍生物一份、纳米银颗粒一份。

[0010] 碳硼烷衍生物与纳米银颗粒组合的纳米复合物制剂的制备方法为: 将三种碳硼烷衍生物（1），（2），（3）与纳米银按照质量比为1:1的比例混合后,加入二甲基亚砜:水=1:99(体积比)作为溶剂，用超声振荡器（100W, 40 KHz）振荡30分钟即得。得到的复合物制剂为黑色混悬液，粒径范围为20-40nm。

[0011] 碳硼烷衍生物与纳米银颗粒组合的纳米复合物制剂在制备治疗抗菌药物中的应用。

[0012] 所述的碳硼烷衍生物与纳米银颗粒组合的纳米复合物制剂在制备治疗抗菌药物中的应用，其特征在于所述的病菌为对抗生素药物有抗性的病原菌。

[0013] 所述的所述的碳硼烷衍生物与纳米银颗粒组合的纳米复合物制剂在制备治疗抗菌药物中的应用，其特征在于所述的对抗生素药物有抗性的病原菌为金黄色葡萄球菌临床耐药菌。

[0014] 所述的碳硼烷衍生物，其特征在于：该纳米药物组合上可接受的载体选自以下的至少一种：赋性剂，粘合剂， 润滑剂， 崩解剂，包衣剂，乳化剂，悬浮剂，溶剂，稳定剂，吸收剂，注射用水和等渗剂。

[0015] 所述的碳硼烷衍生物，其特征在于：该纳米复合物制剂组合制成于绷带或注射给药形式。

[0016] 在实际应用中可将三种碳硼烷衍生物（结构式(1)(2)(3) 所示）作为抗菌药物单独使用或与其他药物联合使用，利用其能抑制临床耐药菌生物膜的形成这一特点，不但可预防或治疗由金黄色葡萄球菌，鲍曼不动杆菌，肺炎克雷伯氏菌，鲍曼不动杆菌耐药菌所引起的浅层或深部的微生物感染，而且可联合其他药物对大肠杆菌，绿脓杆菌，霍乱弧菌，结核杆菌等其他病原微生物的感染。

[0017] 有益效果：(1) 三种碳硼烷衍生物及其纳米复合物制剂均具有广谱抗菌活性, 对供试菌株金黄色葡萄球菌,鲍曼不动杆菌,肺炎克雷伯氏菌,奇异变形杆菌都有很好的抗菌活性。(2) 相关硼烷衍生物及其纳米复合物制剂对金黄色葡萄球菌临床耐药菌株具有很好的抗菌活性, 能够通过抑制其生物膜的形成而抑制其多药耐药性，用以治疗生物膜相关的细菌感染。

附图说明

[0018] 下面结合附图说明本发明的实施例。本发明保护范围不以实施例为限。

[0019] 图1是化合物（1）的抗金黄色葡萄球菌时间-杀菌曲线。

[0020] 图2是化合物（2）的抗金黄色葡萄球菌时间-杀菌曲线。

[0021] 图3是化合物（3）的抗金黄色葡萄球菌时间-杀菌曲线。

[0022] 图4是激光共聚焦显微镜观察化合物（2）不同浓度下对临床耐药金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响。

具体实施方式

[0023] 实施例1三种碳硼烷衍生物的最低抑菌浓度试验

[0024] 1.1受试药物的配制: 如结构式（1）、（2）、（3）所示的三种碳硼烷衍生物分别用二甲基亚砜配制成高浓度母液，再用双蒸水分别稀释成浓度为1600, 800, 400, 200, 100,50, 25, 12.5, 6.25μg/mL。受试药物于-4℃保存。实验前，将药物取出37℃水浴融合后，摇匀，进行药效学实验。实验中需严格控制DMSO终浓度在0.5 %(v/v) 以下,以确保对生物体无任何细胞毒性。

[0025] 1.2 实验菌株及培养方法：标准菌株：金黄色葡萄球菌（CGMCC1.89），肺炎克雷伯氏菌(ATCC700600), 鲍曼不动杆菌(ATCC19606), 奇异变形杆菌(ATCC12453)。临床耐药菌株: 金黄色葡萄球菌（SA321）, 肺炎克雷伯氏菌(KP450), 鲍曼不动杆菌(AB135), 奇异变形杆菌(PM102)。LB液体培养基:1%(w/v)胰蛋白胨,0.5%(w/v)酵母抽提物, 1%(w/v)氯化钠, 高压蒸汽灭菌30min后,用2mol/mL的NaOH调整pH至7.2-7.4。LB琼脂板为LB液体培养基中加入0.5%(w/v)琼脂粉,高压蒸汽灭菌后,冷却至50℃倒板,冷凝即得。培养方法:用接种环从4℃保存的固体斜面培养基上挑取少量菌落,接种于固体LB培养基平面上,37℃恒温箱中培养24h后, 用接种环挑取3-5个菌落转移至无菌试管中,用0.9%无菌生理盐水稀释并混匀,显微镜下用血细胞计算板计数,并用培养基调整菌液浓度
5 5
至1.0×10-5.0×10 CFU/mL作MIC测定用菌悬液。

[0026] 1.3 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定

[0027] 根据美国临床试验室标准化委员会（CLSI）2006年制订的稀释法抗菌药物敏感性试验方案（M7-A7）。取三组分别加有不同终浓度(1000, 800, 400, 200, 100, 50, 25,5
12.5, 6.25μg/mL)的化合物(1), 化合物(2), 化合物(3)的菌悬液（2×10 CFU/mL）, 加入到无菌96孔板中,每孔加入200μL,未加药物的细菌悬液作为阳性对照组, 200μL LB培养液作为阴性对照组, 8种菌株分别进行测定。经恒温培养24h后, 在阴性对照溶液清澈, 阳性对照组菌落生长良好的前提下, 肉眼观察到各加药组微孔中溶液澄清的最低加药浓度即为MIC。取大于MIC浓度的其他几个浓度的培养物分别吸取0.1ml，移种在不含药物的琼脂培养平板上孵育18-24h，分别菌落计数，其菌落数少于5个的药物浓度即为MBC。 MIC被定义为: 微生物没有增长的最低抗菌剂浓度。MBC被定义为：完全杀死某种菌株的药物最低浓度。对金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯氏菌, 鲍曼不动杆菌, 奇异变形杆菌的标准菌株和临床耐药菌株均有抑菌活性, MIC范围为25-800μg/mL。试验结果表明: 化合物(1), 化合物(2), 化合物(3)对金黄色葡萄球菌, 肺炎克雷伯氏菌, 鲍曼不动杆菌以及奇异变形杆菌的敏感标准菌株和临床多药耐药菌株均有一定的生长抑制作用，且这四种细菌对化合物(1), 化合物(2), 化合物(3)的敏感程度基本无显著差别，因此表明了该三种化合物能克服临床多药耐药性菌株对药物的耐药性。

[0028] 实施例2 三种碳硼烷衍生物纳米复合物制剂抗金黄色葡萄球菌时间-杀菌曲线，如图1、2、3。

[0029] 三种碳硼烷衍生物（1），（2），（3）纳米复合物制剂的抗金黄色葡萄球菌临床耐药株SA321的抗菌特点通过时间杀菌-曲线评估。在不同浓度12.5,25,50,100,200μg/mL下被测试。细菌悬液分别加入上述终浓度的药物，设置未加药的细菌悬液作为对照组，然后将它们放入到恒温培养箱中37℃培养,分别取不同时间间隔0,4,8,12,16,24 h的培养液进行平板菌落计算,杀菌活性被定义为与对照组相比大于3倍log10CFU/mL的下降量。试验结果表明：相关抗菌活性均呈浓度依赖型。

[0030] 实施例3三种碳硼烷衍生物及其纳米复合物制剂抑菌百分率比较试验

[0031] 细胞密度为2×105 CFU/mL的标准菌株GCMCC1.89和临床耐药菌株SA321的细菌悬液分别加入不同终浓度（8,16,32 μg/mL）的化合物（1），（2），（3）制剂，未加药的细菌悬液设为对照组，然后放入恒温培养箱中37℃培养24h, 用紫外分光光度计测定600nm处的吸光度值。抑菌百分率=[1-(ODtested-ODblank)/ (ODcontrol-ODblank)]×100.[0032] 试验结果表明：三种碳硼烷衍生物及其纳米复合物制剂对金黄色葡萄球菌敏感和耐药菌株的抑菌百分率没有明显差异（P > 0.05）。三种化合物对金黄色葡萄球菌的敏感菌株和耐药菌株的敏感程度无显著性差异这表明了这三种化合物具有抗耐药性。

[0033] 实施例4碳硼烷衍生物化合物(2)及其纳米复合物制剂诱导金黄色葡萄球菌临床耐药菌株SA321粘附性降低。

[0034] 人类上皮细胞系人子宫颈癌细胞(HeLa cells)常被应用于衡量细菌对细胞或组织侵袭力能力的一个尺度。通过对HeLa细胞粘附性的大小来判断其侵袭力的大小。试验过程简述如下：亚抑菌浓度下（Sub-MIC）的SA321菌株与HeLa细胞共培养2h后,通过瑞氏吉姆萨染色后于显微镜下观察。粘附有细菌的HeLa细胞数与细胞总数的比例作为观察结果。试验中在显微镜下视野中数80个HeLa细胞，其中粘附有细菌的HeLa细胞数除以80后的百分率作为粘附率结果。由此可见：经亚抑菌浓度的化合物（2）诱导后，金黄色葡萄球菌临床耐药菌株SA321的粘附性发生显著降低（P<0.05）。

[0035] 实施例5 碳硼烷衍生物化合物(2)及其纳米复合物制剂与细菌胞外蛋白的相互作用。

[0036] 试验过程简述如下：首先提取出金黄色葡萄球菌临床耐药菌株SA321的胞外蛋白,然后加入不同浓度的化合物（2）与胞外蛋白作用2h后进行考马斯亮蓝R-250染色,测定595nm处的吸光度值(OD595nm)。试验结果表明：加入相关制剂的蛋白质样品OD595nm值与未加药的对照组比较,发生显著降低。

[0037] 实施例6 碳硼烷衍生物化合物(2)及其纳米复合物制剂抑制临床耐药金黄色葡萄球菌菌株生物膜的形成。

[0038] 试验过程简述如下：取SA321菌株菌悬液1mL 加入到6孔板中,然后每孔放入一个盖玻片,分别向5个孔中加入5个不同浓度的碳硼烷衍生物制剂,未加药的孔作为对照组,37℃条件下静态培养18小时后,用PBS洗掉未粘连细菌,然后用吖啶橙染色,于激光共聚焦显微镜下观察生物膜的形成情况。研究结果表明：亚抑菌浓度下的新型碳硼烷衍生物制剂能够抑制细菌生物膜的形成。