一种乙型脑炎疫苗制剂的生产方法

摘要

本发明提供一种乙型脑炎疫苗制剂的生产方法，该生产方法包括以下步骤：向灭活和纯化的乙型脑炎病毒培养液中加入1mol/L pH8.5磷酸盐缓冲溶液使其磷酸盐浓度达到0.05mol/L，然后在搅拌下加入1mol/L的NaOH溶液和0.2mol/L的AlCl3溶液进行反应并保持体系的pH为7.0，直至反应产物中的Al(OH)3浓度为2.0～2.5mg/ml。与无佐剂制品和表面吸附制品相比，该方法生产的乙型脑炎疫苗免疫持久性明显延长，同时解决了阳转率和发热率之间的矛盾。

权利要求

1.一种乙型脑炎疫苗制剂的生产方法，该生产方法包括以下步骤：

向灭活和纯化的乙型脑炎病毒培养液中加入1mol/L pH8.5磷酸盐缓冲溶液使其磷酸盐浓度达到0.05mol/L，然后在搅拌下加入1mol/L的NaOH溶液和0.2mol/L的AlCl3溶液进行反应并保持体系的pH为7.0，直至反应产物中的Al(OH)3浓度为2.0~2.5mg/ml。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生产方法还包括以1mol/L的NaCl溶液和注射用水稀释反应产物。

3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述反应产物被稀释至Al(OH)3浓度为0.5~0.75mg/ml，NaCl浓度为0.14~0.16mol/L。

4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述生产方法还包括向稀释后的反应产物加入添加剂。

5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，所述添加剂包括以g/ml计1%的甘氨酸和以g/ml计5%的蔗糖。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述灭活和纯化的乙型脑炎病毒培养液的蛋白浓度为30~80μg/ml。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述乙型脑炎疫苗制剂的抗原量为5~10μg/剂，补结抗原量为1：4~1：8。

8.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，所述乙型脑炎疫苗制剂的抗原量为

5~10μg/剂，补结抗原量为1：4~1：8。

说明书

一种乙型脑炎疫苗制剂的生产方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种乙型脑炎疫苗制剂的生产方法，具体涉及一种利用铝佐剂原位吸附技术生产灭活病毒乙型脑炎疫苗制剂的方法。

背景技术

[0002] 目前，国内灭活病毒乙型脑炎疫苗制剂的生产工艺多采用冻干制剂或铝佐剂表面吸附，国外也有关于铝佐剂表面吸附的报道。但是，这些方法制备出的乙型脑炎疫苗产品的免疫效果均还有待提高，同时还存在阳转率提高的情况下，发热率也同时提高的缺陷，严重地影响了灭活病毒乙型脑炎疫苗产品的推广和使用。

发明内容

[0003] 因此，本发明的目的在于提供一种利用铝佐剂原位吸附技术生产乙型脑炎疫苗制剂的方法。与无佐剂制品和表面吸附制品相比，该方法生产的乙型脑炎疫苗制剂成功地解决了阳转率和发热率之间的矛盾；同时疫苗的免疫持久性明显延长。

[0004] 用于实现上述目的的技术方案如下：

[0005] 一种乙型脑炎疫苗制剂的生产方法，该生产方法包括以下步骤：

[0006] 向灭活和纯化的乙型脑炎病毒培养液中加入1mol/L pH8.5磷酸盐缓冲溶液使其磷酸盐浓度达到0.05mol/L，然后在搅拌下加入1mol/L的NaOH溶液和0.2mol/L的AlCl3溶液进行反应并保持体系的pH为7.0，直至反应产物中的Al(OH)3浓度为2.0～2.5mg/ml。

[0007] 上述生产方法还可以包括以1mol/L的NaCl溶液和注射用水稀释反应产物。优选地，反应产物被稀释至Al(OH)3浓度为0.5～0.75mg/ml，NaCl浓度为0.14～0.16mol/L。

[0008] 上述生产方法还可以包括向稀释后的反应产物加入添加剂。优选地，添加剂包括1％(g/ml)甘氨酸和5％(g/ml)蔗糖。

[0009] 在上述生产方法中，所述灭活和纯化的乙型脑炎病毒培养液的蛋白浓度可以为30～80μg/ml。

[0010] 在上述生产方法中，所述乙型脑炎疫苗制剂的抗原量可以为5～10μg/剂，补结抗原量为1∶4～1∶8。其中，补结抗原即是用补体结合反应测得的抗原量，可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等或者颗粒性抗原，与相应抗体结合后，其抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能觉察，如再加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相对应的抗原和抗体，此反应即为补体结合反应。

[0011] 本发明还提供了上述生产方法制备的乙型脑炎疫苗制剂。

[0012] 与现有技术相比，本发明的生产方法采用铝佐剂原位吸附技术因而具有以下显著的优点：

[0013] 1、铝佐剂原位吸附制品的中和抗体效价明显提高。

[0014] 小鼠一针和二针免疫中和抗体效价的检测结果表明，铝佐剂原位吸附制品的中和抗体水平大大高于无佐剂制品，免疫效果持久。人体临床试验结果表明，与市场上的对照产品相比，铝佐剂原位吸附制品能够明显增强免疫反应，阳转率、中和抗体滴度和免疫持久性均大大提高。

[0015] 2、有效地解决了阳转率和发热率之间的矛盾。

[0016] 无佐剂乙脑疫苗和铝佐剂表面吸附乙脑疫苗都存在抗原量和发热率之间的矛盾，增加抗原量有利于提高阳转率，但同样发热率也会有大幅度提高。现有产品通常以降低阳转率和中和抗体滴度为代价来控制发热率。铝佐剂原位吸附解决了阳转率和发热率之间的矛盾。表面吸附是预先生成氢氧化铝，再用氢氧化铝吸附抗原。吸附均发生在佐剂表面。与此不同的是，原位吸附氢氧化铝的生成过程与吸附过程同时进行，吸附过程中不断生成的铝佐剂将抗原紧紧包裹在内部。这种疫苗经免疫进入人体后，铝佐剂还具有缓释抗原作用，因而在保证阳转率和中和抗体滴度大幅提高的情况下还能有效降低发热反应的发生率。

[0017] 3、原位吸附有利于提高产品的稳定性，延长货架期。

[0018] 国内外现有的铝佐剂表面吸附制品都存在容易解吸附、稳定性差、货架期短以及效力降低等缺点，而且解吸附的抗原容易成团使发热率升高。现有制品的有效期一般为18～24个月，而铝佐剂原位吸附的制品稳定性更好，货架期延长，有效期可以稳定保持在
36个月以上。

[0019] 4、免疫持久性延长有利于加强对免疫人群的保护作用。

[0020] 现在的免疫程序为基础免疫注射两针，1年后加强免疫1次。临床研究结果表明，现有的乙脑疫苗产品基础免疫六个月后人群中和抗体阳性率降至40％以下，本发明的方法生产的疫苗基础免疫六个月后人群中和抗体的阳性率能维持在90％以上。证明本发明的方法生产的疫苗免疫持久性大大延长。按照流行病学普遍规律，人群中和抗体阳性率维持在60％以上，才能产生足够的保护屏障，完全控制疾病流行。因此，本发明的方法生产的疫苗有利于加强对免疫人群的保护作用。

附图说明

[0021] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0022] 图1：本发明生产的制剂与已有制剂的抗体阳转率的统计结果比较；

[0023] 图2：本发明生产的制剂与已有制剂的中和抗体滴度比较；

[0024] 图3：本发明生产的制剂与已有制剂的免疫持久性(6个月)比较。

具体实施方式

[0025] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

[0026] 实施例1

[0027] 1、VERO种子细胞的复苏

[0028] 1.1VERO细胞株的来源

[0029] VERO细胞原始来源为ATCC(编号为F-12313)，经传代扩增建立了主细胞库和工作6
细胞库，并保存于液氮中。主细胞为129代；工作细胞为133代，冻存密度为4×10/ml。

[0030] 1.2VERO种子细胞的复苏

[0031] 取液氮罐内保存工作库细胞一支，39℃温水迅速融化后，将细胞悬液按约1×105/2 2
cm 接种密度转入175cm 方瓶中，逐步滴加培养基(含10％(体积/体积)胎牛血清的M199培养基(M199干粉培养基组成成分见GIBCO培养基手册)至60mL，37℃和5％CO2培养箱中培养。

[0032] 2、在175cm2方瓶中培养一级种子细胞

[0033] 复苏的细胞培养3～4天生长成致密单层，使用0.25％(g/ml)胰酶消化液消化分散，再以1∶4(体积/体积)的接种比例将细胞悬液分到新培养瓶中，加入适当量的培养液(60ml)，37℃、5％CO2培养箱中培养3～4天后以1∶4(体积/体积)比例再放大培养一次。

[0034] 3、在2L转瓶中培养二级种子细胞

[0035] 3.1培养基

[0036] M199培养基9.55g/L，NaHCO3 1.8g/L，葡萄糖1.5g/L，谷氨酰胺0.2g/L，10％(体积/体积)胎牛血清。

[0037] 3.2转瓶培养

[0038] 选择2L转瓶和四层转瓶机，保持接种密度为1.0～2.0×105/cm2，加入500～600ml培养基，设置温度为37℃，转速为每分钟1/8转，培养3～4天。

[0039] 4、在14L生物反应器中培养三级种子细胞

[0040] 4.1培养液

[0041] M199培养基9.55g/L，NaHCO3 2.2g/L，葡萄糖1.5g/L，谷氨酰胺0.2g/L，10％(体积/体积)胎牛血清。

[0042] 4.2反应器选择

[0043] 选择NBS或Sartorius哺乳动物细胞培养罐，罐体积为14L，工作体积为10L。

[0044] 4.3微载体选择

[0045] Cytodex 1微载体(GE公司)，用量为5.0g/L。

[0046] 4.4上罐接种

[0047] 将转瓶中培养3～4天的VERO细胞经消化后，转移至蓝盖瓶中，吹打分散均匀，一并接入14L生物反应器，添加培养基至10L。

[0048] 4.5参数控制

[0049] 搅拌转速：35～40RPM；pH：7.2～7.4；溶解氧量(DO)：40～50％饱和度；温度：36.5～37.5℃。

[0050] 4.6灌流控制

[0051] 接种12小时后开启灌流，灌流量为每天1.5工作体积，培养5～6天。

[0052] 5、在75L生物反应器中培养四级种子细胞

[0053] 5.1培养基同4.1.

[0054] 5.2反应器的选择

[0055] 选择NBS或Sartorius哺乳动物细胞培养罐，罐体积为75L，工作体积为50L。

[0056] 5.3微载体使用方法及用量同4.3

[0057] 5.4转罐接种

[0058] 将14L生物反应器中培养5～6天的细胞用0.25％(g/ml)胰酶消化液(含0.01％(g/ml)的EDTA)罐外消化，搅拌振荡分散均匀，用胰酶抑制剂(Gibco)终止反应后，通过管道将细胞连同微载体一并转入75L生物反应器，定容至50L。

[0059] 5.5参数控制

[0060] 搅拌转速：35～40RPM；pH：7.2～7.4；溶解氧量(DO)：40～50％饱和度；温度：36.5～37.5℃。

[0061] 5.6灌流控制

[0062] 接种12小时后开启灌流，灌流量为每天1.5工作体积，培养5～6天。

[0063] 6、在300L生物反应器大规模培养VERO细胞和制备病毒液

[0064] 6.1培养基和维持液配方

[0065] 培养基同4.1.

[0066] 维持液：M199培养基9.55g/L，NaHCO3 2.2g/L，蔗糖1.0g/L，人血白蛋白0.1g/L。

[0067] 6.2反应器的选择

[0068] 选择比欧或Sartorius哺乳动物细胞培养罐，罐体积为300L，工作体积为210L。

[0069] 6.3微载体用量同4.3

[0070] 6.4转罐

[0071] 将75L生物反应器中培养5～6天的细胞用0.25％(g/ml)胰酶消化液(含0.01％(g/ml)的EDTA)罐外消化，搅拌振荡分散均匀，用胰酶抑制剂(Gibco)终止反应后，通过管道将细胞连同微载体一并转入300L生物反应器，定容至210L。

[0072] 6.5培养参数同4.5。

[0073] 6.6灌流控制

[0074] 接种24小时后开启灌流，灌流量为每天1.5工作体积，培养5～6天。

[0075] 7、接种乙脑P3株病毒培养

[0076] 7.1接毒方法

[0077] 暂停控制参数，沉降微载体和细胞，抽掉上清培养液，更换为维持液，待参数稳定后按照MOI为0.01接种病毒。

[0078] 7.2参数控制

[0079] 搅拌转速：35～40转/分(RPM)；pH：7.5～7.6；DO：40～50％饱和度；温度：33.5～34.5℃。

[0080] 7.3以连续灌流方式收获病毒培养液

[0081] 接毒12小时后开始灌流，灌流量为每天1.5工作体积，从接毒48小时起开始收获病毒液，连续收获8天。

[0082] 8、病毒收获液的澄清过滤和超滤浓缩

[0083] 8.1澄清过滤

[0084] 选择膜面积为1平方米(20英寸)的1μm和0.5μm的聚醚砜滤芯串联，先经1μm滤膜再经0.45μm滤膜过滤。

[0085] 8.2超滤浓缩

[0086] 8.2.1缓冲液选择

[0087] 选择pH7.2-8.0无菌磷酸缓冲液冲洗平衡好超滤系统。

[0088] 8.2.2设备选择

[0089] 使用Millipore公司的0.5平方米PELLICON 2超滤系统，安装2块PELLICON 2超滤膜包，截留分子量为300KD的滤膜。

[0090] 8.2.3操作参数

[0091] 设定进液口压力为10～20psi，回流口压力为5～10psi，2～4小时内完成80～120L病毒液的收获；样品浓缩20～40倍，得到2～6L浓缩液。

[0092] 9、病毒灭活：

[0093] 9.1灭活试剂的准备

[0094] 先将β-丙内酯用注射用水稀释成40倍的母液，经0.22μm膜过滤除菌。

[0095] 9.2灭活操作

[0096] 将预稀释的β-丙内酯母液加入浓缩液中至终浓度为1/4000，2～8℃下放置灭活，24小时后在37℃下水解2小时。

[0097] 10、分子筛层析

[0098] 10.1缓冲液选择

[0099] pH7.5～8.5的磷酸缓冲液。

[0100] 10.2填料选择

[0101] GE公司的Sephacryl S-300层析填料，装柱高度为20～60cm。

[0102] 10.3层析操作

[0103] 首先使用2倍柱体积的缓冲液平衡层析柱，流速为20～50cm/小时，上样样品体积为8％～12％的柱体积，收获第一峰(波长280nm，紫外检测器)。

[0104] 11、离子交换膜层析：

[0105] 11.1缓冲液的选择

[0106] 缓冲液A：pH7.5～8.5磷酸缓冲液，缓冲液B：pH7.5～8.0磷酸缓冲液加500mmol/L氯化钠。

[0107] 11.2离子交换膜的选择

[0108] Sartorius公司的Sartobind Q离子交换层析膜

[0109] 11.3层析操作

[0110] 先用10倍体积的缓冲液A平衡层析膜，上样经分子筛层析纯化后的抗原样品，用缓冲液A(体积比为100％～0％)和缓冲液B(体积比0％～100％)形成线性梯度洗脱，收集NaCl浓度为70mM至250mM之间的洗脱液为纯化后原液；

[0111] 12、铝佐剂原位吸附抗原方法

[0112] 12.1试剂准备

[0113] 1mol/L的NaOH溶液，1mol/L pH8.5的磷酸盐缓冲溶液，0.2mol/L的AlCl3溶液，1mol/L的NaCl溶液，过滤除菌。

[0114] 12.2吸附方法

[0115] 将纯化后的抗原过滤除菌后，加入1mol/L pH8.5磷酸盐缓冲溶液使其磷酸盐浓度为0.05mol/L，然后搅拌加入1mol/L的NaOH溶液和0.2mol/L的AlCl3溶液，反应过程中保持体系pH为7.0左右，反应体系中的Al(OH)3量为2.0～2.5mg/ml时为止。

[0116] 12.3稀释

[0117] 用1mol/L的NaCl溶液和注射用水稀释至抗原量为5～10μg/剂，补结抗原为1∶4～1∶8，Al(OH)3含量为0.5～0.75mg/ml，NaCl浓度为0.14～0.16mol/L。

[0118] 12.4加入添加剂：1％(g/ml)甘氨酸和5％(g/ml)蔗糖。

[0119] 12.5半成品检测：无菌试验。

[0120] 实施例2

[0121] 1、铝佐剂原位吸附制剂的中和抗体效价

[0122] 1.1小鼠一针免疫中和抗体的效价结果比较

[0123] 比较无佐剂制品和铝佐剂原位吸附制品一针免疫小鼠后的中和抗体效价，免疫2周、4周和6周后的血清中和抗体效价检测结果表明：铝佐剂制品和无佐剂制品的免疫原性存在很大差异，无佐剂制品免疫后中和抗体的高峰水平出现在注射后2周，4周开始下降。铝佐剂原位吸附制品的中和抗体高峰水平出现在注射后6周，且铝佐剂制品的平均中和抗体水大大高于无佐剂制品(见表3)。

[0124] 表3小鼠一针免疫中和抗体效价的比较

[0125]

[0126] 1.2小鼠二针免疫中和抗体的效价结果比较

[0127] 比较无佐剂制品和铝佐剂原位吸附制品二针免疫小鼠后的中和抗体效价，免疫间隔2周，第二针免疫后2周采血检测。结果表明二针免疫能够增强免疫效果，提高中和抗体效价。无佐剂制品中和抗体效价高峰出现在第二次免疫后2周，第4周和第6周降低，铝佐剂原位吸附制品中和抗体高峰出现在第6周(见表4)。

[0128] 表4小鼠二针免疫中和抗体效价的比较

[0129]采血时间 2周 4周 6周
铝佐剂原位吸附 416.7 478.6 513
无佐剂组 381.5 302.4 315.4

[0130] 1.3人体临床试验结果比较

[0131] 人体临床试验结果表明，铝佐剂原位吸附制品能够明显增强免疫反应，与市场上同类对照产品相比，其阳转率、中和抗体滴度和免疫持久性均大大提高(见表5、6、7和图3、4、5)。

[0132] 表5抗体阳转率统计结果

[0133]组别 试验苗 参考苗
样本总数(个) 313 151
抗体阳性样本数(个) 307 124
阳转率 98.1％ 80.2％

[0134] 表6中和抗体滴度分布结果

[0135]

[0136] 表7免疫持久性(6个月)的统计结果

[0137]组别 试验苗 参考苗
样本数(个) 50 50
抗体阳性样本数(个) 46 19
阳性维持率 92％ 38％

[0138] 1.4无佐剂乙脑疫苗、表面吸附乙脑疫苗以及铝佐剂原位吸附乙脑疫苗制剂的阳转率、发热率、有效期和免疫持久性比较(见表8)。

[0139] 表8无佐剂、原位吸附和表面吸附乙脑疫苗制剂数据比较

[0140]类型 阳转率(％) 发热率(％) 有效期(月) 免疫持久性(月)
无佐剂制品 80 5 24 6个月以下
铝佐剂原位吸附 98 4 36 1年以上
铝佐剂表面吸附 83 28 12 -