与替莫唑胺治疗胶质母细胞瘤相关的分子标志物

摘要

本发明提供一种用于确定胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治疗疗效的试剂盒，所述试剂盒包括测定胶质母细胞瘤患者的miR-181d水平的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书。本发明还提供用于确定胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治疗疗效的分子标志物miR-181d。

权利要求

1.一种试剂盒用于制备确定胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治疗疗效的药品中的应用，其特征在于所述试剂盒包括测定胶质母细胞瘤患者的miR-181d水平的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述试剂盒进一步包括：从胶质母细胞瘤患者的肿瘤组织样品中提取RNA的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述试剂盒是miRNA表达谱试剂盒。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述试剂盒是qRT-PCR试剂盒。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述测定胶质母细胞瘤患者的miR-181d水平与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关。

说明书

与替莫唑胺治疗胶质母细胞瘤相关的分子标志物

技术领域

[0001] 本发明涉及疾病诊断领域，特别是涉及用于确定胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治疗疗效的分子标志物及其相关试剂盒。

背景技术

[0002] 神经胶质瘤起源于神经外胚层，约占成人颅内肿瘤的40～50％。胶质母细胞瘤(GBM)约占所有胶质瘤临床病例的50％左右，是中枢神经系统恶性度最高的脑肿瘤之一。原发性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)约占所有胶质母细胞瘤临床病例的
90％以上，是中枢神经系统恶性度最高的脑肿瘤之一。胶质母细胞瘤呈侵袭性生长、手术切除困难、复发率和致死率极高，是当今神经外科领域的国际性难题。针对胶质母细胞瘤，目前强调最大程度手术切除、放射治疗和化学治疗等综合治疗策略，然而患者生存预后极差，中位生存期约为12～14个月。大量临床研究表明，常规病理学诊断相同的胶质母细胞瘤，对各种治疗的效果及临床预后存在显著差异，其浸润、复发、转移情况也多有不同，有的患者仅仅存活数周，而有的患者却可以存活几年以上。因此，年龄等传统临床预后因素的预测价值极为有限。

[0003] 现代观点认为，分子标志物广泛应用于临床可以改善对肿瘤患者的治疗效果[1]。近年来，肿瘤基因组学研究不断进展，运用基因表达谱芯片等高通量的检测方法已经研究出大量具有临床价值的肿瘤分子标志物。最新研究证实，微小RNA(microRNA，miRNA)表达谱芯片在肿瘤分类方面比蛋白编码基因表达谱芯片更加准确和有效[2-4]。microRNA作为肿瘤分子标志物与mRNA相比具有更大的优势，因为对于数量在40000以上的人类基因，从大约1000个人类microRNA中寻找可靠标志物将会变得容易的多。而且microRNA相对更加稳定而不易降解，可以用于长期保存的石蜡包埋标本。因此，我们从microRNA表达谱芯片中获得的信息将可以作为普通基因表达谱芯片的有益补充。

[0004] microRNA是长度在大约22nt左右的单链、非编码RNA，其主要作用在于转录后水平调控成百上千个基因的表达，因而具有广泛的生物学功能[5，6]。目前研究表明，microRNA与某些人类肿瘤的临床预后显著相关，如白血病[7]、肺癌[8]、胰腺癌[9]、肝细胞癌[10]、结肠癌[11]以及卵巢癌[12]等等。

[0005] 然而，microRNA标志物能否预测胶质母细胞瘤患者的临床预后至今未见报道。

[0006] 一项胶质母细胞瘤治疗重大进展是发现烷化剂替莫唑胺(TMZ)联合放疗有益于患者预后。尽管数据显示只有10％的病人通过这种治疗方案获得5年生存期，但所有胶质母细胞瘤患者都需接受这种治疗方案，因为目前不能预测哪些患者可以从这种治疗方案中受益。因此，具有预测作用的生物标记物的发现，成为了神经肿瘤领域的主要挑战。

发明内容

[0007] 因此，本发明涉及胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治疗的分子标志物的发现，以及开发胶质母细胞瘤患者是否需要用替莫唑胺治疗的试剂盒。

[0008] 在本发明的一个实施方式中公开一种用于确定胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治疗疗效的试剂盒，试剂盒包括测定胶质母细胞瘤患者的miR-181d水平的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书。

[0009] 在本发明的另一个实施方式中，所述试剂盒进一步包括从胶质母细胞瘤患者的肿瘤组织样品中提取RNA的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书。

[0010] 在本发明的还另一个实施方式中，所述试剂盒是miRNA表达谱试剂盒；或者所述试剂盒是qRT-PCR试剂盒。

[0011] 在本发明更另一个实施方式中，所述测定胶质母细胞瘤患者的miR-181d水平与与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关。

[0012] 在本发明的一个实施方式中，公开了一种用于确定胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治疗疗效的分子标志物miR-181d。

[0013] 本发明在此报道miR-181d作为胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治疗的分子标志物的发现，还提供了其在胶质母细胞瘤治疗中的应用。

附图说明

[0014] 图1是miR-181d表达水平与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关的图：(a)在TCGA数据库中miR-181d表达水平与患者总生存期呈负相关，蓝色：高于平均表达水平，红色：低于平均表达水平；(b)通过qRT-PCR评估在35个患者的独立验证组中miR-181d与总生存期相关，蓝色：高于平均表达水平，红色：低于平均表达水平；(c)在TMZ治疗状况的分层后，miA-181d与生存期相关性。

[0015] 图2是miR-181d下调MGMT表达的图：(a)转染miR-181d抑制了mRNA(左图)和A1207神经胶母细胞瘤细胞系中蛋白(右图)的表达，对于qPCR，MGMT mRNA不是归一化为β-肌动蛋白就是归一化为U6rRNA(具有相似的结果，数据没有示出)，对于蛋白印迹法，β-肌动蛋白被用作为加样对照；(b)MGMT 3’UTR中的miR-181d结合位点在miR-181d存在情况下抑制了荧光素酶表达；(c)MGMT 3’UTR中预测的miR-181d结合位点；(d)miR-181d与MGMT转录物物理地相互作用，β-肌动蛋白被用作为被用作为内对照。

[0016] 图3是miR-181d水平与MGMT mRNA水平呈负相关的图：(a)在具有表征的MGMT启动子、MGMT mRNA水平和miR181-d水平的223TCGA患者中miR-181d和MGMT转录物水平之间的相关性(p＝0.004，R2＝0.13)；(b)在具有未甲基化的MGMT启动子的159患者中miR-181d和MGMT转录物水平之间的相关性(p＝0.004，R2＝0.13)，MGMT和miR-181d的相对丰度在x-和y-轴上作图；(c)在神经胶母细胞瘤的独立组中miR-181d和MGMT转录物水平之间的负相关性(p＝0.04，R2＝0.62)。miR-181d和MGMT的表达水平通过qPCR进行评估。每一个的相对丰度在x-和y-轴上作图。

具体实施方式

[0017] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0018] 一.患者资料与标本来源

[0019] 本研究经机构审查委员会批准，所有病人均签署知情同意书，所有病人均接受手术治疗，并且病理诊断为胶质母细胞瘤。所有病人均接受放疗治疗。但只有部分病人接受TMZ治疗。患者的特征在以下表中列出。所有样本在切除后5分钟内冰冻，排除肿瘤组织小于80％的样本。切除程度经过2名放射科医师术后72小时行核磁共振检查，确定为全切除(GTR)级和非全切除(non-GTR)级。

[0020] 表1所有入组本研究的117例原发性胶质母细胞瘤患者的临床病理学资料[0021]项目 实验组(n＝82) 验证组(n＝35)
No.(％) No.(％)
性别
男性 54(65.9) 17(48.6)
女性 28(34.1) 18(51.4)
年龄，岁
均值(标准差) 43.1(13.4) 48.9(12.2)
范围 17-70 21-67
术前KPS评分 55(67) 25(71.4)
≥70 55(67) 25(71.4)
＜70 27(33) 10(28.6)
手术切除程度
近全切除 51(62.0)
次全切除 31(38.0)
替莫唑胺化疗
是 29(35.0)
否 53(65.0)

[0022] 二.DNA、RNA和miRNA表达谱

[0023] 按照生产厂商说明书从肿瘤组织中提取RNA，miRNA表达谱通过Human v2.0miRNA Expression BeadChip(Illumina，Inc.，San Diego，CA)检测，芯片数据依照MIAME指南储存于GEO中(序列号GSE25632)，qRT-PCR应用ABI 7900real-time PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)检测。

[0024] 1.标本总RNA提取

[0025] 实验流程如下，具体请参见mirVana miRNA Isolation kit说明书。

[0026] 1.1主要试剂

[0027]

[0028] 1.2实验步骤

[0029] (1)所有肿瘤标本在手术后立即置入液氮冷冻保存，同时进行标本冰冻切片和常规HE染色以判定肿瘤细胞的所占比例，选择肿瘤细胞占80％以上的标本进行下一步提取总RNA。

[0030] (2)组织研磨：使用180℃高温处理6h的研钵，加入液氮预冷，取直径0.5cm大小肿瘤组织迅速研磨至粉末状，为防止组织融化研磨时需间断加入液氮。

[0031] (3)组织裂解：取30mg左右研磨好的组织粉末，加入300ulLysis/Binding Buffer，充分振荡混匀后置于冰上。

[0032] (4)有机剂萃取：加入30ul miRNA Homogenate Additive，充分振荡混匀后置于冰上10min；加入350ul酚氯仿有机剂，充分振荡混匀30-60sec；10000g离心10min后回收上层液相约250ul。

[0033] (5)总RNA分离：加入375ul室温下无水乙醇，充分混匀后加入滤柱过滤，10000g离心15sec，弃去滤液；加入700ul miRNA Wash Solution 1，10000g离心15sec，洗脱，弃去滤液；加入500ul Wash Solution 2/3，10000g离心15sec洗脱，重复一次，弃去滤液，再空离60sec；更换收集管，加入50ul预热至95℃的Elution Solution，10000g离心30sec洗脱，重复一次，收集洗脱液即组织总RNA。

[0034] (6)应用NanoDrop ND-1000紫外分光光度仪进行RNA定量，并用琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测RNA完整性，然后将总RNA样品贮存于-80℃。

[0035] 2.Illumina microRNA表达谱芯片

[0036] 2.1主要试剂

[0037]

[0038] 2.2实验步骤

[0039] (1)在RNA样本的3’端加上多聚腺苷酸尾(制作PAP板)：

[0040] ①将完整的RNA样本用DEPC处理过的水标准化至200ng/μl的样本体系。

[0041] ②96孔板每孔加5μl多聚腺苷酸化反应试剂PAS，再每孔加5μl RNA样本，热封封好充分振荡混匀后快速离心。

[0042] ③将96孔板置于加热仪中37℃孵育60min，再70℃孵育10min。

[0043] (2)microRNA的cDNA合成(制作CSP板)：

[0044] ①在新96孔板中每孔加入8μl cDNA合成试剂CSS。

[0045] ②从PAP板中取8μl加过多聚腺苷酸尾的RNA加CSP板中对应的孔中，将CSP板封好，充分振荡混匀，快速离心。

[0046] ③将CSP板置于加热仪中42℃孵育60min，再70℃孵育10min。

[0047] (3)cDNA和microRNA特异核苷酸的杂交(制作ASE板)：

[0048] ①在一个新96孔板中每孔加5μl microRNA Assay Pool(MAP)和30μlOligo杂交&DNA结合缓冲液1(OB1)。

[0049] ②将CSP板中生物素酰化的cDNA转移15μl到ASE板对应孔中。

[0050] ③将ASE板快速离心，充分振荡混匀后，在加热仪中温度从70℃降至40℃孵育4h。

[0051] (4)microRNA特殊引物的延伸和连接：

[0052] ①将ASE板置于磁板上2min，直至所有磁珠都被吸附后吸取孔中液体，留下磁珠。

[0053] ②每孔加50μl AM1，充分振荡后置板于磁板并吸取液体，重复此步骤。

[0054] ③每孔加缓冲液50μl UB1，置板于磁板并吸取液体，重复此步骤。

[0055] ④每孔加37μl延伸结合混合液MEL，充分振荡，加热仪中45℃孵育15min。

[0056] (5)延伸产物的扩增(PCR)：

[0057] ①将64μl DNA多聚酶加入SCM管中，再加50μl尿嘧啶DNA转葡糖基酶(UDG)后混合，在一个新96孔板(PCR板)每孔中加入30μl SCM混合物封好待用。

[0058] ②将ASE板置于磁板上2min，直至所有的磁珠都被吸附后吸去液体，加入50μl UB1，再置于磁板上吸去液体。

[0059] ③ASE板每孔中加入35μl接种PCR试剂(IP1)，充分振荡，加热仪中90℃孵育1min后将板置于磁板上，吸30μl上层液体转移到PCR板相应的孔中，抽吸混匀液体后封好。④将PCR板放入循环变温加热仪中，运行下例程序：37℃，10分钟；95℃，3分钟；34个以下循环：95℃、35秒，56℃、35秒，和72℃、2分钟；72℃，10分钟；4℃，5分钟。

[0060] (6)固定PCR产物：

[0061] ①PCR板的每孔中加入20μl已混匀的磁性颗粒试剂(MPB)，将混合后的PCR产物和磁珠转移至过滤板的对应孔中。

[0062] ②盖上过滤板盖，避光放置60min。

[0063] (7)制作上芯片的过度板(INT板)：

[0064] ①将过滤板接合器放置到V型孔底的96孔板(废液板)上，再将含有固定PCR产物的过滤板放到接合器上。

[0065] ②25℃1000×g离心5min后，打开盖子，每孔加50μl缓冲液UB2，然后封闭盖子再次离心5min。

[0066] ③加30μl MH1到过度板(INT板)每个孔中，然后用INT板代替废液板，再加30μl 0.1N NaOH到过滤板每孔中。

[0067] ④25℃1000×g离心5min，最后在INT板中不会有可见的磁珠。

[0068] ⑤丢弃过滤板，轻轻摇动INT板以混匀其中液体，封好后避光放置待上芯片。

[0069] (8)芯片杂交：

[0070] ①将过渡板中荧光标记过的PCR产物取15μl点到microRNA表达谱芯片上，杂交炉中60℃杂交30min，然后45℃过夜杂交18h。

[0071] ②准备冲洗液UB2和XC4，XC4完全解冻后中加335ml 100％EtOH，然后XC4放置摇床上混匀30-40min。

[0072] ③取出杂交过后的芯片撕下盖膜，置于盛装着UB2的离心管中，盖上管帽，倒转5次冲洗芯片，将冲洗过的芯片放置于另一个盛装UB2的离心管中放置5min，再将芯片置于盛装XC4的离心管中倒转10次冲洗芯片。

[0073] ④在真空干燥器中将冲洗过的芯片干燥50-55min，压力为67kPa。

[0074] (9)芯片扫描与数据分析：

[0075] 该芯片包含1146个人类microRNA，约占miRBase 12.0数据库的97％。利用Illumina BeadArray Reader进行芯片扫描，所有扫描图像用BeadStudio软件进行数据分析。

[0076] 3.Illumina mRNA表达谱芯片

[0077] 3.1主要试剂

[0078]

[0079]

[0080] 3.2实验步骤

[0081] (1)样本RNA线性扩增：实验流程如下，具体请参见Illumina TotalPre RNA Amplification Kit说明书。

[0082] 步骤1：反转录合成第一链cDNA

[0083] ①取样本RNA 500ng加RNase-free水成11ul体系；

[0084] ②加入9ul反转录反应混合液(kit内提供)，充分混匀；

[0085] ③置于杂交炉42度反应2h。

[0086] 步骤2：合成第二链cDNA

[0087] ①每个样品加80ul第二条cDNA链合成混合液(kit内提供)，充分混匀；

[0088] ②置于杂交炉16度反应2h。

[0089] 步骤3：cDNA纯化

[0090] ①预热RNAase-free水到50-55度；

[0091] ②每个样品加250ul cDNA结合缓冲液；

[0092] ③将混合液过柱(kit内提供)，离心后去滤液；

[0093] ④加入500ul清洗缓冲液清洗柱子，离心后去滤液；

[0094] ⑤加10ul预热的RNAase-free水于柱子中央，溶解2min后离心，再加10ul预热的RNase-free水溶解一次。

[0095] 步骤4：体外转录(IVT)合成cRNA

[0096] ①干燥cDNA；

[0097] ②每个样品加入10ul IVT反应混合液(kit内提供)；

[0098] ③置于杂交炉中37度反应4-14h；

[0099] ④每个样品加入75ul RNase-free水终止反应。

[0100] 步骤5：cRNA纯化

[0101] ①预热RNAase-free水到50-60度；

[0102] ②每个反应产物中加入350ul cRNA结合缓冲(kit内提供)和250ul无水乙醇，充分混匀；

[0103] ③立即过纯化柱，离心后去滤液；

[0104] ④过纯化柱(kit内提供)；

[0105] ⑤加入650ul清洗缓冲液清洗柱子，离心后去滤液；

[0106] ⑥加100ul 50-55度预热的RNase-free水于柱子中央，溶解2min，离心收集cRNA。

[0107] (2)芯片杂交：

[0108] ①应用NanoDrop ND-1000紫外分光光度仪进行cRNA定量，上样量1500ng上样体积20ul。

[0109] ②准备芯片杂交盒，将足量cRNA样本与20ul杂交缓冲液HYB混合后点于芯片上，杂交炉中58度过夜杂交18h。

[0110] ③芯片洗脱：清洗缓冲液High-Temp Wash Buffer洗脱10min，Wash E1BC洗脱5min，无水乙醇洗脱10min，Wash E1BC再次洗脱2min。

[0111] ④芯片封闭：封闭缓冲液Block E1 Buffer封闭10min。

[0112] ⑤芯片染色和干燥：Streptavidin-Cy3染色10min，再次用Wash E1BC洗脱芯片5min，离心4min甩干。

[0113] (3)芯片扫描与数据分析：

[0114] 该芯片包含25440个人类注释基因，利用Illumina BeadArray Reader进行芯片扫描，所有扫描图像用BeadStudio软件进行数据分析。

[0115] 4.Illumina mRNA表达谱芯片

[0116] 4.1主要试剂

[0117]试剂名称 产品编号 生产厂家
TaqMan MicroRNA Assays ABI
has-miR-181d #4373180
has-miR-518b #4373246
has-miR-524-5p #4395174
has-miR-566 #4380943
has-miR-1227 #4409021
U6rRNA #4395470
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit #4366596 ABI
TaqMan 2×Universal PCR Master Mix #4324018 ABI
DEPC处理水 100ml Invitrogen

[0118] 4.2实验步骤

[0119] (1)样本RNA线性扩增：实验流程如下，具体请参见Illumina TotalPre RNA Amplification Kit说明书。

[0120] 步骤1：反转录合成第一链cDNA

[0121] ①取样本RNA 500ng加RNase-free水成11ul体系；

[0122] ②加入9ul反转录反应混合液(kit内提供)，充分混匀；

[0123] ③置于杂交炉42度反应2h。

[0124] 步骤2：合成第二链cDNA

[0125] ①每个样品加80ul第二条cDNA链合成混合液(kit内提供)，充分混匀；

[0126] ②置于杂交炉16度反应2h。

[0127] 步骤3：cDNA纯化

[0128] ①预热RNAase-free水到50-55℃；

[0129] ②每个样品加入250ul cDNA结合缓冲液；

[0130] ③将混合液过柱(kit内提供)，离心后去滤液；

[0131] ④加入500ul清洗缓冲液清洗柱子，离心后去滤液；

[0132] ⑤加10ul预热的RNAase-free水于柱子中央，溶解2min后离心，再加10ul预热的RNase-free水溶解一次。

[0133] 步骤4：体外转录(IVT)合成cRNA

[0134] ①干燥cDNA；

[0135] ②每个样品加10ul IVT反应混合液(kit内提供)；

[0136] ③置于杂交炉中37度反应4-14h；

[0137] ④每个样品加入75ul RNase-free水终止反应。

[0138] 步骤5：cRNA纯化

[0139] ①预热RNAase-free水到50-60度；

[0140] ②每个反应产物中加入350ul cRNA结合缓冲(kit内提供)和250ul无水乙醇，充分混匀；

[0141] ③立即过纯化柱，离心后去滤液；

[0142] ④过纯化柱(kit内提供)；

[0143] ⑤加入650ul清洗缓冲液清洗柱子，离心后去滤液；

[0144] ⑥加100ul 50-55度预热的RNase-free水于柱子中央，溶解2min，离心收集cRNA。

[0145] (2)芯片杂交：

[0146] ①应用NanoDrop ND-1000紫外分光光度仪进行cRNA定量，上样量1500ng，上样体积20ul。

[0147] ②准备芯片杂交盒，将足量cRNA样本与20ul杂交缓冲液HYB混合后点于芯片上，杂交炉中58度过夜杂交18h。

[0148] ③芯片洗脱：清洗缓冲液High-Temp Wash Buffer洗脱10min，Wash E1BC洗脱5min，无水乙醇洗脱10min，Wash E1BC再次洗脱2min。

[0149] ④芯片封闭：封闭缓冲液Block E1 Buffer封闭10min。

[0150] ⑤芯片染色和干燥：Streptavidin-Cy3染色10min，再次用Wash E1BC洗脱芯片5min，离心4min甩干。

[0151] (3)芯片扫描与数据分析：

[0152] 该芯片包含25440个人类注释基因，利用Illumina BeadArray Reader进行芯片扫描，所有扫描图像用BeadStudio软件进行数据分析。

[0153] 5 实时定量RT-PCR

[0154] 5.1主要试剂

[0155]

[0156] 5.2实验步骤

[0157] 实验流程如下，具体请参见ABI TaqMan MicroRNA Assays Protocol说明书。

[0158] (1)反转录反应：

[0159] ①总RNA样本：15ul反转录反应体系需要总RNA量为1-10ng。

[0160] ②配制反转录反应混合液7ul，成分如下，轻柔充分混匀。

[0161] ③取总RNA样本5ul，加入反转录反应混合液7ul，轻柔充分混匀；再加入反转录引物3ul，配制成反转录反应体系15ul，充分混匀后冰上孵育5min。

[0162] ④普通PCR仪进行反转录反应，反应条件如下。

[0163]成分 预混合体积/15μL反应
100mM dNTP(含有dTTP) 0.15
MultiScribeTM逆转录酶，50U/μL 1.00
10×逆转录缓冲液 1.50
RNase抑制剂，20U/μL 0.19
无核酸酶水 4.16
总体积 7.00

[0164]步骤类型 时间(min) 温度(℃)
保持 30 16
保持 30 42
保持 5 85
保持 ∞ 4

[0165] (2)PCR扩增反应：

[0166] ①准备PCR反应模板，成分如下。

[0167]

[0168] ②准备96孔PCR反应板，每例样本重复三次，充分离心避免气泡产生。

[0169] ③Real-Time PCR仪进行PCR扩增反应，反应条件如下。

[0170]

[0171] ④数据分析：观测扩增曲线图，设置基线和阈值；以U6rRNA为内源性对照，应用相对CT值的方法计算所检测microRNA的相对表达量。

[0172] 三、统计分析

[0173] 通过Illumina BeadArray Reader读取芯片结果，用Illumina BeadStudio软件分析。相关性进行卡方检验和单因素方差分析。每个miRNA检测变异系数(CV)，对CV＞0.8的miRNA进行进一步分析。用z值进行标准化。用单因素COX回归分析miRNA与生存期相关性。进行Benjamini-Hochberg错误发现率(FDR)修正后，筛选出9个候选miRNA进行进一步分析。对这些miRNA进行pearson相关和spearman相关分析。在所有分析中有显著相关性的miRNA与KPS评分，TMZ治疗和切除程度一起列入COX回归方程。所有统计分析应用Matlab 2009b，JMP(SAS Institute，Cary，NC)和GraphPad Prism(GraphPad Software，La Jolla，CA)统计软件

[0174] 四、细胞转染，免疫印记，荧光素酶报告分析，共沉淀研究

[0175] A1207细胞系在10％胎牛血清，1％Pen-Strep((Invitrogen，Carlsbad CA))培养基和5％CO2培养箱中孵育。miR-181d和对照miRNA通过Hyperfect转染进细胞(QIAGEN)，细胞培养72消失。总RNA用QIAGEN RNeasy kit(QIAGEN)提取，cDNA通过iScript cDNA synthesis kit(Biorad，Hercules，CA)生成。MGMT和ACTB cDNA水平通过qRT-PCR检测。免疫印记方法的原始抗体为anti-MGMT(Abcam，ab7045，1∶500)和α-微管蛋白(Sigma Aldrich，T9026，1∶3000)。

[0176] 荧光素酶报告分析

[0177] 1001bp的MGMT 3’UTR被扩增并克隆至pSiCheck-2双报告载体(Promega)。然后将带有pSi-Check-2-MGMT 3’UTR质粒或Psi-Check2质粒的miR-181d或对照miRNA共转染至A1207细胞系。试验依照制造商的说明书进行。为了检测miR-181d是否直接连接于MGMT的3’UTR端，用TargetScan4.2检测miR-181d结合位点。鉴定出2个位点(第5-27核苷酸和第226-248核苷酸)。合成跨第1-50和210-260核苷酸的合成寡核苷酸(Integrated DNA Technology，Coralville，Iowa)，并克隆至pSiCheck-2质粒(图2C，构建3和5)。miR-181d结合位点中每一个核苷酸的突变寡核苷酸也被克隆(图2C，构建4和
6)。所有克隆序列被DNA测序验证。

[0178] miRNA共沉淀分析

[0179] 用RNAiMax(Invitrogen)将40nM生物素化miR-181d和对照miRNA转染至A1207细胞系。转染72小时，细胞溶解(溶解缓冲液：700ul of 20mM Tris(pH7.5)，100mM KCl，5mM MgCl2，0.3 ％NonidetP-40，50U RNAseOUT(Invitrogen)，and 1∶ 50,000Protease Inhibitor Cocktail(Roche，Madison，WI))，离心(10,000xg，10min)，留取10％的溶解产物待进一步分析。上清液被链霉抗生素蛋白镀膜磁珠在4℃下混合4小时。清洗磁珠，并通过miRNAeasy kit(QIAGEN)提取缠绕mRNA，称为“解离”。总RNA用同样方法从溶解产物中提取。用MMLV-RT(Epicenter Biotechnology，Madison，WI)从溶解产物和解离RNA中合成cDNA和随机引物。随后进行qRT-PCR。

[0180] PCR引物

[0181] 用于扩增1,001bp的MGMT 3’UTR PCR引物：

[0182] MGMT 3’UTR正向引物：ACTCGAGTGCAGTAGGATGGATGTTTGA；

[0183] MGMT3’UTR 反向引物：

[0184] AGCGGCCGCATGCAGAGCTACAGGTTTCC；

[0185] 用于MGMT和ACTB的qRT PCR的PCR引物：

[0186] MGMT正向引物：CCTGGCTGAATGCCTATTTC；

[0187] MGMT_R：GATGAGGATGGGGACAGGATT；

[0188] ACTB正向引物：TGAAGTGTGACGTGGACATC；

[0189] ACTB反向引物：GGAGGAAGCAATGATCTTGAT；

[0190] 用于荧光素酶报告构建的PCR引物：

[0191] MGMT WT1-50正向引物：

[0192] TCGAGTATGTGCAGTAGGATGGATGTTTGAGCGACACACACGTGTAACACTGCA；

[0193] MGMT WT 1-50反向引物：

[0194] GGCCTGCAGTGTTACACGTGTGTGTCGCTCAAACATCCATCCTACTGCACATAC；

[0195] MGMT M1-50正向引物：

[0196] TCGATGCGTGTACTGCTTCGTTCGTGGGTCTATCACACACATTGTA；

[0197] ACACTGCA；MGMT M 1-50反向引物：

[0198] GCCTGCAGTGTTACAATGTGTGTGATAGACCCACGAACGAAGCAGTACACGCA；

[0199] MGMT WT 210-260正向引物：

[0200] TCGACTATTTTTCATGTCCATTAAAACAGGCCAAGTGAGTGTGGAAGGCCTGGCT；

[0201] MGMT WT 210-260反向引物：

[0202] GGCCAGCCAGGCCTTCCACACTCACTTGGCCTGTTTTAATGGACATGAAAAATAG；

[0203] MGMT M 210-260正向引物：

[0204] TCGACTATTTTTCATTGAACGGCCCCACTTAACCTGTCTGTGTGAAGGCCTGGCT；

[0205] MGMT M 210-260反向引物：

[0206] GCCAGCCAGGCCTTCACACAGACAGGTTAAGTGGGGCCGTTCAATGAAAAATAG。

[0207] 用于评估miR-181d表达的引物：Applied Biosystems：miR-181d(P/N：4373180)和U6rRNA内源性对照(P/N：4395470)。

[0208] TCGA数据库分析

[0209] 胶质母细胞瘤从TCGA数据库网站(http://tcgadata.nci.nih.gov/tcga/)下载，全部生物标本标签临床文件下载于2011年2月24日。下载标准化，下载Agilent miRNA芯片数据，miRNA取平均值。下载标准化和Agilent 244K基因表达芯片数据，并且基因取平均值。下载Illumina GoldenGate DNA甲基化芯片OMA-002level 2数据分析甲基化。用MGMT_P281_F探针决定MGMT甲基化状态，β值大于0.25被定义为甲基化。为了进行生存分析，我们将胶质母细胞瘤标本分为高miRNA表达(表达高于中位水平)和低miRNA表达。将病人依据TMZ治疗分组后，我们进行了重复性分析。

[0210] TCGA miRNA数据：unc.edu_GBM.H-miRNA_8x15K.Level_3.1.7.0[0211] TCGA Agilent 244K定制基因表达新品数据：

[0212] unc.edu_GBM.AgilentG4502A_07_2.Level_3.2.0.0

[0213] unc.edu_GBM.AgilentG4502A_07_2.Level_3.1.5.0

[0214] Illumina GoldenGate DNA甲基化试验OMA-002数据：

[0215] jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.1.3.0[0216] jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.2.4.0[0217] jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.3.1.0[0218] jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.4.1.0[0219] jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.5.1.0[0220] jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.6.1.0[0221] 验证组分析

[0222] 我们从哈尔滨医学中心收集了35例新诊断的胶质母细胞瘤标本，标本收集标准与实验组相同，用带有比较Ct方法的ABI 7900real-time PCR系统进行miR-181d水平的qRT-PCR检测，miR-181d表达水平通过Applied Biosystems检测。为了进行生存分析，我们将胶质母细胞瘤标本分为高miRNA表达(表达高于中位水平)和低miRNA表达。

[0223] 焦磷酸测序

[0224] 我们从天坛医院收集了20例独立胶质母细胞瘤标本进行焦磷酸测序，收集标准与实验组和验证组相同。通过QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN)从冰冻组织中提取DNA，用EpiTect Kit对DNA进行硫酸化修饰。用两个已知引物扩增MGMT 启动子区，5’-GGGATAAGTTGGGATAGTT-3’和5’ATTTGGTGAGTGTTTGGG-3’。这个区域包含12个CpG位点。PCR在40ul反应柱中进行，PCR的条件是：95℃-3min；40个循环：95℃-15s，52℃-30s，
72℃-30s；72℃-5min(ABI PCR system 9700)。通过QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)从总PCR产物中纯化DNA。并用5′-GGATATGTTGGGATAGT-3′引物进行焦磷酸测序((PyroMark Q96ID System(QIAGEN))。

[0225] 对MGMT启动子区得12个CpG位点进行焦磷酸测序。12个CpG位点在PCR反应中平均后获得每一个CpG位点的甲基化百分比。平均甲基化百分比大于9％被定义为胶质母细胞瘤标本MGMT甲基化。

[0226] 五.结果和分析

[0227] 1.miR-181d表达水平与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关

[0228] 为了检测miRNA在判断预后和预测治疗效果中的作用，我们对天坛医院收集的82例资料完备的胶质母细胞瘤样本(命名为“实验组”)进行分析，所有病人均接受放射治疗，部分病人辅助TMZ化疗。该组病人临床基本信息见表1。miRNA表达谱数据通过多重比较修正的COX模型进行分析，通过pearson和spearman相关方法进一步分析候选miRNA与总生存期的关系。经过三种方法的筛选，miR-936，miR-1238，miR-181d与总生存期相关。

[0229] 同时，手术切除程度(全切除对比次全切除)和病人基本信息(KPS评分，年龄，性别)也通过单因素COX回归进行分析。结果显示KPS评分，全切除，TMZ化疗与总生存期相关。我们继续将KPS评分，全切除，TMZ化疗与候选miRNA纳入多因素COX回归分析，结果显示全切除，TMZ化疗和miR-181d仍然与总生存期显著相关。与之前的研究不同，年龄和KPS评分在我们的回归分析中并未与总生存期显著相关。我们认为这可能与病人的选择性偏倚(以高龄患者为主)以及在中国KPS评分低的患者很少接受手术治疗等因素有关。

[0230] 我们继续在424例TCGA胶质母细胞瘤数据库中验证miR-181d与总生存期之间的关系，证实miR-181d表达高于中位水平的TCGA胶质母细胞瘤预后好于表达水平低于中位水平的胶质母细胞瘤病人。(p＝0.018)(图1a)。为了进一步证实，我们又对哈尔滨医科大学一组35例胶母独立样本(命名为“验证组”)进行qRT-PCR分析miR-181d表达情况，再一次验证miR-181d的表达和本组病人的总生存期呈负相关(p＝0.001)(图1b)[0231] 接下来，我们通过单因素COX回归检测miR-181d是否是预后或预测治疗反应的生物标记物，结果显示，无论在实验组或TCGA数据库(p值分别为0.004和0.036)或两组病人中接受TMZ治疗的病人(p值分别为0.010和0.089)，说明miR-181d对TMZ化疗有潜在的预测价值。

[0232] 2.MGMT是miR-181d的直接靶点

[0233] 生物信息学分析MGMT是miR-181d的潜在靶点。考虑到MGMT在TMZ化疗中的重要作用，我们认为miR-181d下调MGMT的表达，因此使胶母病人对TMZ化疗更敏感。将miR-181d质粒转染至A1207胶母细胞系会使MGMT在表达谱和蛋白水平表达下调。(图2a)我们进一步用pSiCheck-2荧光素酶报告分析方法评估MGMT是否为miR-181d的直接靶点。与对照miRNA相比，miR-181d使MGMT3’UTR端荧光素酶活性降低约2倍，这种结果并未在无3’UTR端的结构中发现。我们进一步用Targetscan方法确定了2个miR-181d结合位点，并对每一个推测位点在pSiCheck-2载体上克隆了50个核苷酸(图2c)。在转染miR-181d后，每一个推测位点的荧光素酶活性均下降约2倍。另外，该推测位点的突变，将使miR-181d的结合位点消失。为了显示miR181d和MGMT的直接关系，生物素化miR-181d和对照miR181d被转染进A1207细胞系，同时，mRNA-生物素化miRRNA复合体通过链霉抗生素蛋白珠解体。与对照miRNA相比，miR-181d解体后，MGMT表达增加了约2.5倍。(图2d)综上，miR-181d直接影响MGMT的转录并下调它的表达。

[0234] 3.MGMT转录水平与miR-181d水平呈负相关

[0235] miR-181d在转录后调节MGMT，我们发现miR-181d表达水平和MGMT转录水平呈负相关，通过分析223例TCGA数据库病人，结果显示miR-181d表达水平和MGMT转录水平呈负相关，但非显著相关，我们知道除了miR-181d调解，MGMT启动子区甲基化会影响MGMT转录水平。因此，我们用之前公布的标准在TCGA数据库中检测MGMT启动子区非甲基化的胶质母细胞瘤标本。在159个MGMT启动子区非甲基化标本中，MGMT转录水平与miR-181d水平呈负相关，我们又在一个20例胶质母细胞瘤标本的样本中进行分析MGMT启动子区甲基化，其中9例标本甲基化明显，所有甲基化肿瘤MGMTmRNA表达低或检测不到表达，其余11例标本MGMT转录水平与miR-181d水平呈负相关。

[0236] MGMT在预测TMZ化疗反应方面的重要作用已经广为人知，我们第一次提出miR-181d可以在转录后水平调控MGMT的表达，转染实验，荧光素酶报告分析，共沉淀实验证实miR-181d直接作用于MGMT3’UTR端调节MGMT转录后水平。胶质母细胞瘤标本miR-181d水平与MGMT转录水平的负相关也支持了这一假说。另外，在三个独立样本库(共计超过500例样本)中，miR-181d的高表达与预后良好相关。

[0237] 应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

[0238] 本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物意欲包含在所附的权利要求中。

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