福氏志贺菌血清型检测用引物和使用所述引物的多重扩增

摘要

本发明涉及福氏志贺菌血清型检测用引物，其包括以下序列：SEQ ID Nos.1和2、SEQID Nos.3和4、SEQ ID Nos.5和6、SEQ ID Nos.7和8、SEQ ID Nos.9和10、SEQ ID Nos.11和12、SEQ ID Nos.13和14、SEQ ID Nos.15和16。所述的引物具有特异性，退火温度一致。本发明还涉及利用所述引物进行多重扩增检测的方法。本发明进一步涉及所述福氏志贺菌血清型检测用引物在制备检测剂中的应用。本发明进一步涉及包含上述引物的福氏志贺菌血清型检测用试剂盒。

权利要求

1.一套福氏志贺菌(Shigella flexneri)血清型检测用引物，其包括选自以下序列的引物：SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、SEQ ID Nos.5和6、SEQ ID Nos.7和8、SEQ ID Nos.9和10、SEQ ID Nos.11和12、SEQ ID Nos.13和14、SEQ ID Nos.15和16。

2.根据权利要求1所述的福氏志贺菌血清型检测用引物，其还包括选自以下序列的引物：SEQ ID Nos.17和18。

3.一种多重扩增检测福氏志贺菌血清型的方法，该方法包括利用权利要求1或2所述的引物进行扩增。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述扩增为聚合酶链式反应。

5.根据权利要求3所述的方法，该方法进一步包括在所述扩增之后进行定性分析。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述的定性分析包括用凝胶电泳显示所述扩增的产物。

7.根据权利要求3所述的方法，该方法进一步包括：添加IV抗血清玻片凝集反应，进一步区分Xv与X血清型。

8.权利要求1或2所述的福氏志贺菌血清型检测用引物在制备检测剂中的应用，所述的检测剂用于检测福氏志贺菌血清型，或者用于检测包含福氏志贺菌的鉴别诊断用样品。

9.根据权利要求8所述的应用，所述的检测剂用于对排泄物、肠积液、呕吐物、土壤、水样、食品或化妆品进行检测。

10.一种福氏志贺菌检测用试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2所述的引物。

11.权利要求1或2所述的引物、或权利要求3～7任一项所述的方法、或权利要求10所述的试剂盒在鉴定福氏志贺菌血清型7a与7b中的应用。

说明书

福氏志贺菌血清型检测用引物和使用所述引物的多重扩增

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体是关于福氏志贺菌检测用引物和使用所述引物的多重扩增。

背景技术

[0002] 志贺菌(Shigella)是发展中国家细菌性腹泻的主要致病菌。每年全球有164.7百万人感染，导致11万人死亡，大多是5岁以下的儿童(Kotloff，K.L.，
J.P.Winickoff，B.Ivanoff，J.D.Clemens，D.L.Swerdlow，P.J.Sansonetti，G.K.Adak，and M.M.Levine.1999.Global burden of Shigella infections：implications for vaccine development and implementation of control strategies.Bull World Health Organ
77：651-66)。在志贺菌的四群中，福氏是影响贫穷人群的主要流行群。

[0003] 根据O抗结构的不同，福氏志贺菌分为不同的血清型。目前为止，至少15个血清型已经报道，分别是1a，1b，1c，2a，2b，3a，3b，4a，4b，5a，5b，X，Xv，Y和F6(Simmons，D.A.，and E.Romanowska.1987.Structure and biology of Shigella flexneri O antigens.J Med Microbiol 23：289-302；Stagg，R.M.，S.S.Tang，N.I.Carlin，K.A.Talukder，P.D.Cam，and N.K.Verma.2009.A novel glucosyltransferase involved in O-antigen modification of Shigella flexneri serotype 1c.J Bacteriol 191：6612-7；Ye，C.，R.Lan，S.Xia，J.Zhang，Q.Sun，S.Zhang，H.Jing，L.Wang，Z.Li，Z.Zhou，A.Zhao，Z.Cui，J.Cao，D.Jin，L.Huang，Y.Wang，X.Luo，X.Bai，P.Wang，Q.Xu，and J.Xu.2010.Emergence of a new multidrug-resistant serotype X variant in an epidemic clone of Shigella flexneri.J Clin Microbiol 48：419-26)。血清分型很早就应用于分离菌株的流病特征研究。

[0004] 除了F6外，所有的福氏志贺血清型LPS都具有相同的由四糖重复单位组成的多糖骨架，血清型Y具有基本的四糖骨架(Simmons，D.A.，and E.Romanowska.1987.Structure and biology of Shigella flexneri O antigens.J Med Microbiol 23：289-302.)，在骨架不同糖基上进行糖基化和或乙酰化修饰，导致不同的型(例如I，II，III，IV，V VI)、群(例如3；4，6，7；8)和1c抗原为点的出现(Stagg，R.M.，S.S.Tang，N.I.Carlin，K.A.Talukder，P.D.Cam，and N.K.Verma.2009.A novel glucosyltransferase involved in O-antigen modification of Shigella flexneri serotype 1c.J Bacteriol 191：6612-7)。

[0005] 三个基因(gtrA、gtrB和gtr(型))负责福氏志贺菌糖基化修饰。前两个基因高度同源，可以互换，但是第三个基因gtr(型)是唯一的，编码血清型特异的糖基转移酶 (Allison，G.E.，and N.K.Verma.2000.Serotype-converting bacteriophages and O-antigen modification in Shigella flexneri.Trends Microbiol 8：17-23；Stagg，R.M.，S.S.Tang，N.I.Carlin，K.A.Talukder，P.D.Cam，and N.K.Verma.2009.A novel glucosyltransferase involved in O-antigen modification of Shigella flexneri serotype 1c.J Bacteriol 191：6612-7)。型抗原I，II，IV，V，群抗原7；8和1c特异的gtr基因分别是gtrI，gtrII，gtrIV，gtrV，gtrX和gtrIC(Adams，M.M.，G.E.Allison，and N.K.Verma.2001.Type IV O antigen modification genes in the genome of Shigella flexneri NCTC 8296.Microbiology 147：851-60；Adhikari，P.，G.Allison，B.Whittle，and N.K.Verma.1999.Serotype 1a O-antigen modification：molecular characterization of the genes involved and their novel organization in the Shigella flexneri chromosome.J Bacteriol 181：4711-8；Guan，S.，D.A.Bastin，and N.K.Verma.1999.Functional analysis of the O antigen glucosylation gene cluster of Shigella flexneri bacteriophage SfX.Microbiology 145 1263-73；Huan，P.T.，D.A.Bastin，B.L.Whittle，A.A.Lindberg，and N.K.Verma.1997.
Molecular characterization of the genes involved in O-antigen modification，attachment，integration and excision in Shigella flexneri bacteriophage SfV.Gene 195：217-27；Mavris，M.，P.A.Manning，and R.Morona.1997.Mechanism of bacteriophage SfII-mediated serotype conversion in Shigella flexneri.Mol Microbiol 26：939-50；Stagg，R.M.，S.S.Tang，N.I.Carlin，K.A.Talukder，P.D.Cam，and N.K.Verma.2009.A novel glucosyltransferase involved in O-antigen modification of Shigella flexneri serotype 1c.J Bacteriol 191：6612-7)。Gtr基因是由宿主菌基因组中整合的前噬菌体携带的。O-乙酰化，它导致群抗原6和或型抗原III出现在1b，
3a，3b和4b血清型菌株中，是由噬菌体sf6携带的oac基因介导完成的(Clark，C.A.，J.Beltrame，and P.A.Manning.1991.The oac gene encoding a lipopolysaccharide O-antigen acetylase map s adj acent to the integrase-encoding gene on the genome of Shigella flexneri bacteriophage Sf6.Gene107：43-52；Verma，N.K.，J.M.Brandt，D.J.Verma，and A.A.Lindberg.1991.Molecular characterization of the O-acetyl transferase gene of converting bacteriophage SF6that adds group antigen 6 to Shigella flexneri.Mol Microbiol 5：71-5)。不同的血清型菌株携带血清型特异的一个或多个前噬菌体，他们编码不同的O抗修饰特异基因(参见图1所示)。

[0006] 用针对福氏志贺菌特异的型和群因子的兔源抗血清进行的玻片凝集法是目前确定福氏志贺血清型的常规方法。商用诊断血清已经广泛应用于微生物实验室。但是，这种方法有一些缺点，首先，玻片凝集法确定一个福氏菌株的血清型需要多达10个反应试验，分别用型抗原I，II，III，IV，V，VI，群抗原3；4，7；8，6和针对1c血清型的单克隆 抗 体MASFlc(Stagg，R.M.，P.D.Cam，and N.K.Verma.2008.Identification ofnewly recognized serotype 1c as the most prevalent Shigella flexneri serotype in northern rural Vietnam.Epidemiol Infect 136：1134-40；Talukder，K.A.，Z.Islam，M.A.Islam，D.K.Dutta，A.Safa，M.Ansaruzzaman，A.S.Faruque，S.N.Shahed，G.B.Nair，and D.A.Sack.2003.Phenotypic and genotypic characterization of provisional serotype Shigella flexneri 1c and clonal relationships with 1a and 1bstrains isolated in Bangladesh.J Clin Microbiol 41：110-7；Ye，C.，R.Lan，S.Xia，J.Zhang，Q.Sun，S.Zhang，H.Jing，L.Wang，Z.Li，Z.Zhou，A.Zhao，Z.Cui，J.Cao，D.Jin，L.Huang，Y.Wang，X.Luo，X.Bai，P.Wang，Q.Xu，and J.Xu.2010.Emergence of a new multidrug-resistant serotype X variant in an epidemic clone of Shigella flexneri.J Clin Microbiol 48：419-26)；其次，玻片凝集法中通过目测判断结果会导致错误的结果；最后，昂贵的抗血清试剂盒限制了这种方法在发展中国家实验室的应用。

[0007] 因此，发展基于PCR等分子生物学技术的快速、特异的鉴定方法，对于及时、准确鉴定福氏志贺菌血清型具有重要意义。

发明内容

[0008] 本发明的一个目的在于基于福氏志贺菌O抗修饰基因的研究，提供一套福氏志贺菌血清型检测用引物，用于多重扩增鉴定福氏志贺菌血清型。

[0009] 本发明的另一目的在于提供所述引物的应用，具体包括其在检测福氏志贺菌血清型中的应用，以及在制备福氏志贺菌血清型检测用制剂中的应用。

[0010] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述引物多重扩增检测福氏志贺菌血清型的方法。

[0011] 本发明的另一目的在于提供一种福氏志贺菌血清型检测用制剂如试剂盒。

[0012] 一方面，本发明根据gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX、wzx1-5和gtrIC基因，设计提供了一套福氏志贺菌血清型检测用多重扩增引物。其中包括分别为检测以下目标基因：gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX、wzx1-5和gtrIC基因的扩增引物。在本发明的一具体实施例中，根据已知的gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX、wzx1-5和gtrIC基因序列，设计了具特异性的、退火温度一致的扩增引物，具体为本发明的以下扩增引物：SEQ ID No.1和2，用于扩增gtrI基因片段；SEQ ID No.3和4，用于扩增gtrII基因片段；SEQ ID No.5和6，用于扩增oac基因片段；SEQ ID No.7和8，用于扩增gtrIV基因片段；SEQ ID No.9和10，用于扩增gtrV基因片段；SEQ ID No.11和12，用于扩增gtrX基因片段；SEQ ID No.13和14，用于扩增wzx1-5基因片段；以及SEQ ID No.15和16，用于扩增gtrIC基因片段。

[0013] 本发明的引物，可用于定性检测福氏志贺菌血清型。除了血清型Xv不能区分于X血清型外，目前已知的所有血清型都能够成功地鉴定血清型。

[0014] 根据本发明的一优选具体实施方案，本发明提供的一套福氏志贺菌血清型检测用引物，其还包括：针对F6的特异引物。F6血清型的平均分离率在亚洲为6％，范围从0％(中国)到15％(巴基斯坦)(von Seidlein，L.，D.R.Kim，M.Ali，H.Lee，X.Wang，V.D.Thiem，G.Canh do，W.Chaicumpa，M.D.Agtini，A.Hossain，Z.A.Bhutta，C.Mason，O.Sethabutr，K.Talukder，G.B.Nair，J.L.Deen，K.Kotloff，and J.Clemens.2006.A multicentre study of Shigella diarrhoea in six Asian countries：disease burden，clinical manifestations，and microbiology.PLoS Med 3：e353)。在F6流行的国家添加F6特异的单重PCR是必要的。但是由于本发明的多重扩增引物中已经包含8对引物，再添加一对引物增加了多重PCR优化的困难性。因此，在多重PCR中将扩增阴性的菌株归于F6血清型应当慎重。根据本发明的优选实施方案，是采用一个单重PCR用于F6的确认，所述的用于鉴定F6的引物对为：SEQ ID No.17和18，用于扩增wzx6基因片段。另外，既然在进行多重PCR前，菌株都经过志贺和B群多价抗血清的验证，因此F6假阳性的可能性较小。

[0015] 另一方面，本发明还提供了所述引物的应用，所述的应用具体包括所述引物在检测福氏志贺菌血清型中的应用，以及所述引物在制备福氏志贺菌血清型检测用制剂中的应用。

[0016] 根据本发明提供的所述引物在检测福氏志贺菌血清型中的应用，本发明还建立起一套快速、灵敏、易于推广使用的扩增检测福氏志贺菌血清型的方法，其具体为多重扩增检测方法，该方法包括利用本发明的引物进行多重扩增检测，优选所述扩增为聚合酶链式反应(PCR)。由于与常规扩增技术相比，多重扩增技术涉及多对引物和多对模板，随着引物对数的增加，影响因素也更多，增加了得到错配扩增产物的机会。因此引物的设计至关重要。本发明在所设计的多对引物基础上，优选还对对反应体系和条件特别是对退火温度进行了优化。在PCR中，PCR系统是由耐热DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸、待扩增的DNA模板和缓冲液组成。本发明提供一种优选的PCR反应，其条件为：95℃预变性15min；94℃变性30s，
55℃退火90s，72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

[0017] 对于本发明所述的多重扩增检测方法，优选进一步包括在所述扩增之后进行定性分析分析。定性分析方法可以是本领域普通技术人员已知的，例如包括利用凝胶电泳显示所述扩增产物，本领域技术人员可根据扩增产物的大小，确定所用的凝胶和浓度。

[0018] 为了判断本发明的方法的有效性，本发明在具体实施例中利用本发明的引物，多重PCR扩增了目前常见的14个福氏志贺菌血清型菌株，分析了358株各种血清型福氏菌株，所检测菌株多重PCR结果与玻片凝集法符合率为f97.8％。为了评价本发明的引物的特异性，本发明还在具体实施例中检测了50株非福氏菌株，包括其它志贺群和肠道病原菌。这些菌扩增均为阴性，证明本发明的方法的特异性是100％。表明应用本发明的引物与扩增检测方法，可以及时、准确鉴定福氏志贺菌的血清型。

[0019] 根据本发明提供的所述引物在制备福氏志贺菌血清型检测用制剂中的应用，本发明中所述检测用制剂优选用于对分离的福氏志贺菌菌株进行检测。根据本发明的具体实施方案，所述的检测用制剂可以是试剂盒。所述检测剂可用于检测福氏志贺菌或包含福氏志贺菌的鉴别诊断用样品。在本发明中，检测剂优选用于对排泄物、肠积液、呕吐物进行检测。本发明的多重扩增引物以及多重扩增方法具有较高的特异性，可单独作为一种快速检测方法应用于离体病人样品(例如排泄物、肠积液、呕吐物等)、可能混有福氏志贺菌的水样、土壤、食品、化妆品等样品的检测，这些样品可以经过或不经过任何富集，可快速完成福氏志贺菌血清型的诊断和鉴别诊断。

[0020] 本发明还提供了一种福氏志贺菌血清型检测用试剂盒，该试剂盒包括本发明的所述引物。所述试剂盒还可以包括用于检测目标基因的目标检测探针，所述的目标检测探针如SEQID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25以及SEQ ID No.26。本发明的试剂盒可用于定性检测福氏志贺菌血清型。

[0021] 福氏志贺菌中，血清型X和Xv具有相同的扩增谱(wzx1-5和gtrX)。因此多重PCR法将他们归于相同的血清型Xv或X。Xv曾经是中国2002年以来最流行的血清型(Ye，C.，R.Lan，S.Xia，J.Zhang，Q.Sun，S.Zhang，H.Jing，L.Wang，Z.Li，Z.Zhou，A.Zhao，Z.Cui，J.Cao，D.Jin，L.Huang，Y.Wang，X.Luo，X.Bai，P.Wang，Q.Xu，and J.Xu.2010.Emergence of a new multidrug-resistant serotype X variant in an epidemic clone of Shigellaflexneri.J Clin Microbiol 48：419-26)，最初被命名为4c，因为它能与型IV抗血清和群7；8抗血清反应(Pryamukhina，N.S.，and N.A.Khomenko.1988.Suggestion to supplement Shigella flexneri classification scheme with the subserovar Shigella flexneri 4c：phenotypic characteristics of strains.J Clin Microbiol
26：1147-9)。但是，IV抗原决定因子并没有明确(Ye，C.，R.Lan，S.Xia，J.Zhang，Q.Sun，S.Zhang，H.Jing，L.Wang，Z.Li，Z.Zhou，A.Zhao，Z.Cui，J.Cao，D.Jin，L.Huang，Y.Wang，X.Luo，X.Bai，P.Wang，Q.Xu，and J.Xu.2010.Emergence of a new multidrug-resistant serotype X variant in an epidemic clone of Shigella flexneri.J Clin Microbiol
48：419-26)，因此，目前还没有办法发展PCR方法来分型Xv。为区分Xv与X血清型，添加IV抗血清玻片凝集反应是需要的。

[0022] 综上所述，本发明设计了特异、退火温度一致的福氏志贺菌血清型检测用引物，建立了基于福氏志贺菌O抗原修饰酶基因的多重PCR检测方法。本发明的多重PCR方法可用于对福氏志贺菌血清型进行分子生物学鉴定，只需要一个反应，目前已知的大多数血清型(15中的14种)能够被容易和特异地鉴定。比较于传统的玻片凝集法(需要多达10个独立的发应)，本发明的多重PCR方法能节省时间，而且不需要昂贵的抗血清，特别适合高通量检测；在3.5小时内，96个样本即可完成检测；而且花费只有玻片法的25％。本发明的扩增引物以及多重扩增方法可作为血清凝集方法的补充和完善，用于福氏志贺菌血清型的鉴定，对于及时、准确鉴定临床分离病原菌的血清型及细菌性痢疾的防治具有重要的实际意义和应用价值。

附图说明

[0023] 图1为不同血清型福氏志贺菌O抗化学组成及特异修饰基因。

[0024] 图2为利用本发明的方法对14个血清型参考菌株进行多重PCR扩增结果。其中，M1，M2为150bp和100bp DNA Ladder Marker(购自TaKaRa，Japan)。

[0025] 图3为对50株非福氏菌株特异性检测结果。其中，M：marker；C：阳性对照；1-2：宋内志贺I，II相；3-14：痢疾志贺血清型1-12；15-32：鲍氏志贺血清型1-18；
33-34：Enteroaggregative E.coli；35-37：Enterohemorrhagic E.coli O157:H7；38：
EnteroinvasiveE.coli；39：Enteropathogenic E.coli；40：Enterotoxigenic E.coli；
41：Uropathogenic E.coli；42-43：E coli K12；44：Lmonocytogenes；45：V.cholera；46：
Salmonellaparatyphi A；47-48：Salmonellaparatyphi B；49：Yersinia enterocolitica；
50：Salmonella choleraesuis。

具体实施方式

[0026] 为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。

[0027] 实施例

[0028] 材料和方法

[0029] 菌株：本实施例中采用14个已知的血清型福氏志贺菌(除了血清型5b，具体请参见表1)用于多重PCR方法条件的建立。总共358福氏志贺菌(表2)用于本发明多重PCR方法有效性的评价。为检测本研究中引物的交叉反应(cross-reaction)，检测了50株不同菌属的菌株(S.Sonnei(n＝2)，S.dysenteriae(n＝12，包括全部12种血清型)，S.boydii(n＝18，包括全部18血清型)，Enteroaggregative E.coli(n＝2)，Enterohemorrhagic E.coli O157:H7(n＝3)，Enteroinvasive E.coli(n＝1)，Enteropathogenic E.coli(n＝1)，Enterotoxigenic E.coli(n＝1)，Uropathogenic E.coli(n＝1)，E coli K 12(n＝2)，L monocytogenes(n＝1)，V.cholera(n＝1)，Salmonella paratyphi A(n＝1)，Salmonella paratyphi B(n＝ 2)，Yersinia enterocolitica(n ＝1)，和 Salmonella choleraesuis(n＝1))。所有福氏菌株的血清型经过多价抗血清(购自Denka Seiken，Japan)和单克隆抗体(购自Reagensia AB，Sweden)的验证。本实施例中的所用的所有中国菌株分离自中国的腹泻病人，保存于中国疾病预防控制中心传染病预防控制所微生物实验室；其它菌株购自National Collection of Type Cultures(NCTC)，UK。

[0030] DNA模板的制备

[0031] DNA模板通过煮沸法，直接从细菌克隆中得到。首先在LB平板上过夜培养的一个单克隆放于30μl蒸馏水中，100℃煮沸10min，冰浴5min，4℃13000g离心10min。上清用于PCR扩增的模板。

[0032] PCR引物

[0033] 本实施例中所用的PCR引物列于下表3，用于扩增wzx基因的引物参考Yayue Li et al(Li，Y.，B.Cao，B.Liu，D.Liu，Q.Gao，X.Peng，J.Wu，D.A.Bastin，L.Feng，and L.Wang.2009.Molecular detection of all 34 distinct O-antigen forms of Shigella.J Med Microbiol 58：69-81)的设计，其它引物根据福氏志贺菌血清型特异基因gtrI，gtrIC，gtrII，oac，gtrIV，gtrV，and gtrX序列设计。

[0034] 各引物委托Sangon Biotech(上海)合成，溶于TE缓冲液(10mM Tris-Cl，1mM EDTA，pH 8.0)中，最终浓度为50μM。

[0035] PCR扩增和检测

[0036] 多重PCR采用QIAGEN Multiplex PCR Kit(QIAGEN)进行。每个PCR反应混合物包含1×PCR Master Mix(containing HotStarTaq DNA polymerase，Multiplex PCR buffer，和dNTP Mix)，每个引物0.2μM，3μl DNA模板，总量50μl。PCR扩增根据试剂盒说明书提供的PCR条件，对本实施例所采用的多重PCR循环参数进行了优化：95℃预变性15min；94℃变性30s，55℃退火90s，72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃延伸10min。扩增在SENSO(German)扩增仪上进行。5微升扩增产物与上样缓冲液混合，在1.5％琼脂糖胶上电泳分离，采用EB染观测结果。如果需要，PCR产物直接进行测序或克隆入pMD20-T TA cloning vector(TaKaRa，Japan)进行克隆测序。

[0037] 实验结果

[0038] 本实施例中，首先用引物对参考菌株进行单重PCR，结果每对引物都能扩增得到预期的片段，分别是783bp(wzx1-5)，1122bp(gtrI)，518bp(gtrIC)，1268bp(gtrII)，604bp(oac)，378bp(gtrIV)，905bp(gtrV)和425bp(gtrX)。对PCR扩增产物测序也证实了扩增片段的正确。接着，按照前述材料与方法中的方案进行多重PCR，我们尝试了退火温度从54℃to 63℃，在55℃产量最高。结果显示不同的血清型具有不同的扩增谱(参见图2和表1)。每种血清型扩增得到预期的特异PCR产物。扩增片段的大小能够在1.5％胶上很好分离，当使用两种DNA marker 2时，每个PCR产物都能正确判断大小。对参考菌株的扩增谱如下：1a (wzx1-5，gtrI)，1b(wzx1-5，gtrI，oac)，1c(wzx1-5，gtrI，gtrIC)，2a(wzx1-5，gtrII)，2b(wzx1-5，gtrII，gtrX)，3a(wzx1-5，oac，gtrX)，3b(wzx1-5，oac)，4a(wzx1-5，gtrIV)，
4b(wzx1-5，gtrIV，oac)，5a(wzx1-5，gtrV)，X，Xv(wzx1-5，gtrX)和Y(wzx1-5).wzx1-5也可用于PCR反应的内对照，因为它出现在除F6血清型以外的所有福氏志贺菌血清型中。F6扩增没阴性，因为他的O抗合成基因完全不同于其它血清型，也没有修饰基因(Cheah，K.C.，D.W.Beger，and P.A.Manning.1991.Molecular cloning and genetic analysis of the rfb region from Shigella flexneri type 6 in Escherichia coli K-12.FEMS Microbiol Lett 67：213-8；Simmons，D.A.，and E.Romanowska.1987.Structure and biology of Shigella flexneri O antigens.J Med Microbiol 23：289-302)。

[0039] 本实施例中，尝试在反应中增加一对针对F6的特异引物，但是由于在反应中已经包含8对引物了，添加一对引物增加了多重PCR优化的困难性。因此试验了3对引物后(根据F6特异的O抗原wzx6.序列设计)，没有得到好的结果。在多重PCR中将扩增阴性的菌株归于F6血清型应当慎重。根据本发明的优选实施方案，采用一个单重PCR用于F6的确认，引物参见表3，扩增长度为739bp。另外，既然在进行多重PCR前，菌株都经过志贺和B群多价抗血清的验证，因此F6假阳性的可能性较小。

[0040] 需要注意的是扩增oac基因的引物是基于oac和oac1b(88％一致性)的保守区域设计的，保证了都能扩增。虽然没有5b血清型菌株，但是基于5b血清型的O抗修饰特性，可以预测这种血清型的扩增谱是905bp(gtrV)和425bp(gtrX)。由于没有1c血清型的典型菌株，本发明使用一株F1血清型菌株(untypable)，06HN081(这个菌株能与1c特异的单抗MASF1c反应)，用于检测1c血清型特异基因gtrIC。相对于典型的1c菌株(只与MASF1c反应)，这株F1(untypable)与MASF1c和群6抗血清都反应。相应地，编码MASF1c和群6抗原的gtrIC和oac基因鉴定都阳性。这些结果提示这种F1(untypable)菌株是由GtrIC修饰1b血清型O抗原转化而来，是一种新的血清型(参见表1)。这种新的血清型与Forster et al报道的7b血清型菌株具有相同的血清反应谱，因此06HN081的血清型应该是7b。注意Forster et al.命名1c为7a(Foster，R.A.，N.I.Carlin，M.Majcher，H.Tabor，L.K.Ng，and G.Widmalm.Structural elucidation of the O-antigen of the Shigella flexneri provisional serotype 88-893：structural and serological similarities with S.flexneri provisional serotype Y394(1c).Carbohydr Res 346：872-6)。因此本发明的多重PCR能鉴定这两种新的血清型。本发明还提供了所述的引物、多重PCR方法及所述的试剂盒在鉴定这两种新的血清型中的应用。

[0041] 血清型X和Xv具有相同的扩增谱(wzx1-5和gtrX)。因此多重PCR法将他们归于相同的血清型Xv或X。

[0042] 为评价引物的特异性，本实施例检测了50株非福氏菌株，包括其它志贺群和肠道病原菌。这些菌扩增均为阴性(请参见图3)。证明本发明的方法的特异性是100％。

[0043] 为了判断本发明的方法是否可以应用于所有的福氏菌株，并评价本发明方法的有效性，本实施例分析了358株各种血清型福氏菌株(参见表2)，除了8株外，所有的检测菌株多重PCR结果与玻片凝集法吻合，符合率为f97.8％。

[0044] 表1福氏志贺菌菌株血清型及多重PCR鉴定结果(Serotype characteristics of S.flexneri reference strains by agglutination and multiplex PCR)

[0045]

[0046] #非典型F1型，MASF1c和6抗血清均阳性

[0047] 表2358株福氏菌株血清型多重PCR与玻片凝集法一致性检测结果

[0048]

[0049] 表3本实施例所用引物

[0050]

[0051]

[0052] $引物对wzx6是用于确认F6血清型。

[0053] 本发明的多重PCR方法可用于对福氏志贺菌血清型进行分子生物学鉴定，只需要一个反应，目前已知的大多数血清型(15中的14种)能够被容易和特异地鉴定。比较于传统的玻片凝集法(需要多达10个独立的发应)，本发明的多重PCR方法能节省时间，而且不需要昂贵的抗血清，特别适合高通量检测；在3.5小时内，96个样本即可完成检测；而且花费只有玻片法的25％。