低甲基化基因PRDM16的应用方法

摘要

本发明涉及低甲基化基因PRDM16的应用，即用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂。特别是用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤预后的制剂。通过研究证实PRDM16在胶质瘤组织中因启动子发生低甲基化而高表达，将检测PRDM16基因低甲基化应用于胶质瘤预后预测，为预测胶质瘤病人的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和推广性。

权利要求

1.一种用于人脑胶质瘤预后预测的PRDM16基因启动子区甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括以下引物：F：5′GGGTTATTTGGGTTTTTTTAAAGT 3′，R：5′AAAACACTCAATCTAACACCCCTC 3′。

说明书

低甲基化基因PRDM16的应用方法

技术领域

[0001] 本发明涉及低甲基化基因PRDM16在制备脑胶质瘤病人预后预测试剂中的应用。

背景技术

[0002] 在肿瘤的发生/发展过程中DNA甲基化谱式发生明显改变，表现为全基因组的低甲基化以及某些特定基因启动子区CpG岛的高甲基化，进来的大量研究显示多种肿瘤中也存在单拷贝基因与重复序列的低甲基化，并且低甲基化在肿瘤的发生发展中发挥着非常重要的作用。DNA甲基化变异在肿瘤发生/发展过程中作用越来越得到认可。随着对DNA甲基化认识的深入，人们逐渐认识到DNA异常甲基化可作为生物学标志物用于疾病的诊断和疗效及转归判断。例如德国的Epigenetics公司开发的SEPTIN9甲基化已经进入临床试验阶段。

[0003] 脑胶质瘤是人类中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占神经系统肿瘤的40.49％。其发生机制尚不十分明确，大量研究表明表观遗传机制在胶质瘤的发生发展中发挥了重要作用。尽管目前采用手术治疗联合化疗和放疗的方法，胶质瘤病人的预后仍非常差。据报道，胶质瘤病人的5年生存率低于25％，而胶质瘤母细胞瘤的病人总生存时间平均为12.3个月。目前，对脑胶质瘤的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应对人脑胶质瘤进行预后判定的需求。因此，对人脑胶质瘤进行预后判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，一直是科学研究亟待解决的重要课题。

[0004] PRDM16(PR domain containing 16)也称MEL1，定位于1p36.32。GeneBank登录号NM_199454。在一部分骨髓异常增生综合症(MDS)及急性粒细胞白血病(AML)患者中发生t(1；3)(p36；q21)易位，而PRDM16则位于1p36.3断裂点附近，并且在t(1；3)(p36；q21)阳性的MDS或AML中特异性表达。该基因编码的蛋白是一个具有锌指结构的转录因子，N端含有PR结构域。染色体易位导致缺乏PR结构域的PRDM16蛋白剪切体在MDS与AML中高表达，这可能在MDS及AML的发生发展过程中发挥重要的作用。有研究表明，PRDM16能与Smad3相互作用。在胃癌细胞中，PRDM16的高表达与SKI的高表达密切相关，PRDM16与SKI共同抑制转化生长因子-β(TGF-β)信号通路。但是PRDM16在其他多种肿瘤中作用及机制尚不清楚。申请人用免疫组织化学法检测PRDM16蛋白在正常脑组织及脑胶质瘤组织中的表达，结果显示PRDM16在胶质瘤中表达增加(p＜0.05，图1)，但是各级别胶质瘤的表达无差异(p＞0.05)。亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)结果表明，PRDM16在胶质瘤中发生低甲基化，其在高级别胶质瘤(III级、IV级)中的甲基化频率较低级别(I级、II级)病人降低，差异有统计学意义(p＝0.048)，并且胶质瘤I级患者的瘤组织中PRDM16甲基化频率高于其他3个级别(p＜0.05)，而II级、III级与IV级间甲基化频率无差异(p＞0.05)。然后用SPSS 13.0软件对PRDM16蛋白表达与PRDM16基因低甲基化进行相关性分析，结果表明两者间存在相关性(p＜0.05)，说明表观遗传学可能参与了PRDM16基因的表达调控。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种低甲基化基因PRDM16的应用方法，对于脑胶质瘤的预后预测具有重要意义。

[0006] 低甲基化基因PRDM16用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂；特别是用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查的试剂盒。

[0007] 如：用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤的制剂；所述的制剂中包括：根据PRDM16基因启动子区CpG岛设计的，采用亚硫酸氢盐直接测序法的引物序列为：

[0008] F：5′GGGTTATTTGGGTTTTTTTAAAGT 3′，

[0009] R：5′AAAACACTCAATCTAACACCCCTC 3′。

[0010] 一种用于人脑胶质瘤预后预测的PRDM16基因启动子区甲基化检测试剂盒，包括以下引物：

[0011] F：5′GGGTTATTTGGGTTTTTTTAAAGT 3′，

[0012] R：5′AAAACACTCAATCTAACACCCCTC 3′。

[0013] 申请人发现PRDM16基因在脑胶质瘤组织中表达上调(图1)。PRDM16转录起始位点上游-500bp至-100bp为一典型的CpG岛(图2)，该CpG岛中CG位点在正常的脑组织中均处于高甲基化状态，而在PRDM16表达上调的脑胶质瘤组织中其甲基化程度降低(部分结果见图3)。PRDM16低甲基化的胶质瘤病人总生存率明显低于高甲基化的病人(图4)，提示PRDM16基因是胶质瘤中的低甲基化基因，是预测胶质瘤预后的分子标志。本发明为脑胶质瘤预后预测提供了强有力的技术支持和分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。

[0014] 申请人在上述研究基础上，制备了用于人脑胶质瘤预后预测的PRDM16基因启动子区甲基化检测试剂盒。该试剂盒包括PRDM16启动子区亚硫酸氢盐测序PCR试剂盒及用于检测PRDM16基因启动子区甲基化状态的引物。

附图说明

[0015] 图1PRDM16蛋白在正常脑组织及不同病理分级胶质瘤中的表达；

[0016] A：正常脑组织；B：胶质瘤WHO I级；C：胶质瘤WHO II级；D：胶质瘤WHO III级；E：胶质瘤WHO IV级；

[0017] 图2PRDM16基因启动子的活性区域-500bp至-100bp为一典型的CpG岛；

[0018] 浅蓝色区域为CpG岛，横坐标下红色竖线表示CG位点；

[0019] 图3BSP检测正常脑组织和胶质瘤组织中PRDM16基因启动子区甲基化状态；

[0020] 图中所示为部分结果，N2：第2例正常脑组织；N4：第4例正常脑组织；T2：第2例胶质瘤组织；T3：第3例胶质瘤组织。○表示非甲基化位点，●表示甲基化位点，每一行表示一个克隆中所有CG位点的甲基化状态，计算5个克隆中的甲基化比率进行比较。结果表明，正常脑组织中PRDM16基因启动子区CpG岛为高甲基化状态，而胶质瘤组织中该CpG岛发生低甲基化；

[0021] 图4PRDM16启动子低甲基化与胶质瘤病人预后的关系；

[0022] 绿色曲线表示PRDM16基因启动子甲基化的胶质瘤病人的生存状况及时间，蓝色曲线表示PRDM16基因启动子发生低甲基化的胶质瘤病人的生存状况及时间。用SPSS 13.0软件进行Kaplan-Meier检验，差异有统计学意义(p＝0.012)，说明PRDM16低甲基化的病人预后较高甲基化的病人差。

具体实施方式

[0023] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

[0024] 实施例1：

[0025] 采用Promoterscan，Genomatix Promoter Inspector及CpGplot等生物信息学软件对PRDM16基因5’端序列进行生物信息学分析，结果表明PRDM16基因的启动子区域可能位于-806至-46bp处(以起始密码子ATG中A为+1)。Methl primer express软件和在线软件Methprimer分析PRDM16启动子预测区域-500bp至-100bp，结果显示为一CpG岛，设计并合成PRDM16启动子区的甲基化引物，5′GGGTTATTTGGGTTTTTTTAAAGT 3′(F)，5′AAAACACTCAATCTAACACCCCTC 3′(R)，对10例正常脑组织进行经亚硫酸盐处理后的基因组测序(BSP)，发现PRDM16基因启动子CpG岛中CpG位点在正常的脑组织均处于甲基化状态。同时对不同级别脑胶质瘤组织标本(I级6例，II级20例，III级12例，IV级12例)50例，进行了PRDM16启动子区甲基化状态的检测，发现84％的脑胶质瘤组织中PRDM16的启动子区发生低甲基化，与正常脑组织比较，差异有统计学意义(p＜0.05)。高级别胶质瘤(III、IV级)的甲基化程度较低级别胶质瘤(I、II级)甲基化程度低(p＝0.048)，并且胶质瘤I级的PRDM16启动子区甲基化水平较II、III、IV级甲基化水平高，差异有统计学意义(p＜0.05)，而胶质瘤II，III，IV级中甲基化水平无显著差异(p＞0.05)。PRDM16启动子区低甲基化的病人预后较甲基化病人的差，差异有统计学意义(p＝0.012)。以上研究结果提示，PRDM16基因是一个新发现的脑胶质瘤低甲基化基因，是一个胶质瘤预后预测标志。

[0026] 操作步骤：

[0027] (一)亚硫酸氢盐修饰样品gDNA制备

[0028] 选择已商品化的亚硫酸氢盐修饰试剂盒。

[0029] (二)亚硫酸氢盐直接测序PCR(BSP)试剂盒的使用

[0030] 内容：该试剂盒包括：

[0031] 用于检测PRDM16基因启动子区甲基化的PCR引物：

[0032] F：5′GGGTTATTTGGGTTTTTTTAAAGT 3′，

[0033] R：5′AAAACACTCAATCTAACACCCCTC 3′。

[0034] PCR扩增体系(-20℃保存)。

[0035] 原理：利用甲基化引物进行PCR扩增PRDM16启动子区CpG岛。

[0036] 步骤：

[0037] 1 取经亚硫酸氢盐修饰后的样品gDNA4μl(总量约100ng)，加入含甲基化引物TM2μl的PCR扩增体系(50μl)，使用Takara公司的EmeraldAmp PCR Master Mix(含DNA聚合酶、缓冲液及dNTP混合物)进行扩增。

[0038] PCR扩增体系为：

[0039]

[0040] 2 加样后，置PCR仪进行PCR扩增，反应条件如下：

[0041]

[0042] (三)琼脂糖电泳，胶回收PCR产物

[0043] 将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳45min，经溴乙啶染色，紫外光下切胶，产物为472bp，胶回收试剂盒回收PCR产物

[0044] (四)连接胶回收产物至pGEM-T载体

[0045] 使用普洛麦格(北京)生物技术有限公司的pGEM-T easy载体体系(货号：A1360)[0046]

[0047] 除步骤(三)的产物外，其他试剂均包含在pGEM-T easy载体体系中[0048] (五)转化感受态

[0049] 1 将步骤3的混合物3-5μl加入大肠杆菌JM10950μl，置冰上15-30min；

[0050] 2 42℃1min(不能超过90s)；

[0051] 3 置冰上3-5min；

[0052] 4 向混合物中加入1ml无氨苄的LB液体培基，180rpm，37℃摇菌1h(可适当延长)；

[0053] 5 3500rpm，3min；

[0054] 6 将适量X-gal及IPTG涂于LB固体培基上，待液体干燥后备用；

[0055] 7 弃700μl上清，将剩下的液体重悬细菌，涂于加有氨苄的LB固体培基上，37℃培养12-16h。

[0056] (六)挑单克隆测序

[0057] 1 将长有细菌的LB固体培基置于4℃显色4-6h；

[0058] 2 挑取5个步骤(五)培育的阳性细菌单克隆(白色)加入至3ml的加有氨苄的LB液体培基中；

[0059] 3 230rpm，37℃摇菌12-16h；

[0060] 4 收细菌送测序；

[0061] 5 分析测序结果，计算样本甲基化频率，与正常脑组织中甲基化频率进行比较，确定样本中PRDM16基因启动子区CpG岛的甲基化状态；

[0062] 将10例正常脑组织及50例胶质瘤组织的亚硫酸氢盐直接测序PCR测序结果进行分析，计算每例病人PRDM16启动子区CpG岛甲基化频率(见表1)，正常脑组织中的甲基化频率为(77.3±6.6)％，胶质瘤组织中的甲基化频率为(26.6±20.9)％，经SPSS 13.0软件用独立样本T检验分析，差异有统计学意义，p＜0.05。

[0063] (七)预后判定

[0064] 与正常组织比较，认为甲基化频率低于等于47.5％为PRDM16低甲基化，在50例胶质瘤病人中有41人的PRDM16基因启动子发生低甲基化，这组病人的生存期较PRDM16基因启动子甲基化病人的短(p＝0.030)。因此，发明人认为PRDM16基因启动子区CpG岛低甲基化的胶质瘤病人可判定为预后较差。

[0065] 表1 PRDM16基因启动子区CpG岛在正常脑组织及胶质瘤组织中的甲基化状态及临床参数

[0066]

[0067]

[0068] N 表示正常脑组织，T表示胶质瘤组织，p＜0.05