嗜盐菌光敏蛋白-二氧化钛纳米管复合材料制备方法

摘要

本发明提供了一种嗜盐菌光敏蛋白-二氧化钛纳米管复合材料及其制备方法。光敏蛋白为嗜盐古菌视紫红质蛋白，通过改造大肠杆菌，使其大量表达视紫红质蛋白。超声破碎菌体后用β-巯基乙醇和肌氨酰将膜蛋白提取出，之后用TritonX-100处理。复合材料的制备方法是将二氧化钛纳米材料放入蛋白溶液中，抽真空处理一段时间，之后低温脱水处理，得到嗜盐菌光敏蛋白-二氧化钛纳米管复合材料。本发明所涉及的工艺流程简单，所用试剂价格低廉，该材料具有良好的可见光响应能力，能有效地减少光生电子-空穴对的复合几率，提高TiO2纳米管阵列的光电响应，在光电器件领域具有广阔的应用前景。

权利要求

1.嗜盐菌光敏蛋白-二氧化钛纳米管复合材料制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤1)将含有PET28aJ56质粒的大肠杆菌Rossetta菌株接种于LB固体培养基中，24小时后挑单克隆再接种于LB液体培养基中进行活化培养；

步骤2)将1ml活化培养好的大肠杆菌转接到250ml的LB液体培养基中进行扩大培养；

步骤3)将扩大培养好的大肠杆菌按照20ml的接种量转接到2L的LB液体培养基中，

37℃、200rpm培养2-3个小时，至OD600nm达0.6；

步骤4)在菌液中加入IPTG至终浓度1mM，加0.5%的视黄醛，37℃诱导4个小时；

步骤5)4000rpm离心20分钟，收菌体；

步骤6)在离心后的沉淀中加入0.01%β-巯基乙醇和10%的肌氨酰，重悬菌体，200W超声破碎30分钟；12000rpm离心20分钟，回收上清液；

步骤7)上清液加入0.5%TritonX-100，得到视紫红质蛋白溶液；

步骤8)将二氧化钛纳米材料放入蛋白溶液中，抽真空处理一段时间，之后10℃脱水处理，得到嗜盐菌光敏蛋白-二氧化钛纳米管复合材料；

所述的二氧化钛纳米材料是在钛金属基体表面制备一层TiO2纳米管阵列。

说明书

嗜盐菌光敏蛋白-二氧化钛纳米管复合材料制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物材料技术领域，涉及一种嗜盐菌光敏蛋白-二氧化钛纳米管复合材料制备方法。

背景技术

[0002] 菌紫质是一种具有光功能的蛋白质，是迄今为止所知道的最简单的光驱动质子泵。菌紫质吸收光子后,迅速从暗适应状态变为光适应状态,发生反式视黄醛分子的异构变化和质子化、去质子化,光循环过程中出现了一系列光学可分辨的中间态K、L、M、N、O,最后回到初始态。在此循环过程中,菌紫质在胞外释放质子,又从胞内摄取质子,建立膜两侧的电势差，即光电压，在电流计上可以测量到光电流信号。

[0003] 细菌视紫红质既可以利用光能合成腺苷三磷酸（ATP），类似于光合作用的功能，也可以在无光情况下进行氧化磷酸化，进行细菌生长繁殖。由于菌视紫红质在紫膜中有独特的结构和功能，所以无论在光能转换机理研究方面，还是作为纳米生物材料的应用方面都具有十分重要的意义。

[0004] 紫膜的结构和功能的特点，决定了紫膜材料可作为优良的纳米生物材料之一。它结构上的稳定性是一般的生物材料不可能达到的。也许由于二维六角型晶格结构的缘故，在器件所要求的干膜状态下，紫膜可以在－30℃到140℃的状态下不失去活性，此时一般的蛋白质早已变性。

[0005] 紫膜作为纳米生物材料可用于构造生物分子器件的内在原因在于：第一，光驱动质子泵的功能可实现太阳能转换成化学能和电能；第二，光照产生的分子内的电荷分离产生的光电特性可制成光电子器件；第三，细菌视紫红质光循环中间体之间产生的光致变色特性可用于光子器件。

[0006] 紫膜在嗜盐菌原生质膜上以碎片形式存在，直径大约为0.5微米，厚度5纳米，它与原生质膜上其余部分红膜共面。碎片中的唯一蛋白质细菌视紫红质以三体形。

[0007] 当细菌视紫红质在大肠杆菌中异元表达时，视紫红质也是位于膜上，在通常的研究方法中是通过加去垢剂的方法使膜上的蛋白溶解下来，但去垢剂往往十分昂贵，难以用于实际的工业大规模生产中。

[0008] 半导体光催化技术在利用太阳能方面有着广泛的应用前景。在众多的氧化物半导体光催化材料中，TiO2以其光诱导下的强氧化性、无毒和长期稳定性等优点在净化环境方面表现出很好的应用前景。但是，TiO2光催化材料的光生电子-空穴对复合几率较高；另一方面，锐钛矿型TiO2对太阳光的利用率低，这严重阻碍了TiO2光催化材料的工业化推广和应用。近十几年来，世界各国的科技工作者一直在努力地探索多种制备方法和改性手段以求提高TiO2光催化效率和对太阳光的利用率。

发明内容

[0009] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种嗜盐菌光敏蛋白-二氧化钛纳米管复合材料及其制备方法。

[0010] 本发明中的嗜盐菌光敏蛋白-二氧化钛纳米管复合材料结构为：在钛金属基体表面生长有一层TiO2纳米管阵列，在所述的TiO2纳米管阵列中TiO2纳米管内存在嗜盐菌光敏蛋白，所制备的TiO2纳米管阵列膜层厚度约4微米，纳米管的管径大小在20-70nm之间。

[0011] 嗜盐菌光敏蛋白-二氧化钛纳米管复合材料制备方法：通过转化质粒的方法改造大肠杆菌，使其大量表达视紫红质蛋白。超声破碎菌体后用β-巯基乙醇和肌氨酰将膜蛋白提取出，之后用TritonX-100处理。复合材料的制备方法是将二氧化钛纳米材料放入蛋白溶液中，抽真空处理一段时间，之后低温脱水处理，得到嗜盐菌光敏蛋白-二氧化钛纳米管复合材料。

[0012] 在本发明中通过加入0.01%β-巯基乙醇和10%的肌氨酰的方法，在破碎并离心后的上清中也看到了紫红色，说明有视紫红质蛋白从膜上溶解下来，这与不加0.01%β-巯基乙醇和10%的肌氨酰而直接破碎并离心后的上清颜色有明显的不同。0.01%β-巯基乙醇和10%的肌氨酰价格低廉，有大规模使用于生产中的前景。

[0013] 通过在TiO2纳米管阵列中嵌入嗜盐菌光敏蛋白来实现材料的光电转换特性。实验结果表明，在10℃条件下进行脱水处理后，该材料具有良好的可见光响应能力，能有效地减少光生电子-空穴对的复合几率，提高TiO2纳米管阵列的光电响应。

附图说明

[0014] 图1为扫描电子显微镜下的TiO2纳米管阵列图。

具体实施方式

[0015] 下面结合实施例对本发明作详细描述：

[0016] 实施例1

[0017] 将含有PET28aJ56质粒的大肠杆菌Rossetta菌株用划线法接种于含卡纳抗生素的灭过菌的LB固体培养基中。24小时后挑单克隆，接种于5ml含卡纳抗生素的LB液体培养液中，200rpm，37℃培养24小时进行活化。将1ml活化培养好的大肠杆菌转接到250ml的LB液体培养基中进行扩大培养。将扩大培养好的大肠杆菌按照20ml的接种量转接到2L的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养2-3个小时，期间经常测菌液在600nm处的吸光度OD值，直至OD值达0.6时在菌液中加入IPTG至终浓度1mM，加0.5%的视黄醛，37℃诱导4个小时。将已诱导表达视紫红质蛋白的菌液4000rpm离心20分钟，收菌体。向沉淀中加入0.01%β-巯基乙醇和10%的肌氨酰，重悬菌体，200W超声破碎约30分钟。12000rpm离心
20min，回收上清液。上清液加入0.5%TritonX-100，混匀，终止β-巯基乙醇和肌氨酰的作用，最终得到视紫红质蛋白溶液。将二氧化钛纳米材料放入蛋白溶液中，抽真空处理30min，之后10℃脱水处理，得到嗜盐菌光敏蛋白-二氧化钛纳米管复合材料，参见图1。

[0018] 上述LB培养基PH为7.0,固体培养基加6%琼脂；灭菌条件为121℃，0.1MPa,20min；卡纳浓度为千分之一。

[0019] 上述二氧化钛纳米材料是在钛金属基体表面制备一层TiO2纳米管阵列，所制备的TiO2纳米管阵列膜层厚度约4微米，纳米管的管径大小在20-70nm之间。

[0020] 实施例2

[0021] 将含有PET28aJ56质粒的大肠杆菌Rossetta菌株用划线法接种于含卡纳抗生素的灭过菌的LB固体培养基中。24小时后挑单克隆，接种于10ml含卡纳抗生素的LB液体培养液中，200rpm，37℃培养24小时进行活化。将2ml活化培养好的大肠杆菌转接到250ml的LB液体培养基中进行扩大培养。将扩大培养好的大肠杆菌按照10ml的接种量转接到2L的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养2-3个小时，期间经常测菌液在600nm处的吸光度OD值，直至OD值达0.5时在菌液中加入IPTG至终浓度1mM，加0.5%的视黄醛，37℃诱导4个小时。将已诱导表达视紫红质蛋白的菌液4000rpm离心20分钟，收菌体。向沉淀中加入0.01%β-巯基乙醇和10%的肌氨酰，重悬菌体，250W超声破碎约20分钟。12000rpm离心
20min，回收上清液。上清液加入0.5%TritonX-100，混匀，终止β-巯基乙醇和肌氨酰的作用，最终得到视紫红质蛋白溶液。将二氧化钛纳米材料放入蛋白溶液中，抽真空处理40min，之后10℃脱水处理，得到嗜盐菌光敏蛋白-二氧化钛纳米管复合材料。

[0022] 上述LB培养基PH为7.0,固体培养基加6%琼脂；灭菌条件为121℃，0.1MPa,20min；卡纳浓度为千分之一。

[0023] 上述二氧化钛纳米材料是在钛金属基体表面制备一层TiO2纳米管阵列，所制备的TiO2纳米管阵列膜层厚度约4微米，纳米管的管径大小在20-70nm之间。

[0024] 实施例3

[0025] 将含有PET28aJ56质粒的大肠杆菌Rossetta菌株用划线法接种于含卡纳抗生素的灭过菌的LB固体培养基中。24小时后挑单克隆，接种于5ml含卡纳抗生素的LB液体培养液中，200rpm，37℃培养24小时进行活化。将5ml活化培养好的大肠杆菌转接到2L的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养6-8个小时，期间经常测菌液在600nm处的吸光度OD值，直至OD值达0.4时在菌液中加入IPTG至终浓度1mM，加0.5%的视黄醛，37℃诱导4个小时。将已诱导表达视紫红质蛋白的菌液4000rpm离心20分钟，收菌体。向沉淀中加入0.01%β-巯基乙醇和10%的肌氨酰，重悬菌体，200W超声破碎约30分钟。12000rpm离心
20min，回收上清液。上清液加入0.5%TritonX-100，混匀,最终得到视紫红质蛋白溶液。将二氧化钛纳米材料放入蛋白溶液中，抽真空处理50min，之后10℃脱水处理，得到嗜盐菌光敏蛋白-二氧化钛纳米管复合材料。

[0026] 上述LB培养基PH为7.0,固体培养基加6%琼脂；灭菌条件为121℃，0.1MPa,20min；卡纳浓度为千分之一。

[0027] 上述二氧化钛纳米材料是在钛金属基体表面制备一层TiO2纳米管阵列，所制备的TiO2纳米管阵列膜层厚度约4微米，纳米管的管径大小在20-70nm之间。