一种提高蛋白表达效率的方法及表达载体转让专利
申请号 : CN201180001670.X
文献号 : CN102333870B
文献日 : 2014-01-29
发明人 : 张庆利 , 黄倢 , 刘笋 , 刘庆慧 , 史成银 , 梁艳
申请人 : 中国水产科学研究院黄海水产研究所
摘要 :
本发明涉及一种提高蛋白表达效率的表达载体，该表达载体起始密码子ATG后含有一段编码特定氨基酸片段的核苷酸，其特征在于：(a)上述的特定氨基酸为有4个或以上密码子的氨基酸；(b)上述的特定氨基酸片段的氨基酸残基数目不少于3个。另外，本发明还提供了一种提高目的基因蛋白表达效率的方法，该方法通过在目的基因的起始密码子ATG后插入一段编码特定氨基酸片段的核苷酸来实现，其中特定氨基酸为有4个或以上密码子的氨基酸且氨基酸残基数目不少于3个。本发明提供的提高基因蛋白表达效率的方法，不仅可以用于改造任意目的基因以提高其表达效率，还可以用于构建具有高表达效率特征的表达载体。与现有技术相比，利用本发明的载体或方法，可以使目的基因的蛋白表达效率提高2～5倍。
权利要求 :
1.一种提高蛋白表达效率的表达载体，该表达载体起始密码子ATG后含有一段编码特定氨基酸片段的核苷酸，其特征在于：所述的氨基酸片段的序列为SEQ ID NO:49。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于上述的氨基酸片段，其编码核苷酸的序列为SEQ ID NO:50-52。
3.一种提高目的基因蛋白表达效率的方法，该方法通过在目的基因的起始密码子ATG后插入一段编码特定氨基酸片段的核苷酸来实现，其特征在于：所述的氨基酸片段的序列为SEQ ID NO:49。
说明书 :
一种提高蛋白表达效率的方法及表达载体
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高蛋白表达效率的方法及表达载体。
背景技术
[0002] 外源基因在宿主细胞中的表达水平受多种因素的影响，如目的基因本身特性、转录效率、mRNA稳定性、翻译效率、蛋白质稳定性等等。目的基因序列本身的特征，如稀有密码子、终止子、二级结构等常会影响其蛋白的表达水平；如果目的基因含有较多的稀有密码子，常会造成重组蛋白的表达水平较低(Sorensen et al.，1989，J.Mol.Biol.207，365-377)；如果稀有密码子集中出现在氨基端，则情况更为严重(Chen and Inouye，1990，Nucl.Acids Res.18，1465-1473)；目的基因中碱基突变会产生意外的终止密码子从而导致蛋白翻译水平的下降；mRNA转录子中复杂的二级结构也会干扰翻译的起始和延伸(Tessier et al.1984，Nucl.Acids Res.12，7663-7675；Looman et al.1986，Nucl.Acids Res.14，5481-5496)。尽管目的基因mRNA的转录水平与其蛋白水平不完全一致，但目的基因mRNA的高转录效率和高转录产物的稳定性会在不同程度上提高目的蛋白的表达水平；
另外，重组蛋白的翻译效率不仅受目的基因序列本身的影响，也受载体序列的影响。重组蛋白的稳定性也会影响其在宿主细胞中的存在量。
另外，重组蛋白的翻译效率不仅受目的基因序列本身的影响，也受载体序列的影响。重组蛋白的稳定性也会影响其在宿主细胞中的存在量。
[0003] 外源目的基因的mRNA在宿主细胞中进行表达时，宿主细胞中tRNA的数量直接反映了该宿主物种mRNA的密码子偏倚性；一个或多个tRNA的稀有或缺少可能导致翻译的停止，tRNA不足可能导致翻译延迟、成熟前翻译终止、翻译移码和氨基酸错配(Ikemura1985，Mol.Biol.Evol.2，13-34)；尽管少量稀有密码子的出现通常不会对目的蛋白的合成造成太大影响，但是如果一个基因中含有成串或多个稀有密码子时，外源蛋白的表达将非常低、很难检测到，因此目的基因中含过多的稀有密码子被认为是低表达水平和产生不完全产物的一个原因(Blake RD et al.1984，J.Biomol.Stuct.Dyn.2，593-606；Robinson M et al.，1984，Nucleic.Acids Res.12，6663-6671)；而当在宿主菌中增加同类tRNA时那些含有稀有密码子基因的蛋白质产量将大大提高(Brinkmann U et al.1989，Gene，85，
109-114.)。所以人们在进行外源目的基因重组表达时，常对外源基因的序列进行改造，通过调整基因序列三联密码子最后一个碱基减少稀有密码子出现的频率以获得高的蛋白表达量；目前尚未见有人工改变目的基因起始密码子后紧邻氨基酸组成以提高蛋白表达量的文献或专利。
109-114.)。所以人们在进行外源目的基因重组表达时，常对外源基因的序列进行改造，通过调整基因序列三联密码子最后一个碱基减少稀有密码子出现的频率以获得高的蛋白表达量；目前尚未见有人工改变目的基因起始密码子后紧邻氨基酸组成以提高蛋白表达量的文献或专利。
[0004] 在影响外源基因表达水平的诸多因素中，表达载体的作用不可忽视，因为它不仅决定了重组质粒的拷贝数，也严重影响着mRNA的转录效率及稳定性、翻译起始的效率和重组蛋白的稳定性。研究发现，能够高效表达某一基因的表达载体对另一基因而言可能并不合适；所以在外源基因的重组表达中，往往需要根据实际情况，选择合适的表达调控元件，构建合适的表达载体。一般来说，构建的表达载体应满足以下要求：(1)蛋白表达量高，(2)宿主适用范围广，(3)表达的产物容易纯化。其中重组蛋白的表达量是优先考虑的指标。目前有关如何构建高效表达载体已有很多报道，研究多集中在重组质粒的元件包括启动子、多克隆位点、终止密码、融合蛋白标签、复制子、筛选标记/报告基因等方面，尚检索不到利用一些氨基酸的多密码子特性在起始密码子后添加人工序列构建高效表达载体的文献报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种提高蛋白表达效率的方法及表达载体，即应用本发明的方法或表达载体可提高外源基因在宿主中的表达效率，使目的基因获得高效率的表达，以弥补现有技术的不足。
[0006] 本发明根据生物体内常见氨基酸的密码子简并情况，在重组表达相关基因时在目的基因起始密码子或表达载体序列起始密码子后引入一定数目的编码多密码子(4个或以上密码子)氨基酸的核苷酸序列，这些编码多密码子氨基酸的核苷酸，其对应的tRNA含量丰富，可以快速运送相应氨基酸参与蛋白合成，从而避免目的基因序列或载体编码序列对应tRNA缺乏所导致的mRNA翻译延迟、移码或停止，有效提高翻译的起始、延伸效率，大大提高目的基因或载体融合的蛋白表达效率。
[0007] 本发明技术方案如下：
[0008] 一种提高蛋白表达效率的表达载体，该表达载体起始密码子ATG后含有一段编码特定氨基酸片段的核苷酸，其特征在于：
[0009] (a)所述的特定氨基酸为有4个或以上密码子的氨基酸；
[0010] (b)所述的特定氨基酸序列的氨基酸数目不少于3个。
[0011] (c)所述的表达载体，其特定氨基酸数目为3个、4个或5个。
[0012] (d)所述的表达载体，其特定氨基酸数目还可以是6个或7个。
[0013] (e)所述的表达载体为真核或原核表达载体。
[0014] 一种提高目的基因蛋白表达效率的方法，该方法通过在目的基因的起始密码子ATG后插入一段编码特定氨基酸片段的核苷酸来提到表达效率，其特征在于：
[0015] 所述的特定氨基酸序列为X1X2……Xn，其中X代表有4个或以上密码子的氨基酸，n大于或等于3；
[0016] 本发明提供的提高有用基因蛋白表达效率的方法，不仅可以用于改造任意目的基因以提高其表达效率，还可以用于构建具有高表达效率特征的表达载体。与现有技术相比，本发明有以下有益效果：利用本发明提供的提高基因蛋白表达效率的方法，可以用于改造任意目的基因，使目的蛋白的表达效率提高2～5倍；同时，利用本发明提供的方法，还可以对已有蛋白表达载体进行改造，使其蛋白表达效率提高。
具体实施方式
[0017] 实施例1在表达载体起始密码子后插入编码三个特定氨基酸序列的核酸序列来构建高效表达载体：
[0018] 一).在载体pGFPuv起始密码子后插入编码GlyGlySer(SEQ ID NO：1)的核酸序列：
[0019] 1).合成载体构建需要的各种引物
[0020] 根据pGFPuv载体的全序列设计一对用于验证pGFPuv载体的引物，上游 引 物 为 P1(pGFPuv-S)：GACATGA-GTAAAGGAGAAGAAC，下 游 引 物 P2(pGFPuv-A)：GCGTTATTTGTAGAGCTCAT。为在pGFPuv载体的第216位添加酶切位点Cla I，设计了上游引 物 P3(pGFPuv216-F)：CTCATCGATATGACCATGATTACG，下 游引 物 P4(pGFPuv216-R)：
GAGATCGATAGCTGTTTCCTGTG，上下游引物在5′端都加保护碱基CTC。另外又设计了用于插入编码GlyGlySer的核酸序列的引物p5和p6，上游引物P5(高效-F)：TCTATCGATATGGGGGGTTCTATGATTACGCCAAGCTTGCA，含有Cla I酶切位点及起始密码子ATG，下游引物P6(高效-R)：
TGCAAGCTTGGCGTAATCATAGAACCCCCCATATCGATAGA，含有Hind III酶切位点；通过该引物对可在原载体起始密码子位点后引入编码氨基酸GlyGlySer的核苷酸序列GGGGGTTCT(SEQ ID NO：2)，这三个氨基酸分别有4、4、6个简并密码子。
GAGATCGATAGCTGTTTCCTGTG，上下游引物在5′端都加保护碱基CTC。另外又设计了用于插入编码GlyGlySer的核酸序列的引物p5和p6，上游引物P5(高效-F)：TCTATCGATATGGGGGGTTCTATGATTACGCCAAGCTTGCA，含有Cla I酶切位点及起始密码子ATG，下游引物P6(高效-R)：
TGCAAGCTTGGCGTAATCATAGAACCCCCCATATCGATAGA，含有Hind III酶切位点；通过该引物对可在原载体起始密码子位点后引入编码氨基酸GlyGlySer的核苷酸序列GGGGGTTCT(SEQ ID NO：2)，这三个氨基酸分别有4、4、6个简并密码子。
[0021] 2).进行高效表达载体高效-GFPuv的构建
[0022] 以 P3(pGFPuv216-F)：CTCATCGATATGACCATGATTACG，P4(pGFPuv216-R)：GAGATCGATAGCTGTTTCCTGTG为引物，以pGFPuv质粒为模板克隆pGFPuv的全长，使pGFPuv质粒在216位断开，并使两端都加上酶切位点Cla I。PCR反应在50μl的总体积中进行，以
2μl的pGFPuv质粒为模板，反应条件为在95℃变性2min后开始循环，然后95℃变性20s，
42.3℃退火20s，72℃延伸1min 45s，8个循环后再95℃变性20s，49.8℃退火20s，72℃延伸1min 45s，30个循环后，在于72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳回收线性的p3p4GFPuv片段。用P5(高效-F)：TCTATCGATATGGGGGGTTCTATGATTACGCCAAGCTTGCA，P6(高效-R)：TGCAAGCTTGGCGTAATCATAGAACCCCCCATATCGATAGA，混合后退火形成p5p6双链DNA片段，退火反应条件为94℃，5min，53.1℃退火5min，72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳回收并纯化p5p6双链DNA片段。
2μl的pGFPuv质粒为模板，反应条件为在95℃变性2min后开始循环，然后95℃变性20s，
42.3℃退火20s，72℃延伸1min 45s，8个循环后再95℃变性20s，49.8℃退火20s，72℃延伸1min 45s，30个循环后，在于72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳回收线性的p3p4GFPuv片段。用P5(高效-F)：TCTATCGATATGGGGGGTTCTATGATTACGCCAAGCTTGCA，P6(高效-R)：TGCAAGCTTGGCGTAATCATAGAACCCCCCATATCGATAGA，混合后退火形成p5p6双链DNA片段，退火反应条件为94℃，5min，53.1℃退火5min，72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳回收并纯化p5p6双链DNA片段。
[0023] 回收的3.3Kb两端带有Cla I限制性位点的p3p4pGFPuv片段，用限制性内切酶Cla I和Hind III双酶切此片段，回收酶切后的3.3Kb的片段；同样用限制性内切酶Cla I和Hind III双酶切p5p6双链DNA片段，经琼脂糖电泳回收50bp左右的片段。将2个回收产物连接，连接产物化转E.coli DH5α感受态细胞，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养16h后挑选单菌落于荧光显微镜下镜检，初步确定阳性克隆，将之扩大培养并提取重组质粒，用p1、p2引物扩增单菌落，进一步确定阳性克隆，提取阳性克隆的重组质粒并进行测序，确定核苷酸序列GGGGGTTCT已正确的插入起始密码子后，测序验证正确的重组质粒命名为高效-GFPuv质粒。
[0024] 3).高效-GFPuv质粒的扩大培养及提取
[0025] 将高效-GFPuv质粒转化入大肠杆菌DH5α，37℃恒温培养16h后，挑取单菌落，37℃，220rmf培养至OD600值至1.0左右，用OMAGE质粒小量提取试剂盒提取质粒，将提取的重组质粒化转入大肠杆菌DH5α中进行绿色荧光蛋白的表达(以pGFPuv载体质粒作为对照)，荧光显微镜下观察荧光状态，并进行绿色荧光蛋白的原核表达。挑取化转有pGFPuv和高效-GFPuv重组质粒的单菌落接种到含氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃培养
8-10h，之后按1％接种到新鲜的LB液体培养基中，37℃培养到OD600值至0.6时用1m mol/L的IPTG诱导，28℃诱导5h后，离心收集菌体，将菌体裂解后分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE。结果发现，在分子量约为31kD处，绿色荧光蛋白被诱导表达，且高效-GFPuv载体组的表达量明显高于对照组pGFPuv；将诱导表达的GFP样品进过不完全变性的SDS-PAGE电泳后，使用FujiFilm(LAS 3000)凝胶成像系统，在GFP模式下经过蓝光激发，GFP的蛋白条带可以看到亮绿色的条带，其他的蛋白条带看不到，起到了类似于Western-blot的作用。
8-10h，之后按1％接种到新鲜的LB液体培养基中，37℃培养到OD600值至0.6时用1m mol/L的IPTG诱导，28℃诱导5h后，离心收集菌体，将菌体裂解后分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE。结果发现，在分子量约为31kD处，绿色荧光蛋白被诱导表达，且高效-GFPuv载体组的表达量明显高于对照组pGFPuv；将诱导表达的GFP样品进过不完全变性的SDS-PAGE电泳后，使用FujiFilm(LAS 3000)凝胶成像系统，在GFP模式下经过蓝光激发，GFP的蛋白条带可以看到亮绿色的条带，其他的蛋白条带看不到，起到了类似于Western-blot的作用。
[0026] 4).pGFPuv和高效-GFPuv绿色荧光蛋白表达量的统计分析
[0027] 采用Bradford法及电泳扫描法进行蛋白表达量的测定，波长为595nm时，不同浓度的标准蛋白的光密度值，绘制标准曲线，测定样品的光密度值，计算总蛋白含量；同时进行SDS-PAGE，凝胶扫描，计算机分析测定表达蛋白百分含量，根据蛋白浓度推算其表达量。诱导表达的GFP绿色荧光蛋白的分子量都在31kD左右，对照组pGFPuv的GFP蛋白表达量不足全菌蛋白的8％，而高效重组表达载体高效-GFPuv的则为23％。由此可见，通过在原商品化载体pGFPuv的起始密码子ATG后添加编码三个多密码子(甘氨酸、丝氨酸分别有4个和6个简并密码子)氨基酸GlyGlySer的核酸序列，可以使该载体的相关蛋白表达量提高3倍多。
[0028] 核酸序列GGGGGTTCT还可以用SEQ ID NO：3-6的核酸序列，或是编码GlyGlySer的其他核酸序列来替代。具体操作时就是将引物p5、p6的核酸序列进行改造，使编码GlyGlySer的核酸序列分别为SEQ IDNO：3-6。
[0029] 如用SEQ ID NO：3来替代GGGGGTTCT，具体步骤如下：
[0030] 1).引物序列信息
[0031] P5的引物改为p7：TCTATCGATATGGGAGGTAGCATGATTACGCCAAGCTTGCA；其中下划线为替代的碱基序列；
[0032] P6的引物改为p8：TGCAAGCTTGGCGTAATCATGCTACCTCCCATATCGATAGA；其中下划线为替代的碱基序列。
[0033] 2).高效表达载体高效-GFPuv的构建
[0034] 用引物p3和p4扩增pGFPuv质粒得到p3p4GFPuv片段，再用p7、p8引物退火形成p7p8双链DNA片段，分别用限制性内切酶Cla I和Hind III双酶切p3p4GFPuv片段和p7p8双链DNA片段，酶切产物回收后连接，连接产物化转E.coli DH5α感受态细胞后，用p1、p2引物扩增单菌落，电泳检测确定阳性克隆并将阳性克隆测序，保证核苷酸序列GGGGGTTCT已正确插入起始密码子后。重组质粒命名为p7p8高效-GFPuv质粒。
[0035] 3).p7p8高效-GFPuv质粒的扩大培养及提取
[0036] 将p7p8高效-GFPuv质粒转入大肠杆菌DH5α，37℃恒温培养16h后，挑取单菌落，将单菌落扩大培养后，提取p7p8高效-GFPuv质粒，将提取的质粒化转入大肠杆菌DH5α中进行绿色荧光蛋白的表达，并以pGFPuv载体质粒作为对照。将诱导表达的GFP蛋白进过不完全变性的SDS-PAGE电泳后，使用FujiFilm(LAS 3000)凝胶成像系统，在GFP模式下经过蓝光激发检测表达的蛋白量。
[0037] 4).蛋白表达量的统计分析
[0038] 采用Bradford法及电泳扫描法进行蛋白表达量的测定，统计分析结果表明，对照组pGFPuv的GFP蛋白表达量不足全菌蛋白的8％，而高效重组表达载体组p7p8高效-GFPuv表达的GFP蛋白则达到25％。
[0039] 二).在载体pGFPuv起始密码子后插入其它的编码三个特定氨基酸序列的核酸序列：
[0040] 在载体pGFPuv起始密码子后插入编码GlyGlySer的核苷酸序列可用编码其它三个特定氨基酸序列的核酸序列替代，重组表达载体的绿色荧光蛋白表达量均有2～3倍的提高。例如，GlyGlySer可被序列为SEQ ID NO：7-21的氨基酸序列替代，其对应的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：22-31，对应关系如下表。
[0041]
[0042] 例如，用SEQ ID NO：10的GlySerAla代替GlyGlySer：
[0043] 首先将引物p5、p6的核酸序列进行改造，使编码GlyGlySer的核苷酸序列GGGGGTTCT被编码GlySerAla(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列GGAAGCGCA(SEQ ID NO：27)替代，形成新的引物p9、p10。具体的表达步骤如下：
[0044] 1).引物序列信息
[0045] P9：TCTATCGATATGGGAAGCGCAATGATTACGCCAAGCTTGCA；其中下划线为替代的碱基序列；
[0046] P10：TGCAAGCTTGGCGTAATCATTGCGCTTCCCATATCGATAGA；其中下划线为替代的碱基序列。
[0047] 2).高效表达载体高效-GFPuv的构建
[0048] 用引物p3和p4扩增pGFPuv质粒得到p3p4GFPuv片段，再用p9、p10引物退火形成p9p10双链DNA片段，用限制性内切酶Cla I和Hind III双酶切p3p4GFPuv片段和p9p10双链DNA片段，酶切产物回收后连接，连接产物化转E.coli DH5α感受态细胞后，用p1、p2引物扩增单菌落，电泳检测并测序确定核苷酸序列已正确的插入起始密码子后的重组质粒，将重组质粒命名为p9p10高效-GFPuv质粒。
[0049] 3).p9p10高效-GFPuv质粒的扩大培养及提取
[0050] 将p9p10高效-GFPuv质粒转入大肠杆菌DH5α，37℃恒温培养16h后，挑取单菌落，将单菌落扩大培养后，提取p9p10高效-GFPuv质粒，将提取的质粒化转入大肠杆菌DH5α中进行绿色荧光蛋白的表达，并以pGFPuv载体质粒作为对照。将诱导表达的GFP蛋白进过不完全变性的SDS-PAGE电泳，使用FujiFilm(LAS 3000)凝胶成像系统，在GFP模式下经过蓝光激发检测表达的蛋白量。
[0051] 4).蛋白表达量的统计分析
[0052] 采用Bradford法及电泳扫描法进行蛋白表达量的测定，统计分析结果表明，对照组pGFPuv的GFP蛋白表达量不足全菌蛋白的8％，而高效重组表达载体组p9p10高效-GFPuv表达的GFP蛋白则达到19％。
[0053] 把SEQ ID NO：27用其它编码3个氨基酸的核苷酸替代，替代的核苷酸序列为SEQ ID NO：22-26、SEQID NO：28-48，重组表达载体的绿色荧光蛋白表达量均有2～3倍的提高。
[0054] 实施例2在表达载体起始密码子后插入编码四个特定氨基酸序列的核酸序列来构建高效表达载体：
[0055] 一).在载体pGFPuv起始密码子后插入编码SerSerAlaLeu(SEQ ID NO：49)的核酸序列：
[0056] 1).引物序列信息
[0057] 设计用于构建高效表达载体的引物：
[0058] 上游引物P11(验证A-F)：TCTATCGATATGTCTTCCGGTC-TGATTACGCCAAGCTTGCA，含有Cla I酶切位点及起始密码子ATG，下游引物P12(验证A-R)：TGCAAGCTTGGCGTAATCATACCGGAAGACATATCGATAGA，含有HindIII酶切位点；通过该引物可在原载体起始密码子位点后引入编码SerSerAlaLeu的核苷酸序列TCTTCCGGTCTG(SEQ ID NO：50)，这四个氨基酸分别有6、6、4、6个简并密码子。
[0059] 2).高效表达载体高效-GFPuv的构建
[0060] 按实施例1中的操作步骤将p3p4GFPuv片段，以及p11、p12引物退火形成p11p12双链DNA片段，酶切、连接、克隆筛选得到在起始密码子后插入TCTTCCGGTCTG(SEQ ID NO：50)的重组质粒，命名为p11p12高效-GFPuv质粒。
[0061] 3).p11p12高效-GFPuv质粒的扩大培养及提取
[0062] 将p11p12高效-GFPuv质粒转入大肠杆菌DH5α，扩大培养后提取p11p12高效-GFPuv质粒，将提取的质粒化转入大肠杆菌DH5α中进行绿色荧光蛋白的表达，并以pGFPuv载体质粒作为对照。将诱导表达的GFP蛋白进过不完全变性的SDS-PAGE电泳后，使用FujiFilm(LAS 3000)凝胶成像系统，在GFP模式下经过蓝光激发检测表达的蛋白量。
[0063] 4).蛋白表达量的统计分析
[0064] 采用Bradford法及电泳扫描法进行蛋白表达量的测定，统计分析结果表明，对照组pGFPuv的GFP蛋白表达量为全菌蛋白的8％，而高效重组表达载体p11p12高效-GFPuv质粒表达的GFP蛋白达到35％。
[0065] 核酸序列TCTTCCGGTCTG(SEQ ID NO：50)还可以用用编码SerSerAlaLeu的核苷酸序列AGCTCTGCACTC(SEQ ID NO：51)、AGCTCTGCATTG(SEQ ID NO：52)或是编码SerSerAlaLeu的其他核酸序列来替代。具体操作时就是将引物p11、p12的核酸序列进行改造，使编码SerSerAlaLeu的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：51-52或其它序列。
[0066] 二).在载体pGFPuv起始密码子后插入其它的编码四个特定氨基酸序列的核酸序列：
[0067] 在载体pGFPuv起始密码子后插入的编码SerSerAlaLeu(SEQ ID NO：49)的核苷酸序列可用编码其它四个特定氨基酸序列的核苷酸序列替代。例如，SerSerAlaLeu可被序列为SEQ ID NO：53-64的氨基酸序列替代，其对应的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：65-88，对应关系如下表：
[0068]
[0069] 例如，用SEQ ID NO：60的LeuSerThrPro代替SerSerAlaLeu的步骤及表达效果如下：
[0070] 首先将引物p11、p12的核酸序列进行改造，使编码SerSerAlaLeu的核苷酸序列TCTTCCGGTCTG(SEQID NO：50)被核苷酸序列SEQ ID NO：79或80替代，形成新的引物p13、p14。具体的表达步骤如下：
[0071] 1).引物序列信息
[0072] P13：TCTATCGATATG CTCAGCACACCCATGATTACGCCAAGCTTGCA；其中下划线为替代的碱基序列；
[0073] P14：TGCAAGCTTGGCGTAATCATGGGTGTGCTGAGCATATCGATAGA；其中下划线为替代的碱基序列。
[0074] 2).高效表达载体高效-GFPuv的构建
[0075] 用引物p3和p4扩增pGFPuv质粒得到p3p4GFPuv片段，再用p13、p14引物退火形成p13p14双链DNA片段，用限制性内切酶Cla I和Hind III双酶切p3p4GFPuv片段和p13p14双链DNA片段，酶切产物回收后连接，连接产物化转E.coli DH5α感受态细胞后，用p1、p2引物扩增单菌落，电泳检测并测序确阳性克隆，确定核苷酸序列已正确的插入起始密码子后。重组质粒命名为p13p14高效-GFPuv质粒。
[0076] 3).p13p14高效-GFPuv质粒的扩大培养及提取
[0077] 将p13p14高效-GFPuv质粒转入大肠杆菌DH5α，37℃恒温培养16h后，挑取单菌落，将单菌落扩大培养后，提取p13p14高效-GFPuv质粒，将提取的质粒化转入大肠杆菌DH5α中进行绿色荧光蛋白的表达，并以pGFPuv载体质粒作为对照。将诱导表达的GFP蛋白进过不完全变性的SDS-PAGE电泳后，使用FujiFilm(LAS 3000)凝胶成像系统，在GFP模式下经过蓝光激发检测表达的蛋白量。
[0078] 4).蛋白表达量的统计分析
[0079] 采用Bradford法及电泳扫描法进行蛋白表达量的测定，统计分析结果表明，对照组pGFPuv的GFP蛋白表达量不足全菌蛋白的8％，而高效重组表达载体组p13p14高效-GFPuv表达的GFP蛋白则达到34％。
[0080] 结果表明，在载体的起始密码子后面插入编码四个氨基酸的核苷酸序列，其目的蛋白的表达效率高于插于编码三个氨基酸的核苷酸序列的表达效率1～2倍。
[0081] 实施例3在起始密码子后插入编码四个以上特定氨基酸序列的核酸序列来构建高效表达载体：
[0082] 一).在表达载体后的起始密码子后插入编码五个氨基酸的核酸序列[0083] 通过上游引物P5(验证B-F)：TCTATCGATATGGCTGCATCTCTGACGATTACGCCAAGCTTGCA，含有Cla I酶切位点及起始密码子ATG，下游引物P6(验证B-R)：TGCAAGCTTGGCGTAATCATAGATGCAGCCATATCGATAGA，含有HindIII酶切位点。通过该引物对可在原载体起始密码子位点后引入五个多密码子编码的氨基酸AlaAlaSerLeuThr(SEQ ID NO：89)，这五个氨基酸分别有4、4、6、6、4个简并密码子，引物中编码AlaAlaSerLeuThr的核苷酸序列为：GCTGCATCTCTGACG(SEQ ID NO：90)。将构建好的表达载体按上述步骤进行表达效率检测，结果表明，重组的高效-GFPuv中绿色荧光蛋白的表达效率提高了3倍多。
[0084] AlaAlaSerLeuThr(SEQ ID NO：89)还可以用其他的五个多密码子氨基酸替代。例如，用序列为SEQID NO：91-93的氨基酸替代，重组的高效-GFPuv中绿色荧光蛋白的表达效率大约都有2～4倍的提高。
[0085] 二).在表达载体后的起始密码子后插入编码六个氨基酸的核酸序列[0086] 通过上游引物(验证C-F)：TCTATCGATATGGTTGTCTCGAGTGGGGGTATTACGCCAAGCTTGCA，含有Cla I酶切位点及起始密码子ATG，下游引物(验证C-R)：TGCAAGCTTGGCGTAATCATCGAGACAACCATATCGATAGA，含有HindIII酶切位点。通过该引物可在原载体起始密码子位点后引入六个多密码子编码的氨基酸ValValSerSerGlyGly(SEQ ID NO：94)，这六个氨基酸分别有4、4、6、6、4、4个简并密码子；引物中编码ValValSerSerGlyGly(SEQ ID NO：94)的核苷酸序列为：GTTGTCTCGAGTGGGGGT(SEQ ID NO：95)。将构建好的表达载体按上述步骤进行表达效率检测，结果表明，重组的高效-GFPuv中绿色荧光蛋白的表达效率提高了2.5倍左右。
[0087] ValValSerSerGlyGly(SEQ ID NO：94)还可以用其他的六个多密码子氨基酸替代。例如，用序列为SEQ ID NO：96-98的氨基酸替代，绿色荧光蛋白的表达效率大约都有2～3倍的提高。
[0088] 三).在表达载体后的起始密码子后插入编码七个氨基酸的核酸序列[0089] 通过上游引物(验证D-F)：TCTATCGATATGCTCTTGTCGGCAAGCACACTCATTACGCCAAGCTTGCA，含有Cla I酶切位点及起始密码子ATG，下游引物(验证D-R)：TGCAAGCTTGGCGTAATCATCGACAAGAGCATATCGATAGA，含有HindIII酶切位点。通过该引物可在原载体起始密码子位点后引入七个多密码子编码的氨基酸LeuLeuSerAlaGlyGlySer(SEQ ID NO：99)，这七个氨基酸分别有6、6、6、4、4、4、6个简并密码子，引物中编码LeuLeuSerAlaGlyGlySer的核苷酸序列为：CTCTTGTCGGCAAGCACACTC(SEQ ID NO：100)。将构建好的表达载体按上述步骤进行表达效率检测，结果表明，绿色荧光蛋白的表达量提高了3倍。
[0090] LeuLeuSerAlaGlyGlySer还可以用其他的七个多密码子氨基酸替代。例如，用序列为SEQ IDNO：101-103的氨基酸替代，重组的高效-GFPuv中绿色荧光蛋白的表达效率大约均有2～3倍的提高。
[0091] 实施例4通过添加10个或以上多密码子编码的氨基酸标签改造目的基因提高蛋白表达效率
[0092] 一)、通过添加10个多密码子编码的氨基酸标签改造目的基因提高蛋白表达效率[0093] 1).编码Trx基因成熟肽cDNA的克隆
[0094] 提取对虾血细胞的总RNA，并反转录成cDNA，依据Trx基因成熟肽cDNA序列及表达载体 T7/NT TA的特征，设计引物Trx-F(5’-GCTAGCATGTCGTTGCTCGCAAGCACACTCATGAGCAACACTGTCCCA-3’，下划线部分为Nhe I酶切位点)和Trx-R(5’-GAATTCGAAGTATTCTTTGCTGCCA-3’，下划线部分为EcoR I酶切位点)以cDNA为模板进行PCR扩增，以获得编码该基因成熟肽的基因片段。
[0095] PCR反应程序：94℃变性4min，1个循环；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，1个循环。PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，经过凝胶成像系统观察照相后切下特异目的条带，用DNA凝胶回收试剂盒纯化目的片段，连入pMD18-T载体，转化TOP10F’感受态细胞，然后通过PCR筛选阳性克隆并进行测序验证。
[0096] 2).重组表达载体构建
[0097] 参照 T7/NT TA Expression Kits中的说明，将编码一段10个多密码子氨基酸ProSerGlySerSerArgValProProThr(SEQ ID NO：104)的核酸序列CCTTCTGGATCTTCTAGAGTGCCTCCTACA(SEQID NO：105)先插入pCRT7表达载体中，然后再将Trx重组进入表达载体。将构建好的表达载体转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，过夜培养，以基因特异性引物Trx-EF与载体引物Reverse T7 promoter(5’-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3’)对转化子进行筛选。挑选阳性克隆进行测序。
[0098] 3).重组表达载体的诱导表达
[0099] 将经过测序鉴定正确的阳性克隆转入含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，200r/min，37℃培养过夜。利用EZ Spin Column Plasmid Mini-Preps Kit提取质粒，取10ng质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞(具体操作参照 T7/NT TA Expression Kits)。将转化产物接入10mL LB培养基中含100μg/mL氨苄青霉素，34μg/mL氯霉素)，200r/min，37℃培养过夜。
[0100] 取0.5mL过夜培养的菌液接入5mL新鲜的LB培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素，34μg/mL氯霉素)，200r/min，37℃培养2-3h，待其OD600达到0.5-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG继续培养6h，每隔1h取样一次，每次取500μL。将收集到的培养液分别于4℃，12,000r/min条件下离心2min，弃上清，然后将菌泥保存于-20℃，备用。在每个样品中加600μL裂解液处理，在液氮与42℃水浴中反复冻融，离心后通过SDS-PAGE分析上清与沉淀中的蛋白，对IPTG诱导后的表达量进行分析，结果发现宿主菌的蛋白表达图谱发生了变化，在分子量大约27kDa的位置出现了一条特异的蛋白谱带，通过BIO-RAD凝胶扫描系统分析，发现利用起始密码子后插入人工序列(添加10个多密码子氨基酸标签后的Trx)构建的重组蛋白的表达量占整个菌体总蛋白量的42％，而仅利用Trx原蛋白构建的重组蛋白的达量只占整个菌体蛋白量的10％。
[0101] 相应的，ProSerGlySerSerArgValProProThr可被SEQ ID NO：106-107代替；结果表明，重组Trx蛋白的表达量均有3～5倍的提高。
[0102] 二)通过添加10个以上多密码子编码的氨基酸标签改造目的基因提高蛋白表达效率
[0103] 1).编码Trx基因成熟肽cDNA的克隆
[0104] 采用本实施例中一)中的方法克隆编码Trx基因成熟肽cDNA。
[0105] 2).重组表达载体构建及重组表达载体的诱导表达
[0106] 参照 T7/NT TA Expression Kits中的说明，将编码一段20个多密码子氨基酸ProSerGlySerSerArgValProProThrGlyThrGlyValLeuAlaThrAlaSerPro(SEQ ID NO：108)的核酸序列CCTTCTGGATCTTCTAGAGTGCCTCCTACAGGAACAGGAGTGCTCGCAACAGCATCTCCT(SEQ ID NO：109)先插入pCRT7表达载体中，然后再将Trx重组进入表达载体。将构建好的表达载体转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，过夜培养，以基因特异性引物Trx-EF与载体引物ReverseT7 promoter(5’-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3’)对转化子进行筛选。挑选阳性克隆进行测序。采样本实施例中一)中的方法对重组的表达载体进行诱导表达，SDS-PAGE分析Trx的表达变化，发现利用起始密码子后插入人工序列(添加20个多密码子氨基酸标签后的Trx)构建的重组蛋白的表达量占整个菌体总蛋白量的35％，而仅利用Trx原蛋白构建的重组蛋白的达量只占整个菌体蛋白量的
10％。
10％。
[0107] 相应的，ProSerGlySerSerArgValProProThrGlyThrGlyValLeuAlaThrAlaSerPro可被SEQ ID NO：110-112代替；目重组Trx蛋白的表达量均有1.5～4倍的提高。
[0108] 实施例5在真核细胞中通过人工添加多密码子编码的氨基酸标签改造目的基因提高蛋白表达效率
[0109] 1).引物合成
[0110] 根据载体的全序列设计一对用于pEGFP-C载体验证的 引物，上游引 物 为 (pEGFP-C-S)：GACATG-AGTAAAGGAGAAGAAC， 下 游 引 物 (pEGFP-C-A)：
GCGTTATTTGTAGAGCTCAT。通过特殊引物设计在pEGFP-C载体的第216位添加酶切位点Cla I，上游引物(pEGFP-C216-F)为：CTCATCGATATGACCATGATTACG，下游引物(pEGFP-C216-R)为：GAGATCGATAGCTGTTTCCTGTG，上下游都加保护碱基CTC。设计并合成用于高效表达序列合成的引物，上游引物F5(高效-F)：TCTATCGA-TATGGGGGGTTCTATGATTACGCCAAGCTTGCA，含有Cla I酶切位点及起始密码子ATG，下游引物F6(高效-R)：TGCAAGCTTGGCGTAATCATAGAACCCCCCATATCGATAGA，含有Hind III酶切位点；通过该引物可在原载体起始密码子位点后引入三个多密码子编码的氨基酸GlyGlySer，这三个氨基酸分别有4、4、6个简并密码子。
GCGTTATTTGTAGAGCTCAT。通过特殊引物设计在pEGFP-C载体的第216位添加酶切位点Cla I，上游引物(pEGFP-C216-F)为：CTCATCGATATGACCATGATTACG，下游引物(pEGFP-C216-R)为：GAGATCGATAGCTGTTTCCTGTG，上下游都加保护碱基CTC。设计并合成用于高效表达序列合成的引物，上游引物F5(高效-F)：TCTATCGA-TATGGGGGGTTCTATGATTACGCCAAGCTTGCA，含有Cla I酶切位点及起始密码子ATG，下游引物F6(高效-R)：TGCAAGCTTGGCGTAATCATAGAACCCCCCATATCGATAGA，含有Hind III酶切位点；通过该引物可在原载体起始密码子位点后引入三个多密码子编码的氨基酸GlyGlySer，这三个氨基酸分别有4、4、6个简并密码子。
[0111] 2).进行高效表达载体High-GFPuv的构建
[0112] 以 (pEGFP-C216-F)：CTCATCGATATGACCATGATTACG，(pEGFP-C216-R)：GAGATCGATAGCTGTTTCCTGTG为引物，以提取的pEGFP-C质粒为模板克隆pEGFP-C的全长，并使pEGFP-C质粒在216位断开，并使两端都加上酶切位点Cla I。PCR反应在50μl的总体积中进行，以2μl的pEGFP-C质粒为模板，反应条件为在95℃变性2min后开始循环，然后
95℃变性20s，42.3℃退火20s，72℃延伸1min 45s，8个循环后再95℃变性20s，49.8℃退火20s，72℃延伸1min 45s，30个循环后，在于72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳回收并纯化线性的GFPuv片段。用引物(高效-F)：TCTATCGATATG-GGGGGTTCTATGATTACGCCAAGCTTGCA，引物(高效-R)：TGCAAGCTTGGCGTAATCATAGAACCCCCCATATCGATAGA，以人工合成的方式合成双链DNA片段，反应条件为94℃，5min，53.1℃退火5min，72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳回收并纯化高效表达序列。将上述2种DNA片段构建成重组的高效表达载体高效-GFPuv。
95℃变性20s，42.3℃退火20s，72℃延伸1min 45s，8个循环后再95℃变性20s，49.8℃退火20s，72℃延伸1min 45s，30个循环后，在于72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳回收并纯化线性的GFPuv片段。用引物(高效-F)：TCTATCGATATG-GGGGGTTCTATGATTACGCCAAGCTTGCA，引物(高效-R)：TGCAAGCTTGGCGTAATCATAGAACCCCCCATATCGATAGA，以人工合成的方式合成双链DNA片段，反应条件为94℃，5min，53.1℃退火5min，72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳回收并纯化高效表达序列。将上述2种DNA片段构建成重组的高效表达载体高效-GFPuv。
[0113] 将neuro-2a细胞在含10％胎牛血清、1×12U/L青霉素、1×10U/L链霉素的MEM培养液中进行常规培养，培养条件为37℃、5％CO2，定期观察细胞生长情况，每3天用0.25％胰蛋白酶消化进行传代培养；转染前20h将neuro-2a细胞用0.25％胰蛋白酶消化后，以8
(3～6)×10cells/L密度接种于12孔培养板中，每孔滴加细胞悬液1mL，置37℃、5％CO2条件下培养，待细胞汇合度达到80％时进行转染。
(3～6)×10cells/L密度接种于12孔培养板中，每孔滴加细胞悬液1mL，置37℃、5％CO2条件下培养，待细胞汇合度达到80％时进行转染。
[0114] 脂质转染试剂为Lipofectamine2000，绿色荧光蛋白表达载体为pEGFP-C1，方法参照Lipofectamine2000试剂盒说明书进行转染，5h后将含有转染复合体的培养液弃去，加入含10％胎牛血清的新鲜MEM培养液，继续在37℃、5％CO2条件下孵育。取不同时间点分别收集细胞分离蛋白，将得到的总蛋白样品进行SDS-PAGE，可以看出在表观分子量约为30kDa处，绿色荧光蛋白被诱导表达，且高效重组载体组的表达量明显高于对照组。
[0115] 相应的，GlyGlySer还可以被实施例1、2、3和4中的氨基酸序列来替代，实验结果表明pGFPuv载体中绿色荧光蛋白的表达量均有2～6倍的提高。
[0116] 本发明构建载体的方法还可以用来作为提高蛋白表达效率的方法，具体是在起始密码子ATG后插入一段编码特定氨基酸序列的核苷酸，其特征在于：
[0117] 所述的特定氨基酸序列为X1X2……Xn，其中X代表有4个或以上密码子的氨基酸，n大于或等于3。
[0118] 具体实施例如下：
[0119] 实施例6在目的基因起始密码子后插入编码三个特定氨基酸的核酸序列：
[0120] 一).在对虾SOD基因的起始密码子后插入编码ProSerGly(SEQ ID NO：8)的核酸序列，以提高SOD蛋白的表达效率。其中Pro、Ser、Gly分别有6个、4个、4个三联体密码子。
[0121] 1).将编码ProSerGly的核酸序列CCCAGCGGA(SEQ ID NO：24)插入对虾SOD基因起始密码子后制备对虾血细胞RNA，并反转录成cDNA，利用根据对虾SOD基因设计的引物SOD-F1：5-TAGCTAGC CCTAGCGGACAGCAGAAGCACACC-3(其中GCTAGC为Nhe I酶切位点，ATG为起始密码子；CCTAGCGGA为插入的编码ProSerGly的核酸序列)和SOD-R：5-CGGAATTCCTCTATTTAGAAGCAGC-3(GAATTC为EcoRI酶切位点)，以对虾血细胞cDNA为模板，通过PCR扩增得到在起始密码子后插入CCTAGCGGA的SOD基因成熟肽的改造-SOD基因片段。利用根据对虾SOD基因设计的正常扩增的前引物SOD-F2(5’-TAGCTAGCCAGCAGAAGCACACC-3’，下划线为Nhe I酶切位点)和SOD-R(5’-CGGAATTCCTC-TATTTAGAAGCAGC-3’，下划线为EcoR I酶切位点)以cDNA为模板进行PCR扩增，获得编码该基因成熟肽的正常-SOD基因片段。
[0122] 将改造-SOD基因片段和正常-SOD基因片段分别连入pMD18-T质粒载体，转化TOP10F’感受态细胞，然后通过PCR筛选阳性克隆并进行测序验证，得到插入扩增片段的阳性克隆。将阳性克隆扩大培养，回收质粒并准备与重组表达载体构建。
[0123] 2).重组表达载体构建
[0124] 参照 T7/NT TA Expression Kits中的说明，将 T7/NT TA表达载体与步骤1)中经过测序验证的改造-SOD基因片段和正常-SOD基因片段分别构建重组表达载体，构建的重组表达载体测序确定插入的基因序列准确无误。
[0125] 将构建好的表达载体转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，过夜培养，挑选阳性克隆进行测序确定含重组表达载体的阳性克隆。
[0126] 3).重组表达载体的诱导表达
[0127] 将经过测序鉴定正确的阳性克隆转入含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，200r/min，37℃培养过夜。利用EZ Spin Column Plasmid Mini-Preps Kit提取质粒，取10ng质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞。将转化产物接入10mL LB培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素，34μg/mL氯霉素)，200r/min，37℃培养过夜。
[0128] 取0.5mL过夜培养的菌液接入5mL新鲜的LB培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素，34μg/mL氯霉素)，200r/min，37℃培养至OD600达到0.5-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG继续培养6h，每隔1h取样一次，每次取500μL。将收集到的培养液分别于4℃，12,000r/min条件下离心2min，弃上清，然后将菌泥保存于-20℃备用。
[0129] 每个样品中加500μL裂解液处理，在液氮与42℃水浴中反复冻融。利用SDS-PAGE法分析对目的蛋白的表达量进行分析。结果显示，含有编码SOD成熟肽DNA片段的重组质粒 T7/NT TA/SOD转染表达宿主菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞并用IPTG诱导后，宿主菌的蛋白表达图谱发生了变化，在分子量大约24kDa的位置出现了一条特异的蛋白谱带，通过BIO-RAD凝胶扫描系统分析，发现含有改造-SOD基因片段重组载体的SOD蛋白的表达量占整个菌体总蛋白量的40％，而利用仅含正常-SOD基因片段重组载体的SOD蛋白的表达量只占整个菌体蛋白量的12％，这说明，对虾SOD基因的起始密码子后插入编码ProSerGly(SEQ ID NO：8)的核酸序列大大提高了SOD蛋白的表达效率。
[0130] 核酸序列CCCAGCGGA还可以用编码ProSerGly的其他核酸序列如SEQ ID NO：113-140来替代。具体操作时就是将引物SOD-F1和SOD-R中的CCCAGCGGA分别用序列为SEQ ID NO：113-140的核酸序列替代，按步骤1)-3)来表达对虾SOD基因，SDS-PAGE电泳显示改造后的目的蛋白表达量均有3～5倍的提高。
[0131] 编码ProSerGly的其他核酸序列SEQ ID NO：113-140的列表如下：
[0132]
[0133]
[0134] 二).在对虾SOD基因启起始密码子后插入编码其他三个特定氨基酸序列的核酸序列提高SOD蛋白的表达效率
[0135] 在对虾SOD基因启起始密码子后插入编码ProSerGly的核苷酸序列可用编码其它三个特定氨基酸序列的核酸序列替代，重组表达载体的绿色荧光蛋白表达量均有2～5倍的提高。例如，ProSerGly可被序列为SEQ ID NO：7-21的氨基酸序列替代，其对应的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：22-31。
[0136] 例如，用AlaLeuArg代替GlyGlySer的验证过程：
[0137] 1).改造和正常SOD片段的获得
[0138] 采用本实施例一)中的方法，将编码AlaLeuArg(该氨基酸序列可被SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7-21代替)核酸序列GCACTCAGA(核酸序列的可被SEQ ID NO：2-4或SEQ ID NO：22-48代替)插入对虾SOD基因的起始密码子ATG后，获得改造-SOD基因片段；利用同样的方法获得正常-SOD基因片段；将上述两种SOD片段分别连入pMD18-T质粒载体，转化TOP10F’感受态细胞，然后通过PCR筛选阳性克隆并进行测序验证。
[0139] 2).重组表达载体构建
[0140] 参照本实施例一)中的方法，构建含有改造-SOD和正常-SOD基因片段的重组表达载体。
[0141] 将构建好的表达载体转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，过夜培养，挑选阳性克隆进行测序确定含重组表达载体的阳性克隆。
[0142] 3).重组表达载体的诱导表达
[0143] 参照本实施例一)中方法，将含有改造-SOD和正常-SOD基因片段的重组表达载体转化宿主菌，并利用IPTG诱导表达，利用SDS-PAGE法分析对目的蛋白的表达量进行分析，结果显示，发现含有改造-SOD基因片段重组载体的SOD蛋白的表达量占整个菌体总蛋白量的36％，而利用仅含正常-SOD基因片段重组载体的SOD蛋白的表达量只占整个菌体蛋白量的13％，这说明，对虾SOD基因的起始密码子后插入编码AlaLeuArg的核酸序列(GCACTCAGA)大幅度提高了SOD蛋白的表达效率。
[0144] 实施例7.在目的基因起始密码子后插入编码四个特定氨基酸的核酸序列提高蛋白表达效率
[0145] 一)在对虾SOD基因起始密码子后插入编码SerLeuGlyArg的核酸序列提高SOD蛋白的表达效率
[0146] 其中，Ser、Leu、Gly、Arg分别有6、6、4、6个密码子。
[0147] 1).将核酸序列AGCCTCGGAAGA插入对虾SOD基因的起始密码子ATG后[0148] 制备对虾血细胞RNA，并反转录成cDNA。
[0149] 利用根据对虾SOD基因设计的引物SOD-F1：5-TAGCTAGCATGAGCCTCGGAAGACAGCAG-AAGCACACC-3(其中GCTAGC为Nhe I酶切位点，ATG为起始密码子；AGCCTCGGAAGA为插入的编码SerLeuGlyArg的核酸序列)；SOD-R：5-CGGAATTCCTCTATTTAGAAGCAGC-3(GAATTC为EcoR I酶切位点)，通过PCR扩增eDNA得到在起始密码子后插入核酸序列AGCCTCGGAAGA的该基因成熟肽的基因片段。利用根据对虾SOD基因设计的正常扩增的前引物SOD-F2(5’-TAGCTAGCCAGCAGAAGCACACC-3’，下划线为Nhe I酶切位点)和SOD-R(5’-CGGAATTC CTCTATTTAGAAGCAGC-3’，下划线为EcoR I酶切位点)以cDNA为模板进行PCR扩增，获得编码该基因成熟肽的基因片段。
[0150] PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，经过凝胶成像系统观察照相后切下特异目的条带，用DNA凝胶回收试剂盒纯化目的片段，连入pMD18-T质粒载体，转化TOP10F’感受态细胞，然后通过PCR筛选阳性克隆并进行测序验证。
[0151] 2).重组表达载体构建
[0152] 参照 T7/NT TA Expression Kits中的说明，将 T7/NT TA表达载体与回收的含有SOD基因成熟肽的基因片段的质粒构建重组表达载体。将构建好的表达载体转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，过夜培养，挑选阳性克隆进行测序确定含重组表达载体的阳性克隆。
[0153] 3).重组表达载体的诱导表达
[0154] 将经过测序鉴定正确的阳性克隆转入含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中培养过夜。利用EZ Spin Column Plasmid Mini-Preps Kit提取质粒，取10ng质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞(具体操作参照 T7/NT TA Expression Kits)。将转化产物接入10mL LB培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素，34μg/mL氯霉素)，200r/min，37℃培养过夜。
[0155] 取0.5mL过夜培养的菌液接入5mL新鲜的LB培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素，34μg/mL氯霉素)，200r/min，37℃培养至OD600达到0.5-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG继续培养6h，每隔1h取样一次，每次取500μL。将收集到的培养液分别于4℃，12,000r/min条件下离心2min，弃上清，然后将菌泥保存于-20℃备用。
[0156] 每个样品中加500μL裂解液处理，在液氮与42℃水浴中反复冻融。利用SDS-PAGE法分析对目的蛋白的表达量进行分析，结果显示，含有编码SOD成熟肽DNA片段的重组质粒T7/NT TA/SOD转染表达宿主菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞并用IPTG诱导后，宿主菌的蛋白表达图谱发生了变化，在分子量大约24kDa的位置出现了一条特异的蛋白谱带，通过BIO-RAD凝胶扫描系统分析，发现利用起始密码子后插入人工序列标签构建的重组蛋白的表达量占整个菌体总蛋白量的40％，而利用仅含SOD原序列构建的重组蛋白的表达量只占整个菌体蛋白量的13％。
[0157] 二)在对虾SOD基因起始密码子后插入ThrArgProAla(该氨基酸序列可被SEQ ID NO：53-64的序列代替)的核酸序列提高SOD蛋白的表达效率
[0158] 1).将编码ThrArgProAla(该氨基酸序列可被SEQ ID NO：53-64代替)核酸序列ACAAGACCCGCA(该核酸序列相应的可被SEQ ID NO：65-88代替)插入对虾SOD基因的起始密码子ATG后
[0159] 制备对虾血细胞RNA，并反转录成cDNA。
[0160] 利用根据对虾SOD基因设计的引物SOD-F1：5-TAGCTAGCATGCAGCAGAAGCACACC-3(斜体下划线的核酸序列可被SEQ ID NO：65-88代替)；SOD-R：5-CGGAATTCCTCTATTTAGAAGCAGC-3(GAATTC为EcoR I酶切位点)，通过PCR扩增cDNA得到在起始密码子后插入核酸序列AGCCTCGGAAGA的该基因成熟肽的基因片段。利用根据对虾SOD基因设计的正常扩增的前引物SOD-F2(5’-TAGCTAGCCAGCAGAAGCACACC-3’，下划线为Nhe I酶切位点)和SOD-R(5’-CGGAATTCCTCTATTTAGAAGCAGC-3’，下划线为EcoR I酶切位点)以cDNA为模板进行PCR扩增，获得编码该基因成熟肽的基因片段。
[0161] PCR反应程序：94℃变性4min，1个循环；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，1个循环。PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，经过凝胶成像系统观察照相后切下特异目的条带，用DNA凝胶回收试剂盒纯化目的片段，连入pMD18-T质粒载体，转化TOP10F’感受态细胞，然后通过PCR筛选阳性克隆并进行测序验证。
[0162] 2).重组表达载体构建
[0163] 参照 T7/NT TA Expression Kits中的说明，将 T7/NT TA表达载体与回收的含有SOD基因成熟肽的基因片段的质粒构建重组表达载体。将构建好的表达载体转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，过夜培养，挑选阳性克隆进行测序确定含重组表达载体的阳性克隆。
[0164] 3).重组表达载体的诱导表达
[0165] 将经过测序鉴定正确的阳性克隆转入含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，200r/min，37℃培养过夜。提取质粒，取10ng质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞(具体操作参照 T7/NT TA Expression Kits)。将转化产物接入10mL LB培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素，34μg/mL氯霉素)，200r/min，37℃培养过夜。
[0166] 取0.5mL过夜培养的菌液接入5mL新鲜的LB培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素，34μg/mL氯霉素)，200r/min，37℃培养至OD600达到0.5-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG继续培养6h，每隔1h取样一次，每次取500μL。将收集到的培养液分别于4℃，12,000r/min条件下离心2min，弃上清，然后将菌泥保存于-20℃备用。
[0167] 每个样品中加500μL裂解液处理，在液氮与42℃水浴中反复冻融。
[0168] 利用SDS-PAGE法分析对目的蛋白的表达量进行分析，结果显示，利用起始密码子后插入人工序列标签构建的重组蛋白的表达量占整个菌体总蛋白量的均在26％～48％之间，而利用仅含SOD原序列构建的重组蛋白的表达量只占整个菌体蛋白量的9％～13％。
[0169] 本发明所使用的试剂和材料：引物由上海生物工程有限责任公司合成；PCR克隆载体pMD18-T、限制性内切酶、Taq酶，连接酶等均购自宝生物工程(大连)有限公司，IPTG等购自上海生物工程公司，原核表达载体 T7/NT TA和pEGFP、pGFPuv购自Clontech公司，E.coli DH5α购于天根生化科技(北京)有限公司。
[0170] 利用本发明提供的提高有用基因蛋白表达效率的方法，仅需对目的基因或载体进行简单改造即可实现目的基因高效率表达或构建出具有高表达效率特征的表达载体。与现有技术相比，采用本发明的方法可以使任意目的基因的蛋白的表达效率提高2倍以上，或者通过对已有蛋白表达载体进行改造，使其蛋白表达效率提高2倍以上，这种简单易行的方法将在基因表达人工调控、蛋白质超量生产等方面发挥重要作用。