一种高效筛选衣藻放氢突变体的方法

摘要

本发明公开了一种筛选衣藻放氢突变体的方法。该方法，包括下述步骤：1)将pJD67质粒导入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC425中，将转化子在无精氨酸的培养基上培养筛选能生长的转化子，即为插入pJD67质粒的突变体；2)在插入pJD67质粒的突变体中筛选获得放氢量提高的转基因衣藻突变体。该方法，减少直接测量产氢量的工作量，提高了筛选衣藻放氢突变体的效率。这也为提高微藻光合产氢机理研究奠定了重要基础，同时为将来的大规模产氢技术改进提供依据。

权利要求

1.一种筛选衣藻放氢突变体的方法，包括下述步骤：

1)将pJD67质粒导入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC425中，将转化子在无精氨酸的培养基上培养筛选能生长的转化子，即为插入pJD67质粒的突变体；

2)在插入pJD67质粒的突变体中筛选获得放氢量提高的转基因衣藻突变体；

所述筛选获得放氢量提高的转基因衣藻突变体，是将插入pJD67质粒的突变体进行培养，筛选细胞淀粉含量提高的突变体，然后在无硫培养基中培养，筛选放氢量提高的衣藻突变体；

所述方法中，培养插入pJD67质粒的突变体的培养液为由NH4Cl 0.4g/L；MgSO4·7H2O

0.1g/L；CaCl2·2H2O 0.05g/L；K2HPO40.108g/L；KH2PO40.056g/L；Trisbase 2.423g/L；

Hutner’s trace element 1ml/L，冰乙酸1ml/L和水组成，其中，Hutner’s trace element由 H3BO411.4g/L，ZnSO4·7H2O 22.0g/L，MnCl2·4H2O5.06g/L，CoCl2·6H2O 1.61g/L，CuSO4·5H2O 1.57g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.10g/L，FeSO4·7H2O 4.99g/L和水组成；培养莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC425的培养基为培养突变体的培养液中添加精氨酸至终质量百分浓度为0.1％的培养基；所述无硫培养基是将上述培养插入pJD67质粒的突变体的培养液中的硫化物以等摩尔换成相应的氯化物获得的培养基。

2.莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CrSA-3，其保藏编号为CGMCC №.3983。

说明书

一种高效筛选衣藻放氢突变体的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种筛选衣藻放氢突变体的方法。

背景技术

[0002] 由于矿物资源的日益枯竭，寻找清洁的替代能源已成为一项迫切的课题。氢是宇宙间最简单同时也是最为丰富的元素，它的热值高达118.4kJ/g，燃烧后只生成水，被普遍认为是一种最有吸引力的替代能源。

[0003] 但是，氢气在地球表面的浓度小于1mg/L，仅占地球表面大气的极小部分，在自然界中大部分的氢是以化合态存在的，传统的化学产氢方法采用电解水或热解石油、天然气，生产成本也普遍较高。因此，新的产氢方法，特别是那些能利用可再生能源，大量生产的产氢方法倍受注目。

[0004] 藻类光合制氢是微藻利用太阳能裂解水释放氢气的生物过程，是实现氢能可持续生产的重要途径之一。由于光合作用水光解放氧和产氢是微藻细胞内两个既相互矛盾又密切关联的复杂生物代谢过程，而目前人们对这些过程发生机制和调节方式还不清楚，致使遗传改造不能有效进行，光能转化到氢的效率得不到显著提高，从源头上严重制约了微藻制氢途径的应用。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种有效的高通量筛选衣藻放氢突变体的方法。 [0006] 本发明所提供的筛选衣藻放氢突变体的方法，包括下述步骤：

[0007] 1)将pJD67质粒导入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC425中，将转化子在无精氨酸的培养基上培养筛选能生长的转化子，即为插入pJD67质粒的突变体； [0008] 2)在插入pJD67质粒的突变体中筛选获得放氢量提高的转基因衣藻突变体。 [0009] 所述方法中，所述筛选获得放氢量提高的转基因衣藻突变体，是将插入pJD67质粒的突变体进行培养，筛选细胞淀粉含量提高的突变体，然后在无硫培养基中培养，筛选放氢量提高的衣藻突变体。

[0010] 所述方法中，培养插入pJD67质粒的突变体的培养液为由NH4Cl 4g/L；MgSO4·7H2O.1g/L；CaCl2·2H2O 0.05g/L；K2HPO40.108g/L；KH2PO40.056g/L；Trisbase
2.423g/L；Hutner’s trace element 1ml/L，冰乙酸1ml/L和水组成，其中，Hutner’s trace element由H3BO411.4g/L，ZnSO4·7H2O 22.0g/L，MnCl2·4H2O5.06g/L，CoCl2·6H2O 1.61g/L，CuSO4·5H2O 1.57g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.10g/L，FeSO4·7H2O 4.99g/L和水组成；培养莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC425的培养基为培养突变体的培养液中添加质量百分浓度为0.1％的精氨酸的培养基；所述无硫培养基是将上述培养插入pJD67质粒的突变体的培养液中中的硫化物以等摩尔换成相应的氯化物获得的培养基。 [0011] 本发明还保护一株上述方法获得放氢量最高的突变藻株，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CrSA-3，其保藏编号为CGMCC №.3983。与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，藻种CC425 相比，CrSA-3 淀粉 含 量是 莱 茵 衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，藻种CC425的4.5倍，但放氢量可达到莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，藻种CC425的10倍。

[0012] 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CrSA-3，于2010年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号分别为CGMCC №.3983。 [0013] 本发明的方法，以光合产氢模式绿藻细胞为材料，采用新近发展的分子遗传学方法，高效率地转化了野生型藻株，通过精氨酸特异性筛选获得突变体株系，构建了覆盖全基因组的饱和突变体库。同时根据研究揭示了淀粉在产氢中的重要作用，发展出一种有效的高通量筛选衣藻放氢突变体的方法，利用先筛选淀粉含量高的突变株，减少直接测量产氢量的工作量，提高了筛选衣藻放氢突变体的效率。这也为提高微藻光合产氢机理研究奠定了重要基础，同时为将来的大规模产氢技术改进提供依据。

[0014] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

[0015] 附图说明

[0016] 图1为筛选的衣藻突变体淀粉含量检测结果。

[0017] 图2为筛选的衣藻突变体放氢量的测定结果。

[0018] 图3为筛选的衣藻突变体与对照CC425淀粉和放氢量的比值。

[0019] 图 4 为 pJD67 质粒结构示意图

[0020] 具体实施方式

[0021] 下述实施例所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。

[0022] 实施例1、有效的高通量筛选衣藻放氢突变体的方法及其效果验证 [0023] 一、材料

[0024] 1、植物材料：莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，藻种CC425(精氨酸缺陷型，Arg-)从杜克大学藻种库莱茵衣藻(Chlamy center，http://www.chlamy.org/)购买；其他突变体均由本实验室采用T-DNA随机插入方法获得。

[0025] 2、质粒：pJD67质粒购自杜克大学莱茵衣藻中心(Chlamy center， http://www.chlamy.org/)；pJD67质粒由已经商业化的pBluscript SK质粒改造而来，全长11284bp，含有精酰琥珀酸裂解酶基因及氨苄青霉素抗性基因。转化藻株时，用KpnI线性化处理，可提高转化效率。pJD67序列为序列1，pJD67结构示意图如图4。

[0026] 3、培养基

[0027] 1)正常TAP培养液：NH4C1 0.4g/L；MgSO4·7H2O 0.1g/L；CaCl2·2H2O 0.05g/L；K2HPO40.108g/L；KH2PO40.056g/L；Trisbase 2.423g/L；亨特微量元素(Hunter’strace elements)1ml/L，冰乙酸1ml/L，其余为水。

[0028] 2)缺硫TAP培养液(g/L)：将正常培养液中的硫化物以等摩尔换成相应的氯化物。 [0029] 3)固体TAP培养基：在正常TAP培养液中加1.5％的琼脂粉。

[0030] 4)亨特微量元素(Hunter’s trace elements)：H3BO411.4g/L，ZnSO4·7H2O 22.0g/L，MnCl2·4H2O 5.06g/L，CoCl2·6H2O 1.61g/L，CuSO4·5H2O 1.57g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O1.10g/L，FeSO4·7H2O 4.99g/L，其余为水。

[0031] 二、筛选衣藻放氢突变体的方法

[0032] 1材料培养：

[0033] 用TAP固体培养基培养莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC425，配制TAP液体培养液，121℃高压灭菌20分钟，待培养液温度降到室温后，用接种针从固体培养基上挑取莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC425单克隆到液体TAP培养液中，置于恒温-1 -2光照培养箱中的摇床上连续光照培养(25℃，60rpm，200μEs m )，悬浮培养细胞。固体培养时，将单克隆转到TAP固体培养基上划线培养。

[0034] 2突变体库的构建：

[0035] 实验采用莱茵衣藻CC425作为遗传背景，它是一种细胞壁缺失的突变体，其基因组中的arg(精酰琥珀酸裂解酶基因)因紫外线照射而发生点突变，因此在缺少精氨酸的环境中无法正常生长直至死亡。本实验中的突变体均以CC425为遗传背景，采用pJD67质粒线性化随机插入法获得，由于插入CC425的线性质粒片段带有arg基因，故能正常培养环境中(无精氨酸)生长的藻株均为插入突变体。具体转基因方法如下所述：

[0036] 1)在添加质量百分含量为0.1％(终浓度)的精氨酸的正常TAP培养液中接种CC425。收集15ml对数生长期的CC425，3000rpm，25℃，离心4min收集细胞。 [0037] 2)用30ml正常TAP培养液(无精氨酸)悬浮细胞，3000rpm，25℃，离心4min，30ml正常TAP培养液漂洗细胞。重复一次。

[0038] 3)用600μl的正常TAP培养液悬浮细胞，将悬浮液加到盛有0.1g玻璃珠的1.5mlEpendorf管中，每管100μl；再加入pJD67质粒(用KpnI线性化处理)，每管5μg。
置于漩涡振荡器(产品型号：BS14-VOTEX3000，购自克勒格瓦尼(上海)分析仪器有限公司)振荡15s。

[0039] 4)将转化后的细胞分别装入20ml的正常TAP培养液中，过夜恢复培养。 [0040] 5)将恢复培养的细胞3000rpm，25℃，离心4min，取上清。1ml正常TAP培养 液悬浮细胞，取200ul涂到不加精氨酸的正常TAP固体平板上。

[0041] 6)长出的单克隆为T-DNA随机插入突变体，挑取单克隆保存到固体培养基保种。 [0042] 上述方法平均每个正常TAP固体平板上长出100个单克隆，共20个平板，转化效率大约为400单克隆/(ug质粒)(转化效率＝产生每个平板单克隆数/每个平板转化用质粒DNA的总量，在本步骤中为100/(5ug/20)＝400个单克隆/ug)。

[0043] 3衣藻放氢突变体筛选：

[0044] 1)淀粉突变体的初步筛选

[0045] 用牙签将突变体库中的400株单克隆由平板上挑到正常TAP培养液(无精氨酸)中培养，设对照组CC425(由于CC425本身不能合成精氨酸，因此正常TAP培养液中需加入6
最终质量百分含量为0.1％的精氨酸)。培养至对数生长期时，细胞密度为1-5×10 个细胞/ml时，取500μl悬浮培养的细胞置于96孔板中，滴加logus碘液(碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。先将碘化钾溶于3～5ml蒸馏水中，然后加碘，摇匀，使碘完全溶解后，再加蒸馏水至足量。装入棕色试剂瓶。)100μl，盖上培养板盖，振荡混匀，放置10min后，观察颜色变化，颜色变化明显的为潜在的淀粉突变体，共获得64株潜在的淀粉突变体。 [0046] 2)突变体淀粉含量的测定

[0047] 选取1)中64株潜在的淀粉突变体进行淀粉含量的测定。培养材料至对数生长期即OD75O达到1.0左右时，可进行淀粉含量指标测定，具体步骤如下：

[0048] ①测OD750值，计算细胞密度。取15ml左右的培养物至50ml离心管中，5000rpm离心5min，弃上清。

[0049] ②加1ml H2O将沉淀重悬，再加9ml的95％乙醇，vortex使之充分重悬混匀。将悬浮液5000rpm离心5min，弃上清。重复②步骤1次。

[0050] ③用3ml H2O将沉淀悬浮起来，转入玻璃试管中。在沸水中将样品煮沸15min。 [0051] ④取1.5ml煮沸后的上清液于EP管中，2000g离心10min，弃沉淀，取上清。 [0052] ⑤另取EP管，分别加入0.25ml、0.375ml、0.5ml的离心后的上清液，再加入0.125mllogus碘液，用H2O定容至1.25ml(空白对照即0.125ml logus碘液+1.25mlH2O)。 [0053] ⑥测定OD625处的光吸收值，做相应的记录。

[0054] ⑦根据标准曲线计算测定样品中的淀粉浓度。

[0055] ⑧数据处理。

[0056] 初步筛选到的1)中64株潜在的淀粉突变体淀粉含量定量测定结果表明，共有34株淀粉含量差异突变体，其中有21株淀粉含量高于对照3倍以上，8株突变体淀粉含量明显小于对照，另有5株淀粉含量极微几乎无法测出。部分数据如图1(突变体淀 粉含量与对7
照CC425淀粉含量的比值，其中CC425淀粉含量为53.52ug/10 个细胞)所示：图1为筛选的衣藻突变体淀粉含量检测结果.每一个突变体编号的数值代表突变体淀粉含量与对照CC425淀粉含量的比值。比值大于1，表示突变体淀粉含量高于对照；比值小于1，表示突变体淀粉含量低于对照。比值越大，淀粉含量越高；比值越小，淀粉含量越小。 [0057] 3)淀粉突变体放氢量测定

[0058] ①液体培养：将步骤2)筛选得到的淀粉含量提高的衣藻突变体接到盛150ml正常TAP培养液的三角瓶中，当OD750值达到1.0-1.5时，再将其转到已加入磁转子的500ml培养液中。

[0059] ②待OD750值达到1.5左右时，25℃，2500rpm，离心5分钟。

[0060] ③倒掉上清，用缺硫TAP培养液漂洗细胞两次。

[0061] ④将漂洗过的细胞用20ml左右缺硫培养液重悬细胞。

[0062] ⑤取20μl悬浮细胞，加入980μl缺硫培养液，再加入4ml丙酮，混匀，5000rpm，5分钟。

[0063] ⑥取离心后的上清，测定663nm和645nm处的吸光值，根据下面的公式计算总叶绿素含量：

[0064] Chl(a+b)＝8.02×OD663+20.21×OD645

[0065] ⑦采用Schott培养瓶做放氢瓶，培养体系为270ml，计算最终叶绿素浓度达到20μg/ml所需的④步骤中的细胞原液体积，加入细胞，用缺硫TAP培养液补足到270ml。 [0066] ⑧用石蜡封住瓶口，以防止气体外漏。

[0067] ⑨将培养瓶置于25℃，200μEs-1m-2培养箱中的磁力搅拌器上连续光照培养，分别取不同的时间点测定放氢量。采用SHIMADZU GC-2014气相色谱测定氢气含量，载气为氮气。测定时用1ml注射器吸取放氢瓶气体部分500μl，注入进样孔，甲烷外标法计算气体体积。 [0068] 结果表明，CC425放氢量为每小时85umol氢气/mg叶绿素，即每小时3.57umol氢
7
气/10 个细胞，在淀粉含量提高的21株突变体中，有8株放氢量高于对照两倍以上，其中有
4株放氢量为对照的5倍以上，其余的部分突变体虽然淀粉含量高于对照，但放氢量并未明显升高，对淀粉含量比对照低的藻株进行放氢量测定，发现其放氢量均低于对照。部分峰图如图2所示，图2为筛选的衣藻突变体放氢量的测定结果.蓝色线为CC425峰谱图，其余为突变体峰谱图。用H2和CH4的峰面积比值，计算出H2的体积。

[0069] 在淀粉突变体中筛到数十个产氢变化明显的藻株，其中部分突变体淀粉含量与放 氢量对照图如图3所示，图3为筛选的衣藻突变体与对照CC425淀粉和放氢量的比值。图3所示，虽然淀粉含量的变化和放氢量并没有直接的线性关系，但是大部分淀粉变化明显的的突变体(如SA-1，SA-2，SA-5，SA-6，SA-9，SA-10等)其放氢量与对照CC425相比，也发生了明显的变化。因此用淀粉含量的变化筛选放氢相关突变体是一种有效的高通量的方法。 [0070] 将上述放氢量最高的突变株命名为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CrSA-3，于2010年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号分别为CGMCC№.3983。

[0071] 采用本方法中3(2)、3(3)步骤分别测定对照组和CrSA-3的淀粉含量和放氢量，发现CrSA-3淀粉含量是对照的4.5倍，但放氢量可达到对照的10倍。