一种红海榄根际纤维素降解真菌新种Hypoxylonsp.DPZ-SYz-36及其应用

摘要

本发明公开了一种红海榄根际纤维素降解真菌新种Hypoxylon sp.DPZ-SYz-36及其应用。炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36于2011年05月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No：4872。该菌具有产纤维素酶活性，可用于生产纤维素酶，因此对纤维素酶的生产和利用具有重要的价值。进一步可以用于制作生物有机质降解菌肥。

权利要求

1.一种炭团菌（Hypoxylon sp.）DPZ-SYz-36，其保藏编号为：CGMCC No.4872。

2.权利要求1所述的炭团菌（Hypoxylon sp.）DPZ-SYz-36在产纤维素酶中的应用。

3.权利要求1所述的炭团菌（Hypoxylon sp.）DPZ-SYz-36在制备生物有机质降解菌肥中的应用。

说明书

一种红海榄根际纤维素降解真菌新种Hypoxylon

sp.DPZ-SYz-36及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种红海榄根际纤维素降解真菌新种炭团菌（Hypoxylon sp.）DPZ-SYz-36及其在生产纤维素酶和制备生物有机质降解菌肥中的应用。 [0002] 背景技术：

[0003] 红树林为自然分布于热带、亚热带海岸潮间带的木本植物群落，覆盖大约60～75%热带和亚热带海岸，对维护海湾河口的生态平衡起重要作用，是海洋生产力的重要组成部分（Holguin et al.,2001；龙寒等，2005），被认为是具有较高生产力的生态系统之一。该生态系统具有较高的有机质水平（全球每年凋落物为100Tg C），为毗连的沿岸水域和相关的生物群落生境提供有机物（Holguin et al.,2001;Lugomela and Bergman,2002）。由于红树林沉积物具有强还原性、强酸性、高含盐量、营养丰富(Takeuchi M et al.,1998;林鹏，1997)等特征。因此，这里蕴涵了大量独特的微生物、酶和基因资源。近年，红树林独特的生态环境和丰富的物种多样性引起了更多海洋科学工作者的关注。但红树林区的微生物学研究起步较晚，研究较为薄弱。目前，红树林区微生物学研究主要集中在：红树林微生物区系研究；凋落物分解过程中的微生物学研究；红树林根际放线菌研究；红树林区微生物污染生态学研究(Yuan KP et al.,2005;Muniswaran A.et al.1994)。

[0004] 随着化石燃料的短缺，能源是人类面临的重大问题。寻找和开发可再生能源和新能源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。纤维素与石化燃料不同，它是一种可再生的资源。地球上每年光合作用可产生大约100亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素（Campbell BA et al.,1998）。另外，人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素物质，如 农业废弃物(稻草、稻壳、秸秆、花生壳、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等)、食品加工废弃物(果皮、果渣等)、木材废弃物(木屑、树皮)以及城市废弃物(40％～60％固体废物是垃圾和废纸)等。如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素资源转化成简单糖，再发酵产生乙醇等能源物质，不仅可以变废为宝，而且还可以避免由于化石燃料燃烧所带来的环境污染，同时可以缓解或解决石化能源短缺乃至枯竭所带来世界性能源危机。 [0005] 由于微生物在纤维素利用方面的独特优势，寻找新的纤维素利用菌种和开发高产纤维素酶菌种，是纤维素资源高效利用的关键。能够利用和分解纤维素的物种不仅有真核微生物如绿色木霉(T.virid)、黑曲霉(Aspergillus niger)和里氏木霉(Trichogerma reesei)等主要产纤维素酶的真菌，其中木霉属是研究最广泛的纤维素酶产生菌，世界纤维素酶市场中20％的纤维素酶来自木霉属和曲霉属，但近年来，新的纤维素降解菌株的研究报道也日渐增多(Mario CNS et al.，2008；Revankar MS et al.，2006)。另外，还有一些原生动物和细菌也能分解纤维素类物质，但由于细菌分泌的纤维素酶量少，而且产生的酶属胞内酶或者吸附于细胞壁上，故工业上较少用细菌做纤维素酶的生产菌种。此外，有的动物如白蚁、小龙虾等也能产生完全不同于其内共生微生物群落所产的纤维素酶。由于纤维素降解真菌在能源利用方面有着其重要的作用，为此很多科学工作者对这类真菌进行了大量的研究并取得了显著的成果。发明内容：

[0006] 本发明的第一个目的是提供一种从中国海南省三亚市红海榄植物根际沉积物中筛选出的，具有较高的纤维素降解活性的真菌新种：炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36，该菌于2011年05月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No：4872。

[0007] 本发明的红海榄根际纤维素降解真菌新种：炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36，是从中国海南省三亚市红海榄植物根际沉积物中筛选出的。

[0008] 其菌学特性描述如下：

[0009] 菌种描述：如图1所示，菌株营养菌丝壁光滑，具分隔，分枝，宽1.5-3.6μm。未见任何类型孢子。麦芽汁琼脂培养基上菌落生长较快，25℃黑暗条件下14天菌落直径40-45mm，白色，絮状，气生菌丝茂盛；菌落背面中到暗褐色，无水溶性色素，对多种抗生素有明显抗性。将该菌株接种到以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为主要碳源的平板上，在30℃培养
3天后，可形成直径19mm的水解透明圈(图1D)，表明该菌株具有较高的纤维素等生物质降解活性。

[0010] 常规方法从炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36的纯培养物提取基因组DNA，运用rDNA内转录间隔区(ITS)序列特定的引物ITS1/ITS4，通过PCR扩增和测序分析得到ITS序列，其序列如SEQ ID NO.1所示。运用β微管蛋白(β-tubulin)序列特定的引物Bt2a/Bt2b，通过PCR扩增和测序分析得到β-tubulin序列，其序列如SEQ ID NO.2所示。运用28s rDNA序列特定的引物LROR/LR7，通过PCR扩增和测序分析得到28s rDNA序列，其序列如SEQ ID NO.3所示。通过GenBank中的BLAST软件将ITS序列、β-tubulin序列和28s rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对，在数据库中没有找到完全相似的序列，表明这3条基因序列为首次发现的新基因序列。

[0011] 在GenBank数据库中选取了部分与测定序列相似性较高的代表性基因序列，通过ClustalW软件和Mega软件以Neibor-joining方法构建系统进化树(见图2、3、4)，进行系统发育分析。从系统发育树可以看出炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36与已知的真菌具有较大的差异性。其rDNA内转录间隔区(ITS)序列测序分析表明：与其亲缘关系较近的Hypoxylon monticulosum(FM209467.1)序列相似性达到99％，与Hypoxylon sp.(DQ631939.1)序列相似性达到98％；但其β微管蛋白(β-tubulin)序列除与Hypoxylon monticulosum(AY951737.1)具有97％的相似性外，与其他菌株的相似性都小于90％。另外，与其28s rDNA序列亲缘关系最近的一株内生真菌(EF420088.1)序列相似性只有96％，它在进化树中单独形成一个分支。结合其形态学特征，我们将其归入炭团菌属(Hypoxylon)，是一株炭团菌属的新种，命名为：炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36。 [0012] 对菌株Hypoxylon sp.DPZ-SYz-36的纤维素酶活(CMC酶活)研究表明：炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36在30℃、pH 7.0条件下，液体发酵，发酵液的纤维素酶活在10天左右达到121.1U/L(图5)。同时用含有Hypoxylon sp.DPZ-SYz-36的菌液制剂进行红海榄树叶降解试验。结果表明：经过10天的降解处理红海榄树叶失重率达到68.9％，由此说明Hypoxylon sp.DPZ-SYz-36具有较好的纤维素等生物质降解活性。因此本发明的第二个目的是提供炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36在产纤维素酶中的应用。

[0013] 本发明的第三个目的是提供炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36在制备生物有机质降解菌肥中的应用。

[0014] 本发明提供了一种红海榄根际纤维素降解真菌新种：炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36，该菌具有产纤维素酶活性，可用于生产纤维素酶，因此对纤维素酶的生产和利用具有重要的价值。进一步可以用于制作生物有机质降解菌肥。

[0015] 本发明的炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36于2011年05月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No：4872。
附图说明：

[0016] 图1是Hypoxylon sp.DPZ-SYz-36菌落在麦芽汁培养基上生长情况(A)、光学显微镜照片(B和C)以及Hypoxylon sp.DPZ-SYz-36菌落在CMC-刚果红平板上脱色情况(D)； [0017] 图2是Hypoxylon sp.DPZ-SYz-36在rDNA内转录间隔区(ITS)无根系统发育树中位置图；

[0018] 图3是Hypoxylon sp.DPZ-SYz-36在β微管蛋白(β-tubulin)无根系统发育树中位置图；

[0019] 图4是Hypoxylon sp.DPZ-SYz-36在28s rDNA无根系统发育树中位置图； [0020] 图5是Hypoxylon sp.DPZ-SYz-36液体发酵纤维素酶活(CMC酶活)图。 具体实施方式：

[0021] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。 [0022] 实施例1：

[0023] 1、材料

[0024] 1.1土样采集

[0025] 样品与2010年9月采自海南省三亚市红沙河沿岸红树林区红海榄(Rhizophora stylosa)根际沉积物，样品采集后装入灭菌的封口聚乙烯袋中，带回实验室4℃低温保存。 [0026] 1.2培养基

[0027] 1.2.1初筛培养基：

[0028] 每升初筛培养基的配制方法如下：马铃薯汁(马铃薯去皮，挖芽眼，洗净，切片。称200g放入1000ml自来水中，用文火煮沸30min，双层纱布过滤，滤液加水补至1000ml)800ml，蔗糖，20.0g；NaCl，1.5g；琼脂，15g，土壤浸提液，200ml；121℃灭菌后等培养基冷却至60℃加入过滤除菌的100μg/ml的氨苄青霉素和100μg/ml的硫酸链霉素各
1ml。

[0029] 1.2.2复筛培养基(g/L)：

[0030] 每升复筛培养基的配制方法如下：CMC-Na 10.0g；蛋白胨0.5g；酵母提取物0.5g；蔗糖0.5g；KNO3 1.0g；K2HPO4 0.5g；MgSO4.7H2O 0.5g；NaCl 1.5g；琼脂15g，水1000mL。
121℃灭菌备用。

[0031] 1.2.3保藏培养基：

[0032] 每升保藏培养基的配制方法如下：马铃薯汁(马铃薯去皮，挖芽眼，洗净，切片。称200g放入1000ml自来水中，用文火煮沸30min，双层纱布过滤，滤液加水补至1000ml)1000ml，蔗糖，20.0g；NaCI，1.5g；琼脂，15g。121℃灭菌备用。 [0033] 1.2.4发酵培养基：

[0034] 每升发酵培养基的配制方法如下：CMC-Na 5.0g；蛋白胨1.0g；酵母提取物1.0g；蔗糖1.0g；KNO3 1.0g；K2HPO4 0.5g；MgSO4.7H2O 0.5g；NaCl 1.5g；水1000mL。121℃灭菌备用。

[0035] 1.2.5红海榄树叶降解实验培养基：

[0036] 每升红海榄树叶降解实验培养基的配制方法如下：蛋白胨0.5g，酵母粉1.0g，蔗糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，红海榄树叶3.3g，NaCl 2.0g，CaCO3 1.0g，MgSO4 1.0g，水1000mL。121℃灭菌备用。

[0037] 2、方法

[0038] 2.1菌株的分离筛选

[0039] 从样地选取三株红海榄(Rhizophora stylosa)，采集它们的根际沉积物样品50g，将三份样品混匀后取约5g置于含50ml灭菌蒸馏水的三角瓶中37℃、150r/min震荡摇匀-3 -4 -515min，静 置30sec后取1ml的液体梯度稀释至10 、10 、10 ，接种量为0.05mL，涂布于初筛培养基上，每一处理设8个重复。37℃培养3-5天，挑取形态典型的单一菌落进行点接纯化2-3次得到纯培养物。将得到纯培养物接种到复筛培养基上，30℃倒置培养3天，在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1mg/mL的刚果红溶液10～15min后，倒去刚果红溶液，再加入浓度为1mol/L的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围将会出现透明圈。根据初步脱色效果辨别具有产纤维素酶的菌株，测量透明圈直径和菌落直径，筛选效果较好的菌株进行下一步研究。由此而获得一株菌株纯培养物，命名为DPZ-SYz-36，将其保存于保藏培养基中。

[0040] 2.2菌株形态学特征鉴定

[0041] 菌株的形态学特征及初步的鉴定依据《真菌鉴定手册》。

[0042] 上一步骤筛选得到的菌株DPZ-SYz-36，其菌种形态学特征描述如下：如图1所示，菌株营养菌丝壁光滑，具分隔，分枝，宽1.5-3.6μm。未见任何类型孢子。麦芽汁琼脂培养基上菌落生长较快，25℃黑暗条件下14天菌落直径40-45mm，白色，絮状，气生菌丝茂盛；菌落背面中到暗褐色，无水溶性色素，对多种抗生素有明显抗性。将该菌株接种到以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为主要碳源的平板上，在30℃培养3天后，可形成直径19mm的水解透明圈(图1D)，表明该菌株具有较高的纤维素等生物质降解活性。

[0043] 2.3菌株分子生物学鉴定

[0044] 对获得的纯培养物菌株DPZ-SYz-36使用上海生工公司基因组抽提试剂盒提取DNA，然后用于目的基因的扩增。

[0045] 真菌ITS区部分序列的扩增采用通用引物ITS1/ITS4(T.J.White，T.Bruns，et al1990)

[0046] ITS1：5′--TCCGTAGGTGAACCTGCGG--3′，

[0047] ITS4：5′--TCCTCCGCTTAT TGATATGC--3′。

[0048] β- 微 管 蛋 白 (β-tubulin) 序 列 的 扩 增 采 用 通 用 引 物 Bt2a/Bt2b(Glass&Donaldson，1995)

[0049] Bt2a：5′--GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC--3′，

[0050] Bt2b：5′--ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC--3′；

[0051] 28s rDNA序列的扩增采用通用引物LROR/LR7(Vilgalys，R.&M.Hester.1990.) [0052] LROR：5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′，

[0053] LR7：5′-TACTACCACCAA GATCT-3′。

[0054] PCR反应体系和反应条件如下：

[0055] PCR反应体系包括： PCR反应程序是：

[0056]

[0057] 取2μL PCR产物，1％琼脂糖电泳进行产物检测。扩增产物经纯化后，送交测序公司测序。运用rDNA内转录间隔区(ITS)序列特定的引物ITS1/ITS4，通过PCR扩增和测序分析得到ITS序列，其序列如SEQ ID NO.1所示。运用β微管蛋白(β-tubulin)序列特定的引物Bt2a/Bt2b， 通过PCR扩增和测序分析得到β-tubulin序列，其序列如SEQ ID NO.2所示。运用28s rDNA序列特定的引物LROR/LR7，通过PCR扩增和测序分析得到28s rDNA序列，其序列如SEQ ID NO.3所示。通过GenBank中的BLAST软件将ITS序列、β-tubulin序列和28s rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对，在数据库中没有找到完全相似的序列，表明这3条基因序列为首次发现的新基因序列。

[0058] 在GenBank数据库中选取了部分与测定序列相似性较高的代表性基因序列，通过ClustalW软件和Mega软件以Neibor-joining方法构建系统进化树(见图2、3、4)，进行系统发育分析。从系统发育树可以看出炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36与已知的真菌具有较大的差异性。其rDNA内转录间隔区(ITS)序列测序分析表明：与其亲缘关系较近的Hypoxylon monticulosum(FM209467.1)序列相似性达到99％，与Hypoxylon sp.(DQ631939.1)序列相似性达到98％；但其β微管蛋白(β-tubulin)序列除与Hypoxylon monticulosum(AY951737.1)具有97％的相似性外，与其他菌株的相似性都小于90％。另外，与其28s rDNA序列亲缘关系最近的一株内生真菌(EF420088.1)序列相似性只有96％，它在进化树中单独形成一个分支。结合其形态学特征，我们将其归入炭团菌属(Hypoxylon)，是一株炭团菌属的新种，命名为：炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36。 [0059] 2.4纤维素酶活(CMC酶活)的测定

[0060] 将炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36接种于250ml发酵培养基中，30℃、ph7.0条件下，每天取少量的发酵液测定发酵液的纤维素酶活性。发酵液经6000r/min离心
10min，上清液作为粗酶液。于25ml的具塞刻度玻璃试管中加入0.5mL适当稀释的酶液，
50℃恒温水浴预热2min后，加入2.0mL用pH 4.8醋酸缓冲液配制的1％羧甲基纤维素钠溶液，50℃恒温水浴 酶解30min，然后加入2.5mL的DNS于沸水浴中5min，流水冷却后定容至25ml混匀，在520nm下测定其吸光值，对照标准曲线后测算酶活力。发酵液的酶活如图
5所示，由图5可知，发酵液具有纤维素酶活性，随着发酵时间的延长，其纤维素酶活性逐渐升高，10天左右发酵液的纤维素酶活达到121.1U/L。由此表明本发明的炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36具有产纤维素酶活性。

[0061] 酶活力按照国际单位规定定义为：每分钟催化纤维素水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位U。

[0062] 2.5炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36的红海榄树叶降解试验

[0063] 将炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36接种到固体PDA平板上，等菌落长到一定大小后用6cm打孔器取三块菌苔接种分别接种到三瓶含有250ml的红海榄树叶降解实验培养基中，静置培养10天，红海榄树叶失重率达到68.9％，由此说明炭团菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36菌株具有较好的纤维素等生物质降解活性。