特异性体外干扰人T细胞中LAT蛋白表达的SiRNA及其用途

摘要

本发明公开了一种特异性体外干扰人T细胞中LAT蛋白表达的SiRNA，选自以下三对SiRNA序列的任意一对序列：由编码SEQ ID NO.1所示序列和编码SEQ ID NO.2所示序列构成的SiRNA1，由编码SEQ ID NO.3所示序列和编码SEQ ID NO.4所示序列构成的SiRNA2，或者由编码SEQ ID NO.5所示序列和编码SEQ ID NO.6所示序列构成的SiRNA3。此外，本发明还公开了上述SiRNA在体外干扰人T细胞的LAT蛋白表达中的应用。本发明的特异性体外干扰人T细胞中LAT蛋白表达的SiRNA能够特异高效地体外敲除人T细胞的LAT蛋白，对LAT蛋白具有明显的干扰效果。

权利要求

1.一种特异性体外干扰人T细胞中LAT蛋白表达的SiRNA，其特征在于，选自以下三对SiRNA序列的任意一对序列：由编码SEQ ID NO.1所示序列和编码SEQ ID NO.2所示序列构成的SiRNA1，由编码SEQ ID NO.3所示序列和编码SEQ ID NO.4所示序列构成的SiRNA2，或者由编码SEQ ID NO.5所示序列和编码SEQ ID NO.6所示序列构成的SiRNA3。

2.如权利要求1所述的SiRNA在体外干扰人T细胞的LAT蛋白表达中的应用，所述应用不包括在疾病诊断和治疗上的应用。

说明书

特异性体外干扰人T细胞中LAT蛋白表达的SiRNA及其用

途

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及三对特异性体外干扰人T细胞中LAT(Linkerfor activation of T cell)蛋白表达的SiRNA，另外本发明还涉及此SiRNA的用途。

背景技术

[0002] T细胞活化衔接蛋白(Linker for the activation of T cells，LAT)是一个分子量大约为36-38kDa，并在TCR发生交联后被迅速磷酸化的蛋白。LAT属于完整的跨膜衔接蛋白，并通过近膜的两个棕榈酰化序列定位于T细胞上富含糖脂的脂筏区域，是T细胞信号转导中ZAP-70的主要作用底物之一，并可招募和活化许多下游信号分子诸如Gads，Grb2以及PLC-γ1等，参与TCR介导的信号转导，并在T细胞发育和活化过程中起重要作用。

[0003] LAT在T细胞信号转导中发挥重要作用的分子机制在于被磷酸化的LAT分子可以招募和结合与T细胞活化信号相关的多个含有SH2基序的胞浆分子，如Gads，Grb2以及PLC-γ1等，这些游离于胞浆中的分子一旦和LAT分子结合后，一方面在空间上可以形成区域化的复合物，同时这些在空间上相互靠近的分子可以进一步相互作用，或者是被磷酸化，或者可以结合更多的分子，如和LAT结合的PLC-γ1在结合的同时也被进一步激活，水解胞内PIP2(磷脂酰肌醇二磷酸)产生两种第二信使即DAG和IP3。IP3引发钙离子内流提高胞内的钙离子量，这条通路最终激活转录因子NF-AT，并进而进入细胞核内；DAG则通过Ras-MAPK途径和PKC途径分别激活转录因子AP-1和NF-κB，促使其进入细胞核内后，上述三个转录因子通过和IL-2基因的启动子区结合最终导致IL-2的分泌；和磷酸化的LAT分子结合的另一个重要的分子则是胞浆中的衔接蛋白Gads，通过Gads可以将TCR信号转导中的另一个关键蛋白SLP-76招募至TCR分子附近，最终介导细胞骨架重组和黏附分子表达的改变等，从而导致T细胞的完全活化。由此可见LAT在T细胞信号转导中的重要性在于作为TCR受到外界抗原信号后发生系列酶学催化反应的早期阶段，LAT分子作为参与的膜分子起着承上启下的作用，并最终将TCR在胞外接受到的刺激信号转化为胞浆内的各个信号转导通路，并进而导致T细胞的活化和分化。尽管目前对TCR受到的抗原信号是如何决定T细胞活化和分化的命运的分子机制还不甚了解，但是可以推断无论是何种结局，LAT分子在其中发挥着关键作用。

[0004] LAT在T细胞信号转导中的关键作用在体外细胞系统和小鼠体内系统中都得到印证：LAT分子基因敲除的小鼠外周表达CD3，CD4，CD8的αβT或γδT细胞均缺失，分析胸- -腺中胸腺细胞的发育，发现胸腺细胞的发育被阻滞在CD4CD8 阶段，大多数的胸腺细胞被+ - + + - + +
阻滞在CD25CD44 的DN3阶段(在T细胞分化为CD4CD8 之前经历了CD25CD44-CD25CD+ + - - -
44-CD25CD44-CD25CD44 四个阶段)，而DN3阶段正是由LAT参与的preTCR介导的信号对胸腺细胞的发育和选择起关键作用的阶段，而LAT分子的缺失导致preTCR信号的缺失，从而导致胸腺细胞的发育受阻；而在T细胞系细胞株中LAT分子的缺失则直接导致TCR对外界刺激的无应答。

[0005] 鉴于LAT在TCR信号转导中的关键作用，而在自身免疫病或是移植排斥中T细胞应答存在异常增高，如果能够特异性减低或是减少这些病理状态下T细胞中LAT分子的表达，则有望可以降低病理状态下的免疫应答，从而达到缓解疾病的目的。

[0006] 为此，通过建立体外干扰LAT分子表达的方法(如SiRNA)，为进一步研究LAT在T细胞信号通路中的分子机制和临床应用前景提供了有效的新手段。

[0007] siRNA干扰：

[0008] RNA干扰(RNAi)的基本原理是利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)迅速阻断序列特异的目标基因的表达活性，是实验室中是一种有效的阻断基因表达的工具。

[0009] siRNA有如下特点：

[0010] 1.SiRNA长度一般在22nt左右，结构上属于双链RNA。

[0011] 2.SiRNA一般是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干扰的中间产物。

[0012] 3.在作用位置上，siRNA可作用于mRNA的任何部位，并与mRNA完全互补。

[0013] 4.在作用方式上，siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。

发明内容

[0014] 本发明要解决的技术问题之一是提供特异性体外干扰人T细胞中LAT(Linker foractivation of T cell)蛋白表达的SiRNA。

[0015] 本发明要解决的技术问题之二是提供了上述SiRNA在体外干扰人T细胞的LAT蛋白表达中的应用。

[0016] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

[0017] 在本发明的内容之一，是提供一种特异性体外干扰人T细胞中LAT蛋白表达的SiRNA，选自以下三对SiRNA序列的任意一对序列：由编码SEQ ID NO.1所示序列和编码SEQ ID NO.2所示序列构成的SiRNA1，由编码SEQ ID NO.3所示序列和编码SEQID NO.4所示序列构成的SiRNA2，或者由编码SEQ ID NO.5所示序列和编码SEQ ID NO.6所示序列构成的SiRNA3(见表1)。本发明通过应用计算机软件设计了以上三对针对LAT蛋白不同位点的特异SiRNA序列(SiRNA1、SiRNA2、SiRNA3)，经公司合成后，通过优化实验条件，在体外特异高效地敲除LAT蛋白。

[0018] 表1：特异性针对LAT蛋白的SiRNA序列

[0019]

[0020] 在本发明的内容之二，是提供上述SiRNA在体外干扰人T细胞的LAT蛋白表达的应用。

[0021] 本文所用术语“AMAXA转染系统”是指利用AMAXA公司的电转仪，利用一定的程序，通过电击细胞在细胞膜上形成微孔的方式将特异的SiRNA序列在体外转染至细胞当中。按照转染试剂盒的要求：转染PBMC细胞应用程序选取U-014，Jurkat细胞株则选择X-001程序。

[0022] 本文术语“PBMC”全称为peripheral blood mononuclear cell即外周血单核细胞，包括人T细胞，为原代细胞。

[0023] 本文术语“Jurkat”是一种人T细胞细胞株，属急性T细胞白血病细胞系。生长方式为悬浮生长，生长速度较快，采用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。

[0024] 本 文 术 语“mTF”是 指 一 种 无 关 SiRNA对 照，其 序 列 为 mTF233：GCAUUCCAGAGAAAGCGUUUA(SEQ ID NO.7)；AACGCUUUCUCUGGAAUGCCU(SEQ ID NO.8)。

[0025] 经实验验证，本发明设计的这三对特异SiRNA序列所合成的SiRNA，经AMAXA转染系统转染人外周血T细胞和Jurkat细胞株后，能在体外特异性的敲除LAT(Linkerfor Activation of T cell)蛋白，并通过Western Blot方法验证了其体外敲除的效果，证明此三种序列的特异性和有效性。此外，通过一系列的体外实验证明，LAT蛋白体外成功干扰后，T细胞的细胞因子分泌，信号通路蛋白磷酸化水平的变化也均产生了明显的变化，从而证明本发明设计的这三对特异SiRNA序列所合成的SiRNA能够特异高效地体外敲除人T细胞的LAT蛋白，并对相应的T细胞的免疫应答产生变化。

附图说明

[0026] 图1是实施例2在T细胞株Jurkat中，应用SiRNA1，2，3(分别代表120313，120314，120315序列所合成SiRNA)对LAT蛋白的干扰效果图。Jurkat指示细胞未经SiRNA干扰，NC-FAM为上海吉玛公司合成的无关对照SiRNA，这两组LAT蛋白保持不变。1，2，3指示应用三条不同的特异SiRNA序列转染Jurkat细胞株。

[0027] 图2是实施例3在人外周血PBMC中，应用120315序列所合成的SiRNA对LAT蛋白的干扰效果图。PC指细胞未经SiRNA干扰，NC-FAM为吉玛公司合成的无关对照SiRNA，NC-FAM为阴性对照，PC为阳性对照，这两组LAT蛋白保持不变。48，72，96指示应用120315序列所合成SiRNA转染PBMC后48小时，72小时，96小时的干扰效果。

[0028] 图3是实施例4在正常人PBMC细胞转染LAT特异SiRNA48小时后，使用Invitrogen公司提供的抗CD3/CD28抗体磁珠刺激T细胞48小时，检测细胞因子IL-2的分泌情况示意图，其中，mTF组为无关SiRNA对照。

[0029] 图4是实施例5中在正常人PBMC细胞转染LAT特异SiRNA 48小时后，Western检测细胞中Erk蛋白磷酸化水平的变化情况示意图。

[0030] 图5是实施例5中在正常人PBMC细胞转染LAT特异SiRNA 48小时后，Western检测细胞中PLC-gamma1蛋白磷酸化水平的变化情况示意图。

具体实施方式

[0031] 实施例1SiRNA序列的设计

[0032] 应 用Invitrogen 公 司 提 供 的 在 线SiRNA 设 计 软 件 BLOCK-iTTM RNAi Designer(https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)设计了三对针对LAT蛋白不同位点的特异SiRNA序列(见表1)。将目的蛋白LAT的核苷酸序列输入软件当中，软件会自动生成一系列SiRNA序列，然后根据自己的需要选择其中合适的序列进行合成应用。后续试验中所应用的SiRNA均由Invitrogen公司代为合成(采用本领域公知的常规方法合成)，其合成流程为：

[0033] 1.化学合成单链SiRNA。

[0034] 2.单链SiRNA经过MOLDI-TOF质谱和HPLC分析。

[0035] 3.退火。

[0036] 4.PAGE电泳验证退火效率。

[0037] 5.保证高SiRNA的高纯度。

[0038] 6.成品SiRNA经DEPC水(用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水)重悬后-80℃保存。

[0039] 表1：特异性针对LAT蛋白的SiRNA序列

[0040]

[0041] 实施例2在T细胞株Jurkat中SiRNA序列对LAT蛋白的干扰效果

[0042] 在T细胞株Jurkat中，应用SiRNA1，2，3(分别代表上述表1中的120313，120314，120315序列所合成SiRNA)对LAT蛋白进行干扰效果实验，其具体步骤为：

[0043] (1)收集Jurkat细胞(Jurkat-E6细胞株，购自中国科学院上海分院)1500rpm，6
5min离心，弃上清，并调节细胞数至10/管。

[0044] (2)在电转杯中加入100ul(微升)电转液(AMAXA公司提供)和SiRNA(终浓度为150pmol见表1，Invitrogen公司合成)，将电转杯置于AMAXA电转仪中，采用程序X-001进行转染。

[0045] (3)从电转杯中轻取出细胞悬液，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养48小时。

[0046] (4)收集Jurkat细胞1500rpm，5min离心，弃上清，调节细胞数至0.5X106/管，并离心去上清，并加入50ul蛋白裂解液裂解。

[0047] (5)采用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳行蛋白电泳，其中采用70V电压进行浓缩，110V电压进行分离，至溴酚兰前沿行至凝胶底部，终止电泳，并采用半干法13V恒压转膜1小时，将蛋白转移至硝酸纤维素(NC膜)上(Bio-Rad公司提供)。

[0048] (6)转膜结束后，取下NC膜，置于含5％牛奶的TBST缓冲液中封闭一小时后，置于1∶1000稀释的含抗LAT抗体(CST公司)的TBST缓冲液中，4℃孵育过夜。

[0049] (7)将孵育过夜的NC膜以TBST缓冲液洗涤三次后，加入1∶2000稀释的羊抗兔二抗(KPL公司)含5％牛奶的TBST缓冲液中，室温孵育一小时。

[0050] (8)将NC膜曝光。

[0051] 实验结果如图1所示，“Jurkat”指示细胞未经SiRNA干扰，“NC-FAM”为吉玛公司合成的无关对照SiRNA，这两组LAT蛋白保持不变；1，2，3指示应用三条不同的特异SiRNA序列转染Jurkat细胞株。结果证明：在T细胞株Jurkat中，应用设计的这三对特异SiRNA序列SiRNA 1，2，3(分别代表上述表1中的120313，120314，120315序列所合成SiRNA)对LAT蛋白具有明显的干扰效果。

[0052] 实施例3在人外周血PBMC中SiRNA序列对LAT蛋白的干扰效果

[0053] 在人外周血PBMC中，应用表1中的120315序列所合成的SiRNA对LAT蛋白进行干扰效果实验，其具体步骤为：

[0054] (1)收集PBMC细胞(分离自健康捐献者外周血，采集者：上海市免疫学研究所地7
址：重庆南路280号五号楼1109室)1500rpm，5min离心，弃上清，调整细胞浓度至10/管。

[0055] (2)在电转杯中加入100ul(微升)电转液(AMAXA公司提供)和SiRNA(终浓度为150pmol见表1，Invitrogen公司合成)，将电转杯置于AMAXA电转仪中，采用程序U-014进行转染。

[0056] (3)从电转杯中轻取出细胞悬液，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养48小时。

[0057] (4)收集转染后PBMC细胞1500rpm，5min离心，弃上清，调节细胞数至0.5X106/管，并离心去上清，并加入50ul蛋白裂解液裂解。

[0058] (5)采用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳行蛋白电泳，其中采用70V电压进行浓缩，110V电压进行分离，至溴酚兰前沿行至凝胶底部，终止电泳，并采用半干法13V恒压转膜1小时，将蛋白转移至硝酸纤维素(NC膜)上(Bio-Rad公司提供)。

[0059] (6)转膜结束后，取下NC膜，置于含5％牛奶的TBST缓冲液中封闭一小时后，置于1∶1000稀释的含抗LAT抗体(CST公司)的TBST缓冲液中，4℃孵育过夜。

[0060] (7)将孵育过夜的NC膜以TBST缓冲液洗涤三次后，加入1∶2000稀释的羊抗兔二抗(KPL公司)含5％牛奶的TBST缓冲液中，室温孵育一小时。

[0061] (8)将NC膜曝光。

[0062] 实验结果如图2所示，PC指细胞未经SiRNA干扰，NC-FAM为吉玛公司合成的无关对照SiRNA，这两组LAT蛋白保持不变。48，72，96指示应用120315序列所合成的SiRNA转染PBMC后48小时，72小时，96小时的干扰效果。结果证明：在人外周血PBMC中，应用设计的120315序列所合成的SiRNA对LAT蛋白具有明显的干扰效果。

[0063] 实施例4

[0064] 在正常人PBMC细胞转染LAT特异SiRNA48小时后，使用抗CD3/CD28抗体磁珠(Invitrogen公司)刺激T细胞48小时，检测细胞因子IL-2分泌情况，mTF组为 无 关 SiRNA对 照 (其 序 列 为mTF233：GCAUUCCAGAGAAAGCGUUUA(SEQ ID NO.7)；AACGCUUUCUCUGGAAUGCCU(SEQ ID NO.8))，其具体步骤为：

[0065] (1)收集PBMC细胞(分离自健康捐献者外周血，采集者：上海市免疫学研究所地7
址：重庆南路280号五号楼1109室)1500rpm，5min离心，弃上清，调整细胞浓度至10/管。

[0066] (2)在电转杯中加入100ul(微升)电转液(AMAXA公司提供)和SiRNA(终浓度为150pmol见表1，Invitrogen公司合成)，将电转杯置于AMAXA电转仪中，采用程序U-014进行转染。

[0067] (3)从电转杯中轻取出细胞悬液，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养48小时。

[0068] (4)收集转染后PBMC细胞1500rpm，5min离心，弃上清，调节细胞数至0.5X106/管，并离心去上清，并加入50ul蛋白裂解液裂解。

[0069] (5)采用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳行蛋白电泳，其中采用70V电压进行浓缩，110V电压进行分离，至溴酚兰前沿行至凝胶底部，终止电泳，并采用半干法13V恒压转膜1小时，将蛋白转移至硝酸纤维素(NC膜)上(Bio-Rad公司提供)。

[0070] (6)转膜结束后，取下NC膜，置于含5％牛奶的TBST缓冲液中封闭一小时后，置于1∶1000稀释的含抗LAT抗体(CST公司)的TBST缓冲液中，4℃孵育过夜。

[0071] (7)将孵育过夜的NC膜以TBST缓冲液洗涤三次后，加入1∶2000稀释的羊抗兔二抗(KPL公司)含5％牛奶的TBST缓冲液中，室温孵育一小时。

[0072] (8)将NC膜曝光。

[0073] (9)细胞转染48小时后，收集细胞，1500rpm，5min离心，弃上清，培养基(1640培6
养液+10％胎牛血清-均购自GIBICO公司)重悬细胞至浓度为2X10/ml，100ul/well种于
96孔培养板(Costar公司)。

[0074] (9)采用Invitrogen公司提供的抗CD3/CD28抗体磁珠刺激T细胞，刺激强度为6
1bead/cell(1珠/细胞)时候，使用25ul beads/10cell(珠)，分别设立0，0.1，0.25，0.5，
1bead/cell的刺激强度梯度，培养体系200ul。将种好细胞的培养板置于37℃，含5％二氧化碳的细胞培养箱，培养48小时。

[0075] (10)采用Ebioscience公司IL-2检测试剂盒，应用ELISA方法检测细胞因子IL-2分泌情况。

[0076] 实验结果如图3所示，应用LAT特异性SiRNA成功干扰T细胞中LAT蛋白(如western结果所示)后，细胞因子IL-2分泌呈现上调趋势。结果证明：本实验不但特异的在体外成功干扰掉了LAT蛋白的表达，而且对细胞因子IL-2分泌产生了影响，进一步说明我们所设计的SiRNA的有效性。

[0077] 实施例5

[0078] 在正常人PBMC细胞转染LAT特异SiRNA 48小时后，Western检测T细胞中信号通路中重要蛋白如Erk，PLC-gamma1等磷酸化水平的变化情况，其具体步骤为：

[0079] 1.干扰效果鉴定

[0080] (1)收集PBMC细胞(分离自健康捐献者外周血，采集者：上海市免疫学研究所地7
址：重庆南路280号五号楼1109室)1500rpm，5min离心，弃上清，调整细胞浓度至10/管。

[0081] (2)在电转杯中加入100ul(微升)电转液(AMAXA公司提供)和SiRNA(终浓度为150pmol见表1，Invitrogen公司合成)，将电转杯置于AMAXA电转仪中，采用程序U-014进行转染。

[0082] (3)从电转杯中轻取出细胞悬液，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养48小时。

[0083] (4)收集转染后PBMC细胞1500rpm，5min离心，弃上清，调节细胞数至0.5X106/管，并离心去上清，并加入50ul蛋白裂解液裂解。

[0084] (5)采用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳行蛋白电泳，其中采用70V电压进行浓缩，110V电压进行分离，至溴酚兰前沿行至凝胶底部，终止电泳，并采用半干法13V恒压转膜1小时，将蛋白转移至硝酸纤维素(NC膜)上(Bio-Rad公司提供)。

[0085] (6)转膜结束后，取下NC膜，置于含5％牛奶的TBST缓冲液中封闭一小时后，置于1∶1000稀释的含抗LAT抗体(CST公司)的TBST缓冲液中，4℃孵育过夜。

[0086] (7)将孵育过夜的NC膜以TBST缓冲液洗涤三次后，加入1∶2000稀释的羊抗兔二抗(KPL公司)含5％牛奶的TBST缓冲液中，室温孵育一小时。

[0087] (8)将NC膜曝光。

[0088] 2.蛋白磷酸化检测

[0089] (1)细胞转染并培养48小时后，收集细胞，1500rpm，5min离心，弃上清，调整细胞6
至0.5X10/管，40ul含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液(均购自GIBCO公司)重悬细胞。

[0090] (2)应用2000ng/ml OKT3抗体(eBiosciece公司)2ul分别刺激细胞(37℃预热五分钟)0，5s，10s，15s，30s，60s，120s，然后使用95℃预热的5X SDS蛋白上样缓冲液溶液10ul终止反应，终止反应后继续将细胞置于95℃加热5分钟。

[0091] (3)采用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳行蛋白电泳，其中采用70V电压进行浓缩，110V电压进行分离，至溴酚兰前沿行至凝胶底部，终止电泳，并采用半干法13V恒压转膜1小时，将蛋白转移至硝酸纤维素(NC膜)上(Bio-Rad公司提供)。

[0092] (4)转膜结束后，取下NC膜，置于含5％牛奶的TBST缓冲液中封闭一小时后，置于1∶1000稀释的含抗Erk/PLC-gamma1磷酸化蛋白的抗体(CST公司)的TBST缓冲液中，
4℃孵育过夜。

[0093] (5)将孵育过夜的NC膜以TBST缓冲液洗涤三次后，加入1∶2000稀释的羊抗兔二抗(KPL公司)(含5％牛奶的TBST缓冲液稀释)，室温孵育一小时。

[0094] 3.非磷酸化蛋白检测(用作上样对照)

[0095] (1)采用碧云天公司提供的一抗二抗洗脱液，将一抗二抗洗脱。

[0096] (2)将NC膜置于含5％牛奶的TBST缓冲液室温封闭一小时，然后将将NC膜置于1∶1000稀释的抗Erk/PLC-gamma1抗体(CST公司)4℃孵育过夜。

[0097] (3)将孵育过夜的NC膜以TBST缓冲液洗涤三次后，加入1∶2000稀释的羊抗兔二抗(KPL公司)(含5％牛奶的TBST缓冲液稀释)，室温孵育一小时。

[0098] (4)将NC膜进行曝光。

[0099] 实验结果见图4和图5。如图4所示，应用LAT特异性SiRNA成功干扰T细胞中LAT蛋白后，T细胞内Erk磷酸化水平呈现降低趋势。如图5所示，应用LAT特异性SiRNA成功干扰T细胞中LAT蛋白后，T细胞内蛋白PLC-gamma1磷酸化水平降低。结果证明：本实验能特异的在体外成功干扰掉LAT蛋白的表达。在LAT成功干扰掉后，当T细胞以接受信号刺激时(抗CD3抗体刺激)T细胞信号通路中位于LAT下游的Erk/PLC-gamma1的磷酸化水平呈下降趋势。