水稻细胞转化方法

摘要

本发明提供一种利用PMI选择标记高效率地将外源基因导入水稻细胞的方法、所用的转化系统、以及利用该方法制备转基因水稻的方法。

权利要求

1.一种将外源基因导入水稻皖粳97品种的细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将成熟水稻谷粒去壳、灭菌后将胚分离出来；

(2)取步骤(1)所得的分离的胚置于愈伤组织诱导培养基上在30℃暗培养2周以产生次生愈伤组织，其中所述愈伤组织诱导培养基成分为N6大量元素、MS铁盐、B5微量元素、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L2,4-D、3g/L植物凝胶,pH值为5.8；(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织浸泡在携带外源基因和磷酸甘露糖异构酶标记基因的农杆菌EHA105悬液中20分钟，其中所述农杆菌的悬液是在侵染当天将农杆菌以OD660为0.05-0.25悬浮在如下所示成分组成的液体滤纸培养基中而制备的：N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2,4-D、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、100μmol/L乙酰丁香酮、pH5.20；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到液体滤纸共培养基上，23℃培养48小时，其中所述液体滤纸共培养基成分为N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、

500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2,4-D、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、100μmol/L乙酰丁香酮、pH5.20；

(5)将步骤(4)的愈伤组织置于恢复培养基上培养5天，其中所述恢复培养基为：N6大量元素、MS铁盐、B5微量元素、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L2,4-D、3g/L植物凝胶，添加250mg/L羧苄西林，pH值为5.8；

(6)将步骤(5)的愈伤组织转移到含有蔗糖和甘露糖的选择培养基上，在30℃暗培养

3周以获得出芽的愈伤组织，其中所述选择培养基成分是N6大量元素、MS铁盐、B5微量元素、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、以及蔗糖与甘露糖、2mg/L2,4-D、250mg/L羧苄西林、3g/L植物凝胶，pH值为5.8，所述蔗糖和甘露糖含量分别为5g/L的蔗糖和7.5g/L的甘露糖；

(7)将出芽的愈伤组织转移到再生培养基中继续培养，其中所述再生培养基成分为：

N6大量元素、MS铁盐、B5微量元素、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L2,4-D、2g/L CH,30g/L山梨醇,500mg/L MES,2.5mg/L CuSO4,2mg/L KT,0.02mg/LNAA,250mg/L羧苄西林,2g/L植物凝胶，pH值为5.8；和（8）在再生培养基中培养3周的愈伤组织转移至生根培养基中继续培养，其中所述生根培养基成分为：1/2MS基础盐2.165g/L,B5维生素,1.0g/L酪蛋白酶水解物,20g/L蔗糖,0.2mg/L NAA,125mg/L羧苄西林,3.5g/L植物凝胶，pH值为5.8；

其中步骤(3)中所述磷酸甘露糖异构酶标记基因核苷酸序列为编码SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

2.权利要求1中所述的一种将外源基因导入水稻皖粳97品种的细胞的方法，其中步骤(3)中所述磷酸甘露糖异构酶标记基因核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

3.一种生产转基因水稻皖粳97品种的方法，包括：

1)通过权利要求1或2的方法将外源基因导入水稻皖粳97品种的细胞；和

2)从步骤1)获得的细胞培育水稻皖粳97品种的植株。

说明书

水稻细胞转化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物遗传学和基因工程领域。更具体地说，本发明涉及利用农杆菌介导和PMI选择标记来制备转基因水稻的方法。

背景技术

[0002] 水稻(Oryza sativa)是全世界一半以上的人口，尤其是亚洲国家人口的主粮。随着人口膨胀和耕地减少，水稻产量越来越难以满足需要。到2050年，世界人口将从现在67亿人增加到92亿人(联合国，2007)，这就要求到2050年粮食供应还需增加50％。随着半矮秆品种和杂交稻的推广，转基因手段被认为可望成为水稻增产的另一个突破点。2002年水稻全基因组测序完成后，可读框的功能注释和具有农学意义的基因的应用成为了水稻科研人员的主要研究目标。实现这一目的的前提条件是必须开发出高效率的水稻转化系统。这样的系统必须具有“多、快、好(可重复性高、基于成熟胚)、省”的特征，即能够以更低的成本在更短的时间内产生出更多的可育植株。

[0003] 随着第一批转基因水稻问世以来(Zhang and Wu 1988；Toriyama et al.1988；Zhang et al.1988)，已经通过不同的转化方法，包括花粉管途径(Luo and Wu 1988)、微粒轰击(Christou et al.1991)、离子束(Yang et al.1994)等进行了大量的水稻转化研究。目前最常用的转化方法是农杆菌介导法。该方法由Hiei等人(Hiei et al.1994)建立。在此基础上，已经在粳稻(Chen et al.1998；Enriquez-Obregon et al.1999；Toki et al.2006)、籼稻(Lin and Zhang 2005；Hiei and Kumar 2006)和爪哇稻(Dong et al.1996；Diah and Anzai 2006)中建立了分别使用来源于成熟胚的愈伤组织或未成熟胚作为外植体的水稻转化系统。但这些转化系统中都需要用到抗生素或除草剂等有毒物质进行选择，对环境有潜在的影响。作为替代，已经有人开发了以磷酸甘露糖异构酶(pmi)基因作为选择标记，用无毒物质甘露糖作为正选择剂的转化系统(Joersbo and Okkels 1996)。

[0004] PMI是首先由Miles和Guest从大肠杆菌中分离出来并测序(Miles and Guest，1984)。植物利用PMI能够将大部分植物无法代谢的6-磷酸甘露糖形式的甘露糖转化为大多数植物能够代谢的6-磷酸果糖。这样表达pmi基因的植物能够以甘露糖为唯一碳源生长。在农杆菌介导的植物细胞转化中使用pmi标记基因时，用甘露糖进行正选择。与杀死未转化细胞的负选择不同，在正选择中未转化的细胞保持休眠，而经过转化的表达pmi基因的细胞可以利用甘露糖作为碳源正常生长。这样，在培养过程中不会发生未转化细胞的坏死。由此，再加上碳元素是细胞骨架的重要成分，使得pmi基因在转化中的效率较高。此外，甘露糖在自然界中常见，能够被豆科植物如大豆(Lee and Metheson，1984)所代谢，因此对植物组织没有不良作用。考虑到这些原因，人们已经在不同科的植物中尝试了使用pmi作为选择标记，例如禾本科的玉米(Negrotto et al.2000)、珍珠稷(O’Kennedy et al.2004)、翦股颖(Fu et al.2005)、高粱(Gurel et al.，2009)、小麦(Wright et al.2001)、和甘蔗(Jain et al.2005)；十字花科的拟南芥(Todd and Tague，2001)和卷心菜(Ku et al.2006)、蔷薇科的苹果(Degenhardt et al.2006)、番木瓜(Zhu et al.2005)和杏(Ramesh et al.2006)；大戟科的木薯(Zhang et al.2000)、茄科的西红柿(Sigareva et al.2004)；藜科的甜菜(Joersbo et al.1998)；百合科的洋葱(Aswath et al.2006)；
和葫芦科的黄瓜(He et al.2006)。由此可见pmi作为选择标记基因在粮食作物新品种的选育中有很大的发展潜力。2009年欧盟已经批准了使用PMI选择系统生产的转基因玉米的进口和加工作为食品和饲料的用途。在水稻转化研究中也已有人使用过pmi选择系统(Lucca et al.2001；He et al.2004；Ding et al.2006)，但其报道的转化效率都很低(仅
6％左右)，不适于工业规模的生产。因此，本领域对于以PMI作为选择标记的高效、简便的水稻转化方法存在需求。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种转化效率高、适用于工业规模应用的向水稻细胞导入外源基因的方法，适用于实施该方法的转化体系，利用该方法制备转基因水稻植株的方法，以及利用上述方法获得的转化水稻细胞、植株部分和植株。本发明提供了下列技术方案来实现该目的。

[0006] 在一个方面，本发明提供一种将外源基因导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

[0007] (1)将水稻谷粒去壳、灭菌后将胚分离出来；

[0008] (2)取步骤(1)所得的分离的胚置于愈伤组织诱导培养基上在30℃左右暗培养约2周，以产生次生愈伤组织；

[0009] (3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带外源基因和磷酸甘露糖异构酶(PMI)标记基因的农杆菌接触20分钟左右；

[0010] (4)将步骤(3)的愈伤组织转移到共培养基上，于约23℃培养约48小时；

[0011] (5)将步骤(4)的愈伤组织置于恢复培养基上培养5天左右；

[0012] (6)将步骤(5)的愈伤组织转移到含有蔗糖和甘露糖的选择培养基上，在约30℃暗培养3周左右以获得出芽的愈伤组织；

[0013] (7)将出芽的愈伤组织转移到再生培养基中继续培养；和任选地

[0014] (8)在再生培养基中培养约3周的愈伤组织转移至生根培养基中继续培养。

[0015] 在一个实施方案中，所述步骤(1)中的谷粒是成熟谷粒。

[0016] 在一个实施方案中，所述步骤(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的NB培养基。

[0017] 在一个实施方案中，所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将所述愈伤组织浸泡在所述农杆菌的悬液中。

[0018] 在一个实施方案中，所述步骤(4)中的共培养基是说明书表1所列出的固体共培养基或液体共培养基。

[0019] 在一个实施方案中，所述步骤(5)中的恢复培养基是说明书表1所列出的NBREC培养基。

[0020] 在一个实施方案中，所述步骤(6)中的选择培养基是说明书表1所列出的NBPMI培养基。

[0021] 在一个实施方案中，所述步骤(7)中的再生培养基不含有甘露糖。

[0022] 在一个实施方案中，其中所述步骤(7)中的再生培养基是选自包含如说明书表1所述成分的NBKN、NBKA、NBIZ或NBIK培养基中的任一种，优选NBKN或NBKA培养基。

[0023] 在一个实施方案中，所述任选步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的1/2MB培养基。

[0024] 在一个实施方案中，农杆菌的悬液是在侵染当天将农杆菌以OD660约0.05-0.25悬浮包含如说明书表1所示成分的液体滤纸培养基中而制备的。

[0025] 在上述各实施方案的进一步优选的实施方案中，所述选择培养基中含有约5-12.5g/L的蔗糖和约5-25g/L的甘露糖，优选含有约5g/L的蔗糖和约12.5g/L的甘露糖。
更优选地，其中所述选择培养基中不含抗生素或除草剂。

[0026] 在上述各实施方案的进一步优选的实施方案中，所述农杆菌是根瘤农杆菌EHA105菌株。

[0027] 在上述各实施方案的进一步优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻。优选地，水稻是日本晴(Nipponbare)品种；或者，优选地，所述水稻是皖粳97(Wanjing 97)品种。

[0028] 在一个优选的方面，本发明提供一种将外源基因导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

[0029] (1)将水稻谷粒去壳、灭菌后将胚分离出来；

[0030] (2)取步骤(1)所得的分离的胚置于愈伤组织诱导培养基上在约30℃暗培养约2周以产生次生愈伤组织；

[0031] (3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带外源基因和磷酸甘露糖异构酶(PMI)标记基因的农杆菌接触20分钟左右；

[0032] (4)将步骤(3)的愈伤组织转移到共培养基上，约23℃培养约48小时；

[0033] (5)将步骤(4)的愈伤组织置于恢复培养基上培养5天左右；

[0034] (6)将步骤(5)的愈伤组织转移到含有蔗糖和甘露糖的选择培养基上，在约30℃暗培养3周以获得出芽的愈伤组织；

[0035] (7)将出芽的愈伤组织转移到再生培养基中继续培养；和

[0036] (8)在再生培养基中培养约3周的愈伤组织转移至生根培养基中继续培养；

[0037] 其中所述步骤(1)中的谷粒是成熟谷粒，所述步骤(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的NB培养基，所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将所述愈伤组织浸泡在所述农杆菌的悬液中，所述步骤(4)中的共培养基是说明书表1所列出的固体共培养基或液体共培养基，所述步骤(5)中的恢复培养基是说明书表1所列出的NBREC培养基，所述步骤(6)中的选择培养基是说明书表1所列出的NBPMI培养基，其中含有约5g/L的蔗糖和约12.5g/L的甘露糖，并且不含抗生素或除草剂，所述步骤(7)中的再生培养基是选自包含如说明书表1所述成分的NBKN、NBKA、NBIZ或NBIK培养基中的任一种，所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的1/2MB培养基。

[0038] 在一个优选的实施方案中，其中所述农杆菌是根瘤农杆菌EHA105菌株。在一些优选的实施方案中，本发明所用的PMI标记基因的核苷酸序列选自：

[0039] (1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或

[0040] (2)编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

[0041] 在特别优选的实施方案中，本发明所用的PMI标记基因序列如SEQ ID NO：1所示。在本方面的优选实施方案中，所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是日本晴品种。或者更优选地，其中所述水稻是皖粳97品种。

[0042] 在另一个方面，本发明提供一种用于转化水稻的培养基套组，包括如下所述的组分：

[0043] (1)愈伤组织诱导培养基；

[0044] (2)固体共培养培养基或液体滤纸共培养培养基；

[0045] (3)恢复培养基；

[0046] (4)选择培养基；

[0047] (5)再生培养基；和任选地

[0048] (6)生根培养基；

[0049] 其中所述(1)-(3)，(5)，(6)分别包含如本说明书表1所示的成分，所述(3)包含选自说明书表1所示的NBKN、NBKA、NBIZ或NBIK培养基中的任一种的成分。

[0050] 本方面还涉及这样的培养基套组用于将外源基因导入水稻细胞的程序的用途。所述的水稻优选粳稻，包括但不限于日本晴、皖粳97等品种。

[0051] 在一个方面中，本发明提供根据本发明的方法的任一实施方案获得的携带外源基因的水稻细胞。

[0052] 在一个方面中，本发明提供一种生产转基因水稻的方法，包括使用前述的任一方法将外源基因导入水稻细胞，并从获得的水稻细胞培育出水稻植株。

[0053] 通过本发明，可以实现对水稻尤其是粳稻的高转化频率、高重复性的农杆菌介导转化；另一方面，通过本发明无需使用抗生素或除草剂选择，只需要进行一轮甘露糖选择就能够获得转化植株，与常规的使用抗生素或除草剂选择相比选择过程可以缩短近3周的时间，不但能够大大缩短选择过程的耗时，还降低了其环境压力，为开发工业规模的、环境友好的转基因水稻制备工艺提供了可能。

附图说明

[0054] 图1是本发明的示例性实施方案中农杆菌EHA105株的T-DNA区的示意图。35S：35S启动子。pat：草胺膦乙酰转移酶基因。Ubi：玉米泛素蛋白启动子。gfp：绿色荧光蛋白基因。Actl：水稻肌动蛋白1启动子。LB：左边界。RB：右边界。

[0055] 图2是在NB培养基上进行愈伤组织诱导的情况。A，在NB上培养7天后的皖粳97种子(比例线，1mm)；B，在NB上培养7日后的皖粳97胚(比例线，1mm)；C：来自在NB上培养15日后的日本晴成熟胚的次级愈伤组织(比例线，2mm)。它们都适于侵染前的预培养。

[0056] 图3是经侵染的日本晴愈伤组织在恢复培养后的GFP测定情况。A，光照下的愈伤组织；B，荧光下的同一愈伤组织(比例线，2mm)。

[0057] 图4是用8种不同比例的蔗糖-甘露糖组合作为碳源选择日本晴和皖粳97的选择率。每个处理包括70-100个愈伤组织，且重复3次。

[0058] 图5是再生培养基的优化结果。每个处理包括70-100个愈伤组织，且重复3次。

[0059] 图6是甘露糖抗性日本晴愈伤组织在不同的再生培养基上培养3周后的结果。A，NBIZ；B，NBKN；C，NBKA；D，NBIK。

[0060] 图7是再生的水稻幼苗的GFP测定情况。A，光照下的日本晴幼苗；B，荧光下的同一水稻幼苗。比例线，2cm。

[0061] 图8是推定的转基因事件的PCR扩增结果。M，DNA标记DL 2000；P：质粒；N：未转化植物；1-15：独立转基因事件。

[0062] 图9是PMI试纸条测定的结果。N：未转化植物；1-5：独立转基因事件。

[0063] 图10是甘露糖抗性实验结果。A：在不含抗生素的NB甘露糖选择培养基上培养两周后的转基因日本晴系T1种子；B：在不含抗生素的NB甘露糖选择培养基上培养两周后的非转基因日本晴系T1种子

[0064] 图11显示移栽到温室的转基因水稻植株。A，温室中正常授粉的转基因植株；B，携带GOI的转基因日本晴植株显示了预期的表型，红色线指示非转基因植株黄色线指示独立的转基因事件。

具体实施方式

[0065] 下面结合具体的实施方式来进一步说明本发明。应当理解这里描述的具体实施方式只是作为示例来帮助本领域技术人员更好地理解本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。

[0066] 在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的实验方法和操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.，Vols 1，2；Charles Neal Stewart，Alisher Touraev，Vitaly Citovsky and Tzvi Tzfira，Plant Transformation Technologies等。

[0067] 本文中所述的“约”或“左右”，除非另有特别说明或与上下文明显冲突，表示其所指的参数可以取在所述的具体数值的基础上在一定范围内，例如在所述具体数值的基础上±5％的值，只要能保证能够获得预期的结果即可。本领域技术人员在实施本发明的方法时，结合本说明书的教导，很容易在这里给出的具体实施方式中所用的具体参数数值的基础上，对参数数值加以适当调整以适应具体的实验条件和材料，而不偏离本发明的范围。

[0068] 1.材料和方法

[0069] 1.1.植物材料、外植体制备和生长条件

[0070] 选取水稻品种日本晴(Nipponbare)和皖粳97(Wanjing97)(来自中国安徽省)的饱满、外观正常的谷粒(种子)，去壳、灭菌后，在30℃的双蒸水中黑暗浸泡过夜。用刮刀沿糊粉层分离盾片，朝上放置在NB培养基(成分如下所述)上30℃暗培养以诱导愈伤组织。两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以用作经预培养的外植体来进行下面的侵染。生长条件为：愈伤组织诱导、预培养、恢复和选择均在30℃左右的黑暗中进行；共培养在约23℃的黑暗中进行；再生和生根在约30℃光照下进行，光强度为约6000lx，光周期为约16h日/8h夜。

[0071] 1.2.试剂和培养基

[0072] 除非另有说明，本文所述具体实施方式中使用的化学品购自Sigma(美国Saint Louis)。使用的各种培养基的组成如表1所示。除非另有说明，培养基的pH值为5.8。

[0073] 表1

[0074] 本研究中使用的培养基的示例性配方

[0075]

[0076]

[0077] 1.3.质粒构建体、农杆菌菌株和侵染体的制备

[0078] 本具体实施方式使用本领域广泛使用的农杆菌菌株EHA105(Hood EE，Gelvin SB，Melchers LS，Hoekema A.New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants.Transgenic Research.1993；2：208-218)，通过本领域常用的农杆菌转化方法导入了除草剂抗性基因pat(基因序列如SEQ ID NO：3所示)、绿色荧光蛋白编码基因gfp(基因序列如SEQ ID NO：5所示)和大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶pmi(基因序列如SEQ ID NO：1所示)，分别由35S启动子(序列如SEQ ID NO：7所示)、玉米泛素蛋白启动子Ubi(序列如SEQ IDNO：8所示)、和水稻肌动蛋白启动子Act1驱动(序列如SEQ ID NO：9所示)(见图1)。应当理解的是，本具体实施方案虽然是以绿色荧光蛋白基因作为外源基因的示例，但本发明不限于特定的外源基因。这里所说的“外源”表示相关基因是从对象细胞的外部导入的，而不限制基因的任何具体的来源。任何适于在水稻细胞中表达的、对要导入基因的水稻细胞而言为固有或非固有的基因都可以作为外源基因，适当地与农杆菌T-DNA连接后根据本发明的方法导入水稻细胞。同样，本发明也不限于使用农杆菌EHA105菌株，任何能够将基因导入受体细胞的农杆菌菌株都可用于本发明。关于用农杆菌导入基因、构建所用质粒等一般性知识为本领域技术人员所熟知，例如可见Hiei et al.，1994；Riva et al，1998.(Agrobacterium tumefaciens：a natural tool for plant transformation，Electronic Journal of Biotechnology 19981(3)118-133.)

[0079] 侵染前2-4天，当愈伤组织在预培养培养基上培养时，取农杆菌EHAl05的甘油冻存液在YEP平板上划线后在约28℃暗培养来活化菌种。在侵染前一天，将经过活化的农杆菌在新鲜的YEP平板上再次划线来扩繁菌种。在侵染当天，用一次性小药匙收集YEP平板上的农杆菌并悬浮在液体滤纸共培养培养基中(其配方如表1所示)，制成密度为7 8
2.5×10-1.25×10cfu(OD660为约0.05-0.25)的侵染液。

[0080] 1.4.侵染和恢复

[0081] 制备好侵染液20分钟后，从预培养培养基上刮下经过预培养的愈伤组织，并转移到盛有侵染液的50ml灭菌离心管中，使侵染液浸没愈伤组织。充分混合后静置15分钟。然后，将愈伤组织在新滤纸上沥干，然后分别用滤纸转移到固体共培养培养基(33ml培养基)上或转移到液体共培养培养基上(用3.2ml培养基润湿3层经灭菌的Whatman 3MM滤纸)。将平板用3MMicropore Surgical Tape密封，23℃培养40-48小时。在共培养过程中观察GFP信号来检测转化效率。共培养后，将愈伤组织从共培养培养基上刮下，并置于恢复培养基(NBREC)上3-5天，或直接置于选择培养基PAT或PMI上，以进行比较实验来考察恢复培养对基于PAT和PMI选择培养基的T-DNA整合的影响。

[0082] 1.5.选择和再生

[0083] 将经过恢复培养的愈伤组织置于NBPAT选择培养基(3mg/L双丙胺磷)或含有不同含量组合的蔗糖与甘露糖的NBPMI培养基(5g/L蔗糖分别与7.5、12.5、17.5和22.5g/L甘露糖组合，或10g/L蔗糖分别与7.5、12.5、17.5和22.5g/L甘露糖组合)。每个平板上放30粒愈伤组织。对选择培养基上的愈伤组织计数作为外植体数，并把从每一个愈伤组织发生的抗性愈伤组织视为一个事件。3周后，肉眼观察到用双丙胺磷和甘露糖选择的一些抗性愈伤组织，将它们标记用于GFP测定，以比较选择效率。然后使用甘露糖抗性的愈伤组织，用4种不同的再生培养基：NBIK、NBKN、NBKA和NBIZ(配方见表1)进行再生实验。每个平板包含5个事件，将来自一个事件的2-3个浅黄色球状抗性愈伤组织结节分配到平板上的一个特定区域。3周后计算出芽的愈伤组织的数目并观察芽的质量，以进行测试的4种再生培养基的比较实验。将来自每个事件的一个芽转移到生根培养基中培养。一周后当高度增加且生长旺盛时移栽到温室中。

[0084] 1.6T1种子的分子分析和甘露糖抗性的鉴定

[0085] 在移栽到温室中之前，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析和Taqman测定。用于扩增pmi基因的PCR引物为5’-CCGCCGGAGATATCGTTTCACTG-3’及5’-CACGGTTCACCCTGCTGGCTATC-3’，产生长度为490bp的片段。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行30个循环：94℃45秒、56℃45秒、
72℃45秒，最后在72℃延伸10分钟。进行Taqman测定作为相对定量分析，以参照标准曲线确定转基因植株的拷贝数。Taqman分析中对于每一个测试样品，使用两对引物来检测右T边界附近的pmi基因和左T边界附近的35S启动子。

[0086] PMI种子试纸条测试根据制造商(Strategic Diagnostic Inc.)的说明来进行。每个植株取0.2g嫩叶浸没在试纸条反应缓冲液中10min以产生目标线。

[0087] 对于甘露糖抗性鉴定实验，使用T1转基因种子如上文所述通过萌发和在不含羧苄西林的NB和NBPMI培养基上进行愈伤组织诱导来测试它们的愈伤组织形成能力。同时用野生型种子作为阴性对照。观察并记录萌发和愈伤组织形成能力。

[0088] 1.7利用该系统进行大规模转基因水稻植株生产

[0089] 使用本项研究中确立的转化方案已经转化了超过400个构建体并且对所有的事件进行了Taqman测定。这里分析了113个构建体(日本晴91个，皖粳9722个)的Taqman测定数据。

[0090] 2.结果和分析

[0091] 2.1.高质量愈伤组织的产生

[0092] 使用成熟种子诱导愈伤组织时，日本晴和皖粳97的愈伤组织形成能力不同。在含有2.0mg/L 2，4-D的NB培养基上，日本晴种子正常萌发和产生愈伤组织，而皖粳97种子仅仅萌发和生长(图2-A)。在4.0或6.0mg/L 2，4-D的条件下成熟皖粳97种子成功地产生了愈伤组织，但更高浓度的生长素可能阻碍后续的再生。除去种子的胚乳后，皖粳97的成熟胚也可以在2.0mg/L 2，4-D条件下产生愈伤组织(图2.B)。

[0093] 因此发明人使用分离的胚(盾片)来作为诱导愈伤组织的外植体。培养后一周内从盾片产生了初级愈伤组织，培养14-18天后回收了直径2-4mm的次级愈伤组织，即可用于预培养(图2-C)。皖粳97和日本晴的愈伤组织诱导效率都达到了90％。

[0094] 2.2恢复培养是甘露糖选择所必需的

[0095] 利用GFP表达来确定恢复培养是否为甘露糖选择或双丙氨磷选择所必需。结果显示在双丙氨磷选择中有无恢复培养时的GFP表达几乎无区别，但对于甘露糖选择，只有在选择之前将愈伤组织转移到一段恢复期的情况下才能观察到愈伤组织中的GFP表达(图3)。这提示恢复培养对于甘露糖选择系统是不可缺少的。

[0096] 2.3液体滤纸共培养显著改善了抗性愈伤组织的恢复效率

[0097] 在固体共培养培养基上培养的愈伤组织在培养后48小时呈现褐变和坏死。对于皖粳97和日本晴，在使用液体滤纸共培养培养基时，在含有5g/L蔗糖和10g/L甘露糖的选择培养基上培养3周后的抗性愈伤组织回收率分别从使用固体共培养培养基时的39.92％和41.92％提高到66.94％和64.59％。

[0098] 表2使用不同共培养方法的抗性愈伤组织回收效率

[0099]

[0100] 2.4不同蔗糖-甘露糖组合对于选择率的影响，以及PMI和PAT的选择效率比较[0101] 转移到选择培养基上10天后，新的球状甘露糖抗性愈伤组织开始出现，并且大部分的抗性愈伤组织在选择3周后达到了5mm直径，适合用于再生。

[0102] 对于日本晴和皖粳97，蔗糖-甘露糖组合对于抗性愈伤组织的回收效率的影响是不同的(图5)。对于测试的所有8种不同的蔗糖-甘露糖浓度梯度，根据邓肯氏新复极差检验(MRT)将日本晴中愈伤组织的选择效率分为四组。结果显示在日本晴中在5g/L或10g/L蔗糖存在下12.5g/L甘露糖的条件下抗性愈伤组织的选择效率较高(P＜0.05)。有趣的是，将甘露糖升高到22.5g/L，蔗糖升高到10g/L时，选择效率达到68％，与5g/L或10g/L蔗糖加12.5g/L甘露糖的差别不显著。这可能是由于过高渗透压可严重影响未转化细胞的生理状态，而对于能够代谢甘露糖的转化细胞的影响较小。从选择效率和节约成本两方面考虑，选择了5g/L蔗糖和10g/L甘露糖的组合用于日本晴的选择。

[0103] 和日本晴不同，基于MRT结果皖粳97的选择效率仅包含两个组。在5g/L或10g/L蔗糖存在下，当向培养基中添加7.5g/L甘露糖时选择效率达到最优，而在其他所有处理中的选择效率明显较低(P＜0.05)。因此，选择5g/L蔗糖和7.5g/L甘露糖用于皖粳97的选择。

[0104] 为了用可视的标记基因gfp验证PMI选择的有效性，利用双丙氨磷和甘露糖作为选择剂进行了比较实验。选择3周时，基于可视GFP表达观察通过肉眼观察选出的抗性愈伤组织(表3)。将抗性愈伤组织分成3个类型：1)在荧光显微镜下表达GFP的愈伤组织；2)部分表达GFP的愈伤组织；和3)不表达GFP的愈伤组织。如表3所示，基于肉眼观察的抗性愈伤组织回收效率在PMI和PAT选择之间没有统计学意义上的差异，但使用PMI或PAT选择时表达GFP的愈伤组织的比例有显著的差异。

[0105] 选择后3周时，超过60％的双丙氨磷抗性愈伤组织未显示GFP表达或部分显示GFP表达，后者很可能是PAT选择中的假阳性。相反，多达80％的甘露糖抗性愈伤组织表达了GFP，只有不到5％为GFP阴性。这确证了PMI选择的有效性。

[0106] 表3PAT与PMI的选择效率的比较

[0107]

[0108] 2.5.再生培养基的优化

[0109] 选择后3周时，将来源于一个愈伤组织，生长状态良好的2个或3个愈伤组织颗粒(大小为2-4mm)作为一个独立事件转移到培养皿中的再生培养基上标定的分区中。每个培养皿包含5个事件。将再生培养基上的愈伤组织暗培养一周后转移到光亮下以进行芽再生和伸长。在黑暗中愈伤组织呈现膨胀并变成乳白色，2周后绿色的芽开始冒出，即可转移到生根培养基。大部分愈伤组织在1周内产生了幼苗。对于日本晴而言四种再生培养基的再生效率没有显著差异((P＞0.05)(图6)。对于皖粳97，再生培养基NBKN和NBIK的再生效率均高于NBIZ和NBKA(P＜0.05)。除了再生效率之外，芽的质量也是再生培养基性能的考虑因素。两个品种的用NBKN和NBKA再生的芽均健壮且有生长的根，而用NBIZ和NBIK再生的芽瘦小且没有根(图7)。此外，NBKN和NBKA的移栽成功率几乎为100％。因此NBKA和NBKN可以用作日本晴和皖粳97二者的再生培养基。

[0110] 2.6.转基因植株的分析

[0111] 对于具有发达根系的幼苗进行荧光镜检以实施GFp测定(图8)。在所观察的941株中，43株为GFP阴性，阳性率达到95.4％。PCR扩增检出了PMI目标片段(图9)。通过PMI试纸条测试在T1苗中检出了PMI蛋白表达(表4，图10)。在甘露糖抗性实验中，在不含抗生素的PMI选择培养基上未转化的种子没有萌发或产生愈伤组织，而转基因T1种子正常地萌发并产生愈伤组织。

[0112] 表4本研究中开发的PMI选择系统的转化频率

[0113]

[0114] 2.7.本系统在转基因植物生产中的应用

[0115] 本发明人建立了一套转化方案，并在优化了上述参数后将其应用到大规模生产。实施的转化过程如下：(1)将饱满、健康的去壳种子(每个构建体36粒)灭菌后在双蒸水中浸泡过夜；(2)分离盾片并将它们置于NB愈伤组织诱导培养基上(16-18天)；(3)预培养愈伤组织并将携带感兴趣的基因(GOI)的农杆菌在YEP平板上划线(2-4天)；(4)制备侵染液并实施侵染(15分钟)；(5)将愈伤组织在滤纸上沥干后，转移到共培养培养基上(2天)；(6)将愈伤组织刮取到恢复培养基上(3-5天)；(7)将愈伤组织转移到选择培养基上并统计这里的愈伤组织数目作为外植体数目(30个愈伤组织/平板，21-24天)；(8)将来自每个事件的2-3个抗性愈伤组织转移到再生培养基上(每个平板5个事件，21-24天)；
(9)从每个事件分离一个芽到生根培养基中(10天)；(10)取样进行分子分析并转移到温室中。

[0116] 根据共产生10546个事件的113个构建体(日本晴91个，皖粳9722个)的统计结果，转基因事件的低拷贝率在日本晴中为31.5％，在皖粳97中为45.2％，尽管在两个探针PMI和35S启动子之间有一些差异(表5)。在所分析的测试载体和GOI之间拷贝数的分布没有不同。利用该方案，转化从侵染到移栽可以在57-60天内完成。

[0117] 表5转基因植物的Taqman分析结果

[0118]

[0119] 表型观察结果提示，大多数转基因植物没有显示异常表型(图11-A)并可以正常结实，除了某些受GOI影响者外(图11-B)。

[0120] 3讨论和结论

[0121] 3.1.植物外植体与农杆菌之间的相互作用

[0122] 基因转移涉及植物外植体与农杆菌之间的相互作用。因此用于转化的植物外植体应当处于最优的状态，而农杆菌应当处于适于投递T-DNA，而不是适于其自身增殖的状态。一般而言用作外植体的愈伤组织处于胚阶段，能够经受通过3-5天预培养与农杆菌感染的相互作用。在本研究中，发明人使用衍生自初级愈伤组织的直径2-4mm的愈伤组织作为转化用外植体，并在23℃左右，而非更适于农杆菌增殖的25-28℃实施共培养。发明人将常规的在固体培养基上平板上共培养的方法与在3层润湿滤纸上培养的方法进行了比较，发现用3.2ml液体共培养培养基润湿的滤纸显著地降低了组织坏死，并且改善了转化频率。这不同于Ozawa得到的结果，后者建议使用5.5ml的体积(Ozawa 2009)。可能是由于使用的材料和培养皿不同所致。

[0123] 3.2.PMI的选择效率

[0124] PMI优于NPTII及HPT等抗生素选择标记。它作用的方式是赋予转化的植物细胞以代谢甘露糖的能力，同时利用碳饥饿使其他细胞保持休眠。发明人采用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因监测体内转化效率，并在不影响后续的实验的条件下，优化了用于选择两个受试品种的甘露糖浓度及其与蔗糖的联合作用。与先前报道的结果，即在水稻转化中使用超过25g/L甘露糖进行两轮以上的选择(Lucca et al.2001；Ding et al.2006；He et al.2004)不同，发明人发现，相对较低的蔗糖-甘露糖组合(皖粳97为5-7.5g/L，日本晴为5-12.5g/L)提供了最高的选择频率。该选择频率与甘露糖浓度，而不是所测试的5g/L或10g/L蔗糖相关，提示甘露糖浓度对选择频率的影响更大。基于在一轮选择后产生的纯的甘露糖抗性愈伤组织，发明人从再生培养基中去除了甘露糖，发现超过95％的植株是阳性的，提示在PMI选择系统中再生培养基和生根培养基中添加甘露糖不是必要的。在本项研究中开发的转化系统中，只使用了7.5g/L(皖粳07)和12.5g/L(日本晴)甘露糖，且一轮选择即可产生纯的抗性愈伤组织。加之选择过程中蔗糖用量从30g/L降低到5g/L，本发明的方案比使用潮霉素或者双丙氨磷等的其他方案更节约成本。

[0125] 3.3转化频率

[0126] 利用本项研究中建立的方案，转化频率在日本晴中高达47.5％，在皖粳97中高达54.7％，且在转基因水稻的大规模生产中转化可以在从侵染到移栽57-60日内完成。此外，本发明通过农杆菌介导的转化提供了高频率的低拷贝转基因水稻植株，根据统计学意义的大数据量的Taqman分析结果，日本晴中为31.5％，皖粳97中为45.2％。

[0127] 本发明提供了利用pmi作为选择基因，利用农杆菌介导，用于将外源基因导入水稻，尤其是粳稻细胞的简化方法。该方法使得大规模、高效率、低成本、快速地生产转基因水稻植株成为可能。

[0128] 参考文献

[0129] Aswath CR，Mo SY，Kim DH，Park SW(2006)Agrobacterium and biolistic transformation of onion using non-antibiotic selection marker phosphomannose isomerase.Plant Cell Rep 25：92-99

[0130] Chan MT，Chang HH，Ho SL，Tong WF，Yu SM(1993)Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric alpha-amylase promoter/beta-glucuronidase gene.Plant Mol Biol 22：491-506

[0131] Chen L，Zhang S，Beachy RN，Fauquet CM(1998)A protocol for consistent，large-scale production of fertile transgenic rice plants.Plant Cell Rep 18：25-31

[0132] Christou P，Ford T，Kofron M(1991)Production of transgenic Rice(Oryza Sativa L.)plants from agronomically important indica and j aponica varieties via electric discharge particle acceleration of exogernous DNA into immature zygotic embryos.Bio/Technology 9：957-962

[0133] Cotsaftis O，Sallaud C，Breitler J C，Meynard D，Greco R，Pereira A，Guiderdoni E(2002)Transposon-mediated generation of T-DNA-and marker-free rice plants expressing a Bt endotoxin gene.Mol Breed 10(3)：165-180

[0134] Degenhardt J，Poppe A，Montag J，Szankowski I(2006)The use of the phosphomannose-isomerase/mannose selection system to recover transgenic apple plants.Plant Cell Rep 25：1149-1156

[0135] Ding ZS，Zhao M，Jing YX(2006)Efficient Agrobacterium-mediated transformation of rice by phosphomannose isomerase/mannose selection.Plant Plant Mol Biol Rep 24：295-303.

[0136] Dong JJ，Teng WM，Wallace G，Timothy C(1996)Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice.Mol Breed 2：261-276

[0137] Fu DL，Xiao YM，Muthukrishnan S，Liang GH(2005)In vivo performance of a dual genetic marker，manA-gfp，in transgenic bentgrass.Genome 48：722-730[0138] Gil A.Enríquez-Obregón，Dmitri L.Prieto-Samsónov，Gustavo A.de la Riva，Marlene Pérez，Guillermo Selman-Housein and Roberto I.Vazquez-Padrón (1999)Agrobacterium-mediated japonica rice transformation：a procedure assisted by antinecrotic treatment.Plant Cell，Tissue and Organ Cult 59：159-168.[0139] Gurel S，Gurel E，Kaur R，Wong J，Meng L，Tan H-Q，Lemaux PG(2009)Efficient，reproducible Agrobacterium-mediated transformation of sorghum using heat treatment of immature embryos.Plant Cell Rep 28：429-444

[0140] Haldrup A，Petersen S G，Okkels FT(1998)Positive selection：a plant selection principle based on xylose isomerase，an enzyme used in thefood industry.Plant Cell Rep 18：76-81

[0141] Haldrup A，Pe te rs e n SG，Okkels FT(1998)The xylose isomerase gene from Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes allows effective selection of transgenic plant cells using D-xylose as the selection agent.Plant Mol Biol 37：287-296.

[0142] He Z，Duan Z，Liang W，Chen F，Yao W，Liang H，Yue C，Sun Z，Chen F，Dai J(2006)Mannose selection system used for cucumber transformation.Plant Cell Rep 25：953-958

[0143] He ZQ，Fu YP，Si HM(2004)PhoSphomannose-isomerase(pmi)gene as a selectable marker for rice transformation via Agrobacterium.Plant Sci 161(1)：17-22

[0144] Hiei Y and Komari T(2006)Improved protocols for transformation of indica rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.Plant Cell Tissue Organ Cult85：271-283

[0145] Hiei Y，Ohta S，Komari T，Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J 6：271-282

[0146] Hood EE，Gelvin SB，Melchers LS，Hoekema A.(1993)New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants.Transgenic Research.2：208-218

[0147] Jain M，Chengalrayan K，Abouzid A，Gallo M(2007)Prospecting the utility of a PMI/mannose selection system for the recovery of transgenic sugarcane (Saccharum spp.hybrid)plants.Plant Cell Rep 28：581-590

[0148] Joersbo M，Donaldson I，Kreiberg J，Petersen SG，Brunstedt J(1998)Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet.Mol Breed 4：111-117[0149] Joersbo M，Okkels FT(1996)A novel principlefor s election of transgenic plant cells：positive selection.Plant Cell Rep 16：219-221.

[0150] Ku JJ，Park YH and Park YD(2006)A non-antibiotic selection system uses the phosphomannose-isomerase(PMI)gene for Agrobacterium-mediated transformation of Chinese cabbage.Journal of Plant Biology 49(2)：115-122[0151] Lafayette PR，Parrott WA(2001)A non-antibiotic marker for amplification of plant transformation vectors in E.coli.Plant Cell Rep 20：338-342.[0152] Lee BT，Matheson NK(1984)Phosphomannose isomerase andphosphoglucoisomerase in seeds of Cassia coluteoides and some other legumes that synthesize galactomannan.Phytochemistry 23：983-987

[0153] Lin YJ，Zhang Q(2005)Optimizing the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice.Plant Cell Rep 23：540-547

[0154] Lucca P，Ye X，and Potrykus I(2001)Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent.Mol Breed 7：43-49.[0155] Luo K，Duan H，Zhao DG，Zheng XL，Deng W，Chen YQ 1，Stewart Jr CN，McAvoy R，Jiang XN，Wu YH，He AG，Pei Y，Li Y(2007)′GM-gene-deletor′：Fused loxP-FRT recognition sequences dramatically improve the efficiency of FLP or CRE recombinase on transgene excision from pollen and seeds of tobacco plants.Plant Biotech.J 5(2)，263-274

[0156] Luo ZX，Wu R(1988)A simple method for the transformation of rice via the pollen-tube pathway.Plant Mol Biol Rep 6：165-174

[0157] Matthews PR，Wang MB，Waterhouse PM，et al(2001)Marker gene elimination from transgenic barley，using co-transformation with adjacent“twin T-DNAs”on a standard Agrobacterium transformation vector.Mol Breed 7：195-202.

[0158] Miles JS，Guest JR(1984)Nucleotide sequence and transcriptional start point of the phosphomannose isomerase gene(manA)of Escherichia coli.Gene 32：41-48.

[0159] Negrotto D，Jolley M，Beer S，Wenck AR，Hansen G(2000)The use of phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants(Zea mays L.)via Agrobacterium transformation.Plant Cell Rep 19：798-803[0160] O’Kennedy MM，Burger JT，Botha FC(2004)Pearl millet transformation system using the positive selectable marker gene phosphomannose isomerase.Plant Cell Rep 22：684-690

[0161] Ozawa K(2009)Highly efficient Agrobacterium-mediated transformation of suspension-cultured cell clusters of rice(Oryza sativa L.).Plant Sci 176：522-527

[0162] Park J，Lee YK，Kang BK，Chung WI(2004)Co-transformation using a negative selectable marker gene for the production of selectable marker gene-free transgenic plants.Theor.Appl.Genet 109：1562-1567

[0163] Rachmawati D and Anzai H(2006)Studies on callus induction，plant regeneration and transformation of Javanica rice cultivars.Plant Biotechnology23：521-524

[0164] Ramesh SA，Kaiser BN，Franks T，Collins G，Sedgley M(2006)Improved methods in Agrobacterium-mediated transformation of almond using positive (mannose/pmi)or negative(kanamycin resistance)selection-based protocols.Plant Cell Rep25：821-828

[0165] Riva G，Cabrera，JG，Padron RV，Pardo，CA，(1998)Agrobacterium tumefaciens：a natural tool for plant transformation，Electronic Journal of Biotechnology
1(3)：118-133

[0166] Sigareva M，Spivey R，Willits MG，Kramer CM，Chang YF(2004)An efficient mannose selection protocol for tomato that has no adverse effect on the ploidy level of transgenic plants.Plant Cell Rep 23：236-245

[0167] Srivastava V，Ow DW(2004)Marker-free site-specific gene integration in plants.Trends Biotechrnol22(12)，627-629

[0168] Todd R，Tague BW(2001)Phosphomannose isomerase：a versatile selection marker for Arabidopsis thaliana germ-line transformation.Plant Mol Biol Rep 19：307-319

[0169] Toki S，Hara N，Ono K，Onodera H，Tagiri A，Oka S，Tanaka H(2006)Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice.Plant J 47：969-976

[0170] Toriyama K，Arimotoa Y，Uchimiyaa H，Hinata K(1988)Transgenic rice plants after direct gene transfer into protoplasts.Bio/Technology 6：1072-1074[0171] United Nations(2007)World population prospects：the 2006revision.New York，NY：United Nations Population Division.

[0172] Wright M，Dawson J，Dunder E，Suttie J，Reed J，Kramer C，Chang Y，Novitzky R，Wang H，Artim-Moore L(2001)Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.)and wheat(Triticum aestivum L.)using the phosphomannose isomerase gene，pmi，as the selectable marker.Plant Cell Rep 20：429-436

[0173] Yang JB，Wu LJ，Wu JD，Wu YJ，Yu ZL，Xu ZH(1994)Production of transgenic rice plants via the low energy ion beam.Chinese Science Bulletin 39(16)：1530-1534

[0174] Zhang HM，Yang H，Rech EL，Gods T.J.，Davis AS，Mullingan BJ，Cocking EC，Davey MR(1988)Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts.Plant Cell Rep 7：379-384

[0175] Zhang P，Potrykus I，Puonti-Kaerlas J(2000)Efficient production of transgenic cassava using negative and positive selection.Transgenic Res 9：405-415

[0176] Zhang W，Wu R(1988)Efficient regeneration of transgenic plants from rice protoplasts and correctly regulated expression of the foreign gene in the plants.Theor Appl Genet76：835-840

[0177] Zhu YJ，Agbayani R，McCafferty H，Albert HH，Moore PH(2005)Effective selection of transgenic papaya plants with the PMI/Man selection system.Plant Cell Rep 24：426-432