对磷酸氢二铵耐受的枯草芽孢杆菌的筛选方法

摘要

本发明属于微生物领域，涉及一种对磷酸氢二铵耐受的枯草芽孢杆菌的筛选方法，包括如下过程：(1)筛选：将CGMCC保藏的编号为1.0769的枯草芽孢杆菌，以营养琼脂为培养基，先进行试管斜面培养，然后再进行培养皿斜面划线培养后筛选出典型的枯草芽孢杆菌的单菌落；将典型的枯草芽孢杆菌转入营养琼脂试管斜面，进行培养；(2)驯化：在营养琼脂培养基里增加磷酸氢二铵，制成磷酸氢二铵浓度不同的培养皿，逐步提高磷酸氢二铵浓度进行筛选驯化培养，筛选出能够耐受较高浓度磷酸氢二铵的枯草芽孢杆菌。得到能够耐受质量浓度为20％磷酸氢二铵的枯草芽孢杆菌，这种枯草芽孢杆菌可用于肥料。

权利要求

1.一种对磷酸氢二铵耐受的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的筛选方法，其特征在于包括如下过程：(1)筛选：将枯草芽孢杆菌CGMCC 1.0769，以营养琼脂为培养基，所述营养琼脂组成为：每1000ml水用蛋白胨10克、牛肉粉3.0克和氯化钠5.0克，pH值为7.3±0.1；先进行试管斜面培养，然后再进行培养皿斜面划线培养后筛选出典型的枯草芽孢杆菌的单菌落；

将典型的枯草芽孢杆菌转入营养琼脂试管斜面，进行培养；

(2)驯化：在营养琼脂培养基里增加磷酸氢二铵，制成磷酸氢二铵质量浓度分别为

10％、15％、20％和25％不同的培养皿，把步骤(1)中最后培养得到的枯草芽孢杆菌先在磷酸氨二铵浓度较低的培养皿中划线培养；将培养的单菌落转移到试管斜面培养后作为菌种，再在下一个磷酸氢二铵浓度较高的培养皿中划线培养，以此类推，逐步提高磷酸氢二铵浓度，筛选出能够耐受较高浓度磷酸氢二铵的枯草芽孢杆菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：各步骤中所述培养条件为在恒温培养箱中

34℃±0.5℃培养3-5天。

说明书

对磷酸氢二铵耐受的枯草芽孢杆菌的筛选方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物领域，涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的筛选驯化方法以及得到的枯草芽孢杆菌，是应用于肥料中提高枯草芽孢杆菌对磷酸氢二铵的耐受性。

背景技术

[0002] 枯草芽孢杆菌，拉丁学名Bacillus subtilis，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～
0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

[0003] 枯草芽孢杆菌具有解磷作用，能够提高磷的植物利用度，因此被应用于肥料中。例如CN101899405A公开的“枯草芽孢杆菌GU及其在制备高效生物复合磷肥中的应用”，CN101643710A公开的“一株枯草芽孢杆菌及其应用”，CN101200385A公开的“用侧孢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌制备复合微生物肥料”，上述文献均涉及了枯草芽孢杆菌在肥料中的应用。然而，由于枯草芽孢杆菌对盐的耐受性较差，高浓度的盐能够抑制菌株。例如杨清香、曹卫军在《武汉大学学报(自然科学)》1998年02期“高渗环境对枯草芽孢杆菌和粘质沙雷氏菌胞内自由氨基酸库含量和组成的影响”一文中，公开有枯草芽孢杆菌(93151和93215)可耐受8％NaCl。因此，目前枯草芽孢杆菌均是用于生物有机肥，或低含盐里的复合肥。这限制了枯草芽孢杆菌在肥料中的应用。

[0004] 磷酸氢二铵，是一种能够为植物提供氮和磷的常用化肥。因此，提供一种耐磷酸氨二铵的枯草芽孢杆菌，使其能够与磷酸氢二铵合用，以利用枯草芽孢杆菌促进磷酸氢二铵肥效的发挥，成为肥料行业需要解决的技术问题。

发明内容

[0005] 本发明的目的就在于提供一种对磷酸氢二铵耐受的枯草芽孢杆菌的筛选方法。

[0006] 本发明采用如下技术方案：一种对磷酸氢二铵耐受的枯草芽孢杆菌的筛选方法，包括如下过程：

[0007] (1)筛选：将枯草芽孢杆菌CGMCC 1.0769，以营养琼脂为培养基，先进行试管斜面培养，然后再进行培养皿斜面划线培养后筛选出典型的枯草芽孢杆菌的单菌落；将典型的枯草芽孢杆菌转入营养琼脂试管斜面，进行培养；

[0008] (2)驯化：在营养琼脂培养基里增加磷酸氢二铵，制成磷酸氢二铵浓度不同的培养皿，把步骤(1)中最后培养得到的枯草芽孢杆菌先在磷酸氨二铵浓度较低的培养皿中划线培养；将培养的单菌落转移到试管斜面培养后作为菌种，再在下一个磷酸氢二铵浓度较高的培养皿中划线培养，以此类推，逐步提高磷酸氢二铵浓度，筛选出能够耐受较高浓度磷酸氢二铵的枯草芽孢杆菌。

[0009] 所述步骤(2)中磷酸氢二铵质量浓度可以分别为10％、15％、20％和25％。

[0010] 所述营养琼脂组成为：每1000ml水用蛋白胨10克、牛肉粉3.0克和氯化钠5.0克，pH值为7.3±0.1。

[0011] 各步骤中所述培养条件为恒温培养箱中34℃±0.5℃培养3-5天。

[0012] 本发明的方法得到的枯草芽孢杆菌，通过筛选、驯化，在质量浓度为20％的磷酸氢二铵营养琼脂中生长良好，表明能够耐受质量浓度为20％的磷酸氢二铵。

具体实施方式

[0013] 下面通过具体实施例对本发明作进一步详细描述，以助于理解本发明的内容。

[0014] 枯草芽孢杆菌subsp.subutilis来源，中科院微生物所的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)购买，编号为1.0769。

[0015] 所用分离基础培养基：营养琼脂培养基

[0016] 蛋白胨：10克

[0017] 牛肉粉：3.0克

[0018] 氯化钠：5.0克

[0019] 水：1000ml

[0020] pH值：7.3±0.1

[0021] 筛选驯化方法：

[0022] (1)准备：按照营养琼脂培养基标准配制好培养基，连同包好的培养皿、试管培养基、无菌水、玻璃刮刀、移液管等辅助器具，经过高温灭菌后待用。灭好菌的营养琼脂培养基倒平板，试管培养基摆斜面，冷却，备用。

[0023] (2)复壮：超净工作台开紫外灯灭菌30分钟，实验室甲醛熏蒸，准备工作做好后，吸0.2毫升的无菌水加入冻干管中，将枯草芽孢杆菌菌种干粉做成菌悬液，在火焰封口的状态下倒入制备好的试管斜面上，将菌悬液平铺在斜面培养基上，放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3-5天。镜检观察形态，芽孢率。

[0024] (3)筛选：在菌种操作间，将超净工作台开紫外灯灭菌30分钟，进行无菌操作，用接种针在培养好的试管斜面菌种挑起菌落，在准备好的培养皿中划线，将划好线的培养皿放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3-5天，观察是否有典型的枯草芽孢杆菌的单菌落形成。将典型的枯草芽孢杆菌的单菌落，转入准备好的营养琼脂试管斜面上，放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3-5天，待用。

[0025] (4)驯化：在营养琼脂培养基里相应增加磷酸氢二铵的浓度，按照质量分数10％、15％、20％、25％各个浓度，制备成培养皿；在培养好的营养琼脂试管斜面上，挑菌种先在
10％磷酸氢二铵营养琼脂培养皿内划线培养，然后以前一批次的单菌落存试管斜面，培养结束后，作为菌种在下一个浓度的培养皿中划线培养，依次类推。根据实验结果表明磷酸氢二铵的浓度(质量分数)在20％时，本菌株能生长良好，作为驯化后的菌种。

[0026] (5)、检测：选取营养琼脂培养基加入质量分数为20％浓度的磷酸氢二铵，高压灭菌后，用灭菌后的培养皿倒平板。划线或者稀释平板涂布，34℃±0.5℃培养，3-5天生长出单菌落，表面经过筛选驯化后的枯草芽孢杆菌能够耐受20％浓度的磷酸氢二铵。