化合物及其用于治疗炎症和调节免疫应答的用途

摘要

本发明提供了化合物和包含这些化合物的组合物，它们具有免疫调节活性和/或抗炎症活性。

权利要求

1.一种分离的化合物或其盐用于制备一种治疗受试者中的关节炎的药剂的用途，其中所述分离的化合物具有下式：其中，

R1是C1-8直链烷基；

R2是H；

R3、R4和R5独立地是–H；

R6是–O；

R7是–H；

R8、R9和R12独立地是–H；

R10是H；并且R11是H。

2.权利要求1的用途，其中所述分离的化合物为升麻消旋体A。

3.权利要求1的用途，其中所述关节炎为类风湿性关节炎。

说明书

化合物及其用于治疗炎症和调节免疫应答的用途

[0001] 相关专利申请的交叉引用

[0002] 本申请要求以2009年1月12日提交的流水号为61/143,925的美国临时申请的优先权，该临时申请通过引用的方式全文——包括所有图和序列——纳入本文。

背景技术

[0003] 人对损伤、癌症、微生物侵入等应答时，进行炎性反应以控制所述病理状态并且以开始修复过程。在炎症过程中，多种免疫细胞——包括T淋巴细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞——被募集至感染部位并产生细胞因子以促进免疫应答。在这些细胞因子中，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是介导所述免疫防御的一种主要的促炎性蛋白。

[0004] 除急性期反应外，TNF-α已被表明参与多种慢性疾病——包括肿瘤发生和类风湿1
性关节炎(RA)——的发展。TNF-α产生的失调被证明参与肿瘤发生——包括肿瘤生长 、细
2 3
胞增殖 和侵入 的起始——的不同阶段。对于肿瘤细胞增殖，TNF-α上调特定的生长因子从而介导恶性生长。所述细胞因子促进有利于血管生长的血管发生，以支持肿瘤迁移，并因此在肿瘤转移中起到关键作用。例如，胶质母细胞瘤迁移和金属蛋白酶的诱导在对TNF-α
4
效应的应答中显著增强 。

[0005] TNF-α介导的慢性疾病发病的实例包括类风湿性关节炎和炎性肠病。类风湿性关节炎患者在滑膜组织中有低级隐性炎症。已经知道，TNF-α在发炎关节处过量产生导致对关节软骨和周围骨的缓慢破坏。

[0006] 在感染的急性期中——例如在脓毒病的情况下，公知TNF-α的不受控制的产生可造成对宿主的有害效应。脓毒病是非冠心病加护病房中的第二常见死亡诱因，和高收入国5
家中的第10大死亡诱因 。导致脓毒病的感染的临床结果主要与细菌性内毒素(例如脂多
6-8
糖[LPS])对宿主免疫细胞——特别是单核细胞或巨噬细胞——的过度刺激有关 。LPS过
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度刺激的巨噬细胞还会产生高水平的介导物，例如白细胞介素-1(IL-1)、IL-6和TNF-α。
这些介导物牵涉脓毒病的发病机理之中，并且被发现是对宿主死亡起作用的因素。开发定向抑制TNF-α产生的新型疗法可有助于协助对上述这些急性病和慢性病的治疗。

[0007] 在暴露于病原体和内毒素后，细胞内信号传递通路——包括特异性的激酶和转录因子——被活化，以诱导TNF-α的表达。有丝分裂原激活的蛋白(MAP)激酶和核因子10-12
κB(NF-κB)参与病原体诱导的TNF-α表达已被记录 。分枝杆菌、禽流感和HIV-1Tat
13-15
蛋白是通过MAP激酶进行的TNF-α诱导物 。

[0008] 在人中有三种已知的MAP激酶亚型——包括细胞外信号调节的激酶-1/2(ERK16-20
1/2)、p38MAP激酶和c-Jun N末端激酶(JNK) 。它们可通过导致对转录因子例如NF-κB的活化的蛋白质磷酸化级联转导多种细胞外刺激。NF-κB的活化在细胞因子——包括IL-6
13-15
和TNF-α——产生中是至关重要的 。该过程通过如下方式发生：经I-κB激酶(IKK)
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信号体复合物在Ser32和Ser36磷酸化I-κB，然后是蛋白体降解 以及因此的I-κB和
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NF-κB亚基解离 。然后，将活化的NF-κB从细胞质移位至细胞核，它在细胞核中结合至反应性基因的启动子区中的κB结合位点，导致起始促炎介导物的转录。因为NF-κB的不
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适当活化与很多人疾病相关 ，它已被认为是治疗介入的可能靶标。

[0009] 非甾体类抗炎药(NSAID)——包括阿司匹林、布洛芬和吲哚美辛——公知用于改善与炎性疾病(例如类风湿性关节炎和炎性肠病)相关的急性和慢性疼痛。然而，它们对于治疗晚期类风湿性关节炎和相关自身免疫性疾病无效。对于这些病症，使用类固醇和细胞性毒药，例如甲氨喋呤和环磷酰胺。这些药物和严重副作用——包括胃肠刺激、严重出血和骨髓抑制——相关。

[0010] 近年来，已经开发了免疫治疗物，其目标是中和TNF-α并抑制其不利的促炎症作用。这些治疗物包括可溶性TNF-α受体(Enbrel)和抗-TNF-α抗体(英夫利昔单抗)。虽然它们在阻断疾病发展中是新颖且有效的，但它们是非常昂贵的治疗方案。

[0011] 已经进行大量工作来努力从天然来源——特别是从微生物、植物和海洋生物——开发生物活性剂。植物可作为新药物的替代性的和补充性的来源，原因是它们包含可能具有强生物效应的多种以前未知的化学物。

[0012] 中药已经被中国人实践了2-3千年。中药涉及疾病的病理以及诊断、治疗和预防。中药材已经被记载于许多药典中。草药的经典参考文献之一是李时珍在14世纪晚期写的《本草纲目》。该书包含约2,500项草药和其他产物(包括动物和矿物)的条目。

[0013] 中药中使用的草药是可市购的。常用草药包括人参(Ginseng radix)、当归(Angelica sinensis radix)、黄 芪(Astragali radix)、甘 草(glycyrrhiza uralensis Fisch.，Glycyrrhiza glabra L. 或 Glycyrrhiza inflata Bat—— 优 选 Glycyrrhiza uralensis Fisch——的根茎)和黄苓(Scutellariae radix)。通常，获得的是干燥形式的草药，有时已经磨成粉末。

[0014] 升麻根茎(Cimicifuga rhizome)在美国东部和加拿大有长久且多样的药用历史26
。在历史上，本土的美洲印第安人使用升麻根茎治疗多种病症，包括全身乏力、疟疾、风湿
26-28
病、肾功能异常、咽喉痛，月经不调和更年期 。在亚洲国家——包括中国、日本和韩国，总状升麻(Cimicifuga racemosa)及其相似物大三叶升麻(Cimicifuga heracleifolia)、升麻(Cimicifuga foetida)和兴安升麻(Cimicifuga dahurica)已被用做中草药来治疗发
29，30
热、疼痛和炎症 。

[0015] 以前的研究证明了总状升麻提取物对组胺、缓激肽和环氧合酶-2(COX-2)介导的31
炎症作用的抑制效应 。通过其对活性氧簇的清除效应，所述提取物还对甲萘醌诱导的DNA
32
损伤有保护效应 。另外，大三叶升麻提取物已被证明具有抗呼吸道合胞病毒的抗病毒活性
30
。在最近的研究中，升麻提取物被证明可诱导肝癌细胞的凋亡和细胞周期停滞，这些是抑
33 36
制肿瘤进展的关键性效应 。还有，总状升麻对更年期调节反应的作用已被很好地研究 。
这些数据表明，总状升麻的成分可能发挥类似于雌激素的功能。其他研究表明，总状升麻扰
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乱细胞因子信号传递，目的是介导其他生物功能 。

[0016] 如今，在用于类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎和强直性脊柱炎的治疗中，单克隆TNF-α抗体在控制疾病进展中发挥重要作用。类似地，在克罗恩病患者中已经进行了多项随机的、双盲的、安慰剂对照的临床试验。这些临床试验的结果表明，TNF-α抗体41
(英夫利昔单抗)对所述患者具有有利效应 。

[0017] 另外，最近的研究表明，炎症反应——包括TNF-α产生——在心血管疾病(CVD)发病机理中发挥重要作用。已经提出，TNF-α可使动脉粥样硬化生成和导致其破裂的动脉粥样硬化斑块不稳定，导致CVD患者心肌梗塞或中风。

[0018] 在微生物感染中，巨噬细胞被活化以产生介导免疫应答的细胞因子。根据侵入微生物及其生物学性质，宿主免疫系统利用不同组的细胞因子来局部地和全身地对抗侵入病原体。

[0019] 一个好的实例是分枝杆菌感染，其中促炎细胞因子TNF-α通过传播炎症在宿主42
存活中发挥关键作用，以通过形成肉芽肿而包含所述微生物 。TNF-α在控制分枝杆菌生
43
长中的保护性作用是通过接受抗-TNF-α抗体疗法的患者中结核病复发来举例说明的 。

[0020] 虽然促炎细胞因子的效应是保护性的，但它们的过量产生对所述宿主可能有不利效应。事实上，促炎细胞因子不受控制的诱导可以导致并发症，例如低血压、器官衰竭，甚至44，45
死亡 。事实上，TNF-α在内毒素血症患者中的过量产生可导致严重的有害症状。在慢性疾病例如类风湿性关节炎中，已知TNF-α过量表达是破坏因素，并且与进行性关节破坏
46
有关 。

发明内容

[0021] 本发明提供了化合物以及包含这些化合物的组合物，所述化合物和组合物具有免疫调节活性和/或抗炎症活性。在一些实施方案中，由于这些化合物对TNF-α的效应，它们具有并非与炎症特异性相关的免疫调节活性。

[0022] 本发明的一个实施方案涉及一种从草药分离的化合物。有利地，该化合物具有强抗炎效应和免疫调节效应。

[0023] 因此，本发明涉及具有以下结构的基本上纯的抗炎症化合物：

[0024]

[0025] 其中，

[0026] R1是烷基；

[0027] R2是H或烷基；

[0028] R3、R4和R5独立地是-H、酰基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、羟基、烷基、羟基烷基或-COOH；

[0029] R6是-O或-NH；

[0030] R7是-H、烷基、烷氧基、羟基烷基、羟基或卤素；

[0031] R8、R9和R12独立地是-H、酰基、卤素、氨基、烷基氨基、羟基、烷基、羟基烷基或-COOH；

[0032] R10是H或烷基；并且

[0033] R11是H或烷基；

[0034] 有利地，在一个实施方案中，本发明的化合物可以抑制LPS诱导的TNF-α产生(AL-to-David，请考虑用IP语言加上这一点：由于其对内毒素(LPS)效应的强抑制，本发明的化合物可以应用于内毒素血症之外，包括出现在自身免疫病中的炎症病症和其他相关病症。

[0035] 本发明还涉及包含可药用载体和本发明的抗炎化合物的药物组合物。在一个优选的实施方案中，所述组合物包含抗炎化合物作为活性成分。

[0036] 本发明还涉及使用所述化合物或包含所述化合物的组合物用于抑制动物(优选哺乳动物，包括人)的炎症的方法。本发明还涉及使用所述化合物或包含所述化合物的组合物用于调节动物(优选哺乳动物，包括人)的免疫活性的方法。

[0037] 附图说明μ

[0038] 图1示出从总状升麻提取B22EES1-8-3的方案。将总状升麻(1.8kg)磨碎并通过连续超声处理以500mL milli-Q水提取1小时。然后，将所收集的上清液以乙酸乙酯(EtOAc)(1∶1)分配。所生成的经干燥的EtOAc提取物复原，然后以己烷(n-C6H14)、EtOAc和丁醇(n-BuOH)连续分配。使用生物测定法指导的分级分离方案，将对LPS诱导的TNF-α产生显示抑制效应的级分进行硅胶60A(35-75μm)色谱和使用梯度洗脱的反相高效液相色谱，直到得到具有抗炎活性的单一化合物。

[0039] 图2A-2B示出B22EES1-8-3的HPLC色谱图和UV吸光度。通过反相HPLC纯化所述-1化合物，所述反相HPLC使用从25％-90％的乙腈以1mL min 的流速进行梯度洗脱。(A)使用光二极管阵列检测器在254、210和280nm下检测到单峰值。B22EES1-8-3在大约9.4min洗脱。(B)B22EES1-8-3的UV吸光度在290和325nm下最大化，这表明它具有共轭的芳香体系。

[0040] 图3示出B22EES1-8-3的1H(上图)和13C NMR(下图)谱。使用氘代甲醇1 13
(methanol-d)作为溶剂在500MHz下(对于 H)和在125.765MHz下(对于 C NMR)操作，通过Bruker 500MHz DRX NMR谱仪阐明B22EES1-8-3的结构。

[0041] 图4A-4B示出总状升麻的生物测定法指导的分级分离。以100μg/mL的不同总状升麻级分处理原代血巨噬细胞(PBMac)并持续24小时，然后加入20ng/mL LPS并维持3小时。然后，进行TNF-α和GAPDH的RT-PCR(A)和定量RT-PCR(B)测定。所示结果代表至少＊3个独立实验，其细胞获自不同供体。 与相应对照相比P＜0.05。

[0042] 图5A-5B示出B22EES1-8-3和地塞米松对LPS诱导的TNF-α生产的抑制。以(A)140μM B22EES1-8-3或(B)1.3或5.1μM地塞米松(Dex)孵育PBMac持续24小时，然后加入1ng/mL和10ng/mL LPS再维持24小时。收集所述培养上清液，并且通过ELISA测定＊TNF-α。结果显示为6次独立实验的平均值±标准差(S.D.)，其细胞获自不同供体。 与相应对照相比P＜0.05。

[0043] 图6A-6C示出B22EES1-8-3对LPS诱导的ERK1/2和p38MAP激酶的磷酸化(磷酸基)以及NF-κB p65的核易位的效应。以B22EES1-8-3(140μM)孵育PBMac持续24小时，然后加入10ng/mL LPS另外维持15分钟。收获细胞质蛋白(A、B)和核蛋白(C)，用于蛋白质印迹分析：(A)细胞质蛋白：磷酸-ERK1/2和总ERK1/2。(B)细胞质蛋白：磷酸-p38和总p38激酶。(C)核蛋白：上图，NF-κB p65和核纤层蛋白B；下图，NF-κB p65的凝胶照片中＊相应泳道的强度。所示结果代表至少3次独立实验，其细胞获自不同供体。 与相应对照相比P＜0.05。

[0044] 图7A-7B示出CF22EES1-8(A)和CH22EES1-8(B)的HPLC色谱图。在总状升麻提取步骤后提取草药升麻和大三叶升麻。将它们的提取物(CF22EES1-8和CH22EES1-8)注入至使用与B22EES1-8-3相同的条件的HPLC，并记录色谱图。所述色谱图显示存在化合物(标＊有 )，其保留时间在大约9.4分钟。

[0045] 图8A-8C示出(A)B22EES1-8-3、(B)CF22EES1-8和(C)CH22EES1-8的UPLC色谱图和HRESI-MS谱。在总状升麻提取步骤后提取草药升麻和大三叶升麻。将它们的级分(CF22EES1-8和CH22EES1-8)注入至使用与B22EES1-8-3相同条件的HPLC偶联的高分辨＊率ESI-TOF-MS。所述色谱图显示存在化合物(标有 )，其保留时间在大约6分钟，离子峰在357m/z。

[0046] 序列说明

[0047] SEQ ID NO：1是可用于本发明的引物。

[0048] SEQ ID NO：2是可用于本发明的引物。

[0049] SEQ ID NO：3是可用于本发明的引物。

[0050] SEQ ID NO：4是可用于本发明的引物。

具体实施方式

[0051] 已经根据本发明确定了新型且有利的化合物。有利地是，这些分子具有有用的免疫调节性质和/或抗炎性质。本发明还提供了包含这些化合物的组合物，以及用于治疗受试者的炎性病症和免疫病症的方法。

[0052] 本发明的一个实施方案涉及一种从草药分离的化合物。有利地是，该化合物具有强抗炎效应和免疫调节效应。

[0053] 因此，本发明涉及一种具有下式的基本上纯的抗炎化合物。

[0054]

[0055] 其中

[0056] R1是烷基；

[0057] R2是H或烷基；

[0058] R3、R4和R5独立地是-H、酰基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、羟基、烷基、羟基烷基或-COOH；

[0059] R6是-O或-NH；

[0060] R7是-H、烷基、烷氧基、羟基烷基、羟基或卤素；

[0061] R8、R9和R12独立地是-H、酰基、卤素、氨基、烷基氨基、羟基、烷基、羟基烷基或-COOH；

[0062] R10是H或烷基；并且

[0063] R11是H或烷基；

[0064] “烷基”是指1-8个碳原子的直链饱和单价基团或3-8个碳原子的支链饱和单价基团。它可包括1-4个碳原子或1-3个碳原子的烃基，所述烃基可能是直链的。实例有甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。

[0065] “酰基”是指基团-C(O)R，其中R是氢、烷基或环烷基或杂环烷基。实例包括甲酰基、乙酰基、乙羰基等。

[0066] “卤素”是指氟、氯、溴或碘，例如溴和氯。

[0067] “卤代烷基”是指被一个或多个相同或不同卤原子取代的烷基，例如-CH2Cl、-CH2Br、-CF3、-CH2CH2Cl、-CH2CCl3等。

[0068] “氨基”意欲是指基团-NH2。

[0069] “烷氨基”是指基团-NHR或-NR2，其中每个R独立地是烷基基团。实例包括甲基氨基、(1-甲基乙基)氨基、甲基氨基、二甲基氨基、甲基乙基氨基、二(1-甲基乙基)氨基等。

[0070] “羟基”意欲是指基团-OH。

[0071] “羟烷基”是指被一个或多个，优选一个、两个或三个羟基基团取代的如本文定义的烷基基团。代表性实例包括但不限于羟甲基、2-羟乙基、2-羟丙基、3-羟丙基、1-(羟甲基)-2-甲丙基、2-羟丁基、3-羟丁基、4-羟丁基、2，3-二羟丙基、2-羟基-1-羟甲乙基、2，3-一羟丁基、3，4-二羟丁基和2-(羟甲基)-3-羟基-丙基，优选2-羟乙基、2，3-二羟丙基和1-(羟甲基)2-羟乙基。

[0072] “烷氧基”意欲是指基团-ORa，其中Ra是烷基。示例性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基等。

[0073] 本发明还涉及分离的对映异构化合物。本发明化合物的分离的对映异构形式基本上彼此分离(即对映异构体过量)。换句话说，所述化合物的“R”形式基本上无所述化合物的“S”形式，并且因此为“S”形式的对映异构体过量。相反，所述化合物的“S”形式基本上无所述化合物的“R”形式，并且因此为“R”形式的对映异构体过量。在本发明的一个实施方案中，所述分离的对映异构化合物是至少约80％的对映异构体过量。在一个优选的实施方案中，所述化合物是至少约90％的对映异构体过量。在一个更优选的实施方案中，所述化合物是至少约95％的对映异构体过量。在一个甚至更优选的实施方案中，所述化合物是至少约97.5％的对映异构体过量。在一个最优选的实施方案中，所述化合物是至少约99％的对映异构体过量。

[0074] 本文使用的术语“受试者”描述了生物体，包括哺乳动物，例如灵长类，可以对其提供用本发明的组合物进行的治疗。可受益于所公开的治疗方法的哺乳动物物种包括但不限于猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；以及家养动物，例如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。

[0075] 在一个具体实施方案中，本发明涉及本文中称为B22EES1-8-3(缩写为B8-3)的化合物，该化合物在5轮提取后被鉴定。B8-3的结构为：

[0076]

[0077] 有利地，该化合物抑制TNF-α诱导。

[0078] 在鉴定B8-3后，将其生物活性与标准的免疫抑制药物地塞米松进行比较。以B8-3进行的孵育改善LPS正调节的TNF-α生产超过50％(图5A)，这与地塞米松的效应相当(图5B)。

[0079] 地塞米松是一种用于治疗多种自身免疫疾病的有效药物。不幸地是，公知使用地塞米松对患者有副作用。因为B8-3是从包括升麻和大三叶升麻的草本分离的，这些草本在人使用中的毒性已经被很好地试验了数百年。

[0080] 而且，已经确定，MAP激酶和NF-κB的活化可被B8-3消除。这两种介导物在细胞因子生产中起到关键作用并因此调节多个免疫应答。B8-3还可根据本发明用于调节TNF-α的下游效应物。

[0081] 使用独特的分离和生物测定法指导的方法，将B8-3从总状升麻和其中国对应物中分离。B8-3对细胞因子调节的效应是经由其在调节信号传递激酶和转录因子活性中的活性而出现。B8-3抑制促有丝分裂剂诱导的炎症反应，这使得该分子可用于治疗多种临床病症。由于TNF-α的过量生产是有毒的并且可导致严重的并发症，限制过度的炎症反应可有利于在进行临床治疗的患者。这是确定总状升麻和其中国对应物中的活性抗炎化合物的首次研究。本发明的化合物还可用于治疗与感染有关的炎症，所述感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌、酵母和其他微生物引起的感染。另外，本发明的化合物可以用于治疗多种因素介导的炎症，所述因素包括但不限于干扰素、白细胞介素和环境毒素。

[0082] 本发明的化合物和药物组合物可用于治疗或改善任何疾病、病症或障碍中的炎症症状，所述疾病、病症或障碍中免疫和/或炎症抑制是有利的。其中本发明的化合物和组合物可用于抑制不需要的免疫应答和炎症的炎性疾病、病症或障碍包括但不限于关节炎(包括但不限于类风湿性关节炎)，以及关节或肌肉骨骼系统的其他疾病、病症或障碍，上述疾病、病症或障碍中免疫和/或炎症抑制是有利的。

[0083] 而且，所述化合物和组合物还可用于治疗或改善与以下疾病有关的炎症：动脉粥样硬化；动脉硬化；动脉粥样硬化性心脏病；再灌注损伤；心跳停止；心肌梗塞；血管炎性病，包括脑血管疾病(中风)；呼吸窘迫综合征；以及这样的其他心肺疾病、病症或障碍，即其中免疫和/或炎症抑制将是有利的。

[0084] 另外，所述化合物和组合物还可用于治疗或改善与以下疾病有关的炎症：消化性溃疡；溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠应激综合征、其他炎性肠病以及这样的其他胃肠道疾病、病症或障碍，即其中免疫和/或炎症抑制将是有利的；肝纤维化；肝硬化和这样的其他肝脏疾病、病症或障碍，即其中免疫和/或炎症抑制将是有利的；甲状腺炎和这样的其他腺疾病、病症或障碍，即其中免疫和/或炎症抑制将是有利的；以及肾小球肾炎和这样的其他肾和泌尿系统疾病、病症或障碍，即其中免疫和/或炎症抑制将是有利的。

[0085] 另外，所述化合物和组合物还可用于治疗或改善与以下疾病有关的炎症：创伤后炎症；败血症性休克；传染性疾病，其中免疫和/或炎症抑制将是有利的；炎症并发症和手术副作用，其中免疫和/或炎症抑制将是有利的；骨髓移植和这样的其他移植并发症和副作用，即其中免疫和/或炎症抑制将是有利的；炎症并发症和/或免疫并发症以及基因治疗的副作用，例如由于病毒载体的感染；以及与获得性免疫缺陷综合征(AIDS)相关的炎症。

[0086] 而且，所述化合物和组合物还可用于抑制与炎症不相关的巨噬细胞或T细胞相关的免疫应答方面。所述化合物和组合物能够抑制巨噬细胞或T细胞活性，包括但不限于巨噬细胞抗原呈递活性、巨噬细胞细胞因子生产、T细胞细胞因子生产、T细胞粘附活性、T细胞增殖等。因此，所述肽、肽衍生物和组合物可用于压抑或抑制体液免疫应答和/或细胞免疫应答。

[0087] 所述化合物和组合物还可通过减少单核细胞和淋巴细胞的数量来用于治疗或改善单核细胞和白细胞增殖疾病，例如白血病。

[0088] 本发明的化合物和药物组合物还可用于预防和/或治疗以下情况下的移植物排斥：移植天然或人工细胞、组织和器官例如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然和人工皮肤组织等。

[0089] 所述化合物和组合物还可用于治疗或改善与以下疾病有关的炎症：超敏感性、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原病或者这样的其他自身免疫疾病、病症或障碍，即其中免疫和/或炎症抑制是有利的。

[0090] 所述化合物和组合物还可用于治疗或改善与以下疾病相关的炎症：耳炎和其他耳鼻咽喉疾病、病症或障碍，其中免疫和/或炎症抑制是有利的；皮炎和其他皮肤疾病、病症或障碍，其中免疫和/或炎症抑制是有利的；牙周病和其他牙疾病、病症或障碍，其中免疫和/或炎症抑制是有利的。

[0091] 另外，所述化合物和组合物还可用于治疗或改善与以下疾病相关的炎症：后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、前葡萄膜炎、结膜炎、脉络膜视网膜炎、葡萄膜视网膜炎、视神经炎、眼内炎症例如视网膜炎和黄斑囊样水肿、交感性眼炎、巩膜炎、视网膜色素变性、退行性眼底病的免疫和炎症成分、眼外伤的炎症成分、感染造成的眼部炎症、增生性玻璃体视网膜病变、急性缺血性视神经病变、过度瘢痕形成例如青光眼滤过手术后、抗眼移植物的免疫和/或炎症反应以及这样的其他免疫和炎症相关的眼疾病、病症或障碍，即其中免疫和/或炎症抑制是有利的。

[0092] 而且，所述化合物和组合物还可用于治疗或改善与以下疾病相关的炎症：自身免疫疾病、病症或障碍，其中在中枢神经系统(CNS)以及在任何其他器官中免疫和/或炎症抑制都是有利的；帕金森病；帕金森病治疗导致的并发症和/或副作用；AIDS相关的痴呆复合病(HIV相关脑病)；德维克病；西德纳姆舞蹈病；阿耳茨海默病和这样的其他中枢神经系统的退行性疾病、病症或障碍，即其中免疫和/或炎症抑制是有利的；中风的炎症成分；小儿麻痹症后期综合征；精神病症的免疫和炎症成分；脊髓炎；脑炎；亚急性硬化性全脑炎；脑脊髓炎；急性神经病变；亚急性神经病变；慢性神经病变；格林-巴利(Guillaim-Barre)综合征；西德纳姆舞蹈病；重症肌无力；脑假瘤；唐氏综合征；亨廷顿氏病；肌萎缩侧索硬化；中枢神经系统(CNS)压抑、CNS创伤、脑血管意外(中风)或者CNS感染或缺氧缺血的炎症成分；肌萎缩和营养不良的炎症成分；以及这样的中枢和外周神经系统的免疫和炎症相关的疾病、病症或障碍，即其中免疫和/或炎症抑制是有利的。

[0093] 还在另一个实施方案中，本发明的化合物和组合物可用于在已失去其免疫赦免的免疫赦免部位(例如脑、眼和睾丸)处恢复免疫赦免。

[0094] 在一个实施方案中，本发明提供了分离的化合物。本文使用的“分离的”是指已经被从其天然存在的任何环境移出的化合物。例如，分离的B8-3不是指存在于总状升麻中的B8-3化合物。在优选的实施方案中，本发明的化合物纯度为至少75％，优选纯度至少90％，更优选纯度超过95％，最优选纯度超过99％(基本上纯的)。

[0095] 本发明还提供了包含以能够与可药用载体结合的形式的本发明化合物的治疗组合物或药物组合物。在本文中，所述化合物可以是例如分离的或者基本上纯的。术语“载体”是指与所述化合物一块给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油例如矿物油；植物油例如花生油、大豆油和芝麻油；动物油；或者合成来源的油。盐水溶液、葡萄糖(dextrose)水溶液和甘油溶液也可应用为液体载体，特别是用于可注射溶液。用于治疗或改善中枢神经系统中炎症的特别优选的药物载体是可以穿透血/脑屏障的载体。本文使用的载体不包括天然植物材料，因为其天然存在。

[0096] 合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。根据需要，所述治疗组合物还可包含少量的润湿剂、乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以取以下形式：溶液、悬液、乳剂、片剂、胶囊、粉剂、持续释放的制剂等。所述组合物可以用传统粘合剂和载体(例如甘油三酯)配制。合适药物载体的实例记载在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中。这类组合物包含治疗有效量的治疗组合物和合适量的载体，以提供用于适合给予患者的形式。所述制剂应适合所述给药模式。

[0097] 在一个实施方案中，所述组合物是根据常规步骤配制，作为适合用于对人局部注射给药的药物组合物。一般而言，用于局部注射给药的组合物为溶于无菌等渗水性缓冲物中的溶液。如果需要，所述组合物还包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，所述成分分开地提供，或者以单位剂型形式混合在一起，例如，为在标明活性剂的量的熔封容器(例如安瓿或囊)中的冻干粉末或无水浓缩物。如果通过注射给予所述组合物，可以提供用于注射的无菌水或者盐水的安瓿，使得可在给药之前混合所述成分。

[0098] 本发明的治疗组合物或药物组合物可配制为中性形式或者盐形式。可药用盐包括与游离氨基基团形成的盐，例如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐；以及与游离羧基基团形成的盐，例如源自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。

[0099] 本发明还提供了对所述化合物的修饰，使得它一旦被给予受试者将更加稳定，即一旦被给药，它与未修饰的化合物相比有更长有效时间。这类修饰是本领域技术人员公知的，例如聚乙二醇衍生化(PEG化(PEGylation))、微胶囊化等。

[0100] 在治疗具体疾病、病症或障碍中有效的本发明治疗组合物或药物组合物的量取决于所述疾病、病症或障碍的性质，并且可以通过标准的临床技术测定。一般而言，所述剂量范围为从约0.001mg/kg至约2mg/kg变化。另外，体外测定法可任选地应用于帮助鉴定最佳剂量区间。应用于所述制剂中的精确剂量还将依赖于给药途径以及疾病、病症或障碍的严重度，并且应根据医生的判断和每个患者的情况确定。有效剂量可外推自源自体外或动物模型试验系统的剂量反应曲线。例如，为了基于从大鼠研究产生的数据获得对于人的有效mg/kg剂量，将大鼠中的有效mg/kg剂量除以6。

[0101] 本发明还提供了一种包含一个或多个容器的药包或试剂盒，所述容器装有本发明药物组合物的一种或多种成分例如化合物、载体。

[0102] 本发明的化合物还可以根据中药实践配制。通过标准的临床技术，在治疗具体疾病、病症或障碍中有效的制剂的组成和剂量将取决于所述疾病、病症或障碍的性质。

[0103] 处方量的中药可容易地制成适合对人和动物给药的任何药物形式。合适的形式包括，例如酊剂、煎剂和干浸膏粉。这些药物可以口服、经静脉注射或粘膜施用。所述活性成分还可以配制成胶囊剂、粉剂、片剂(pallet)、锭剂、栓剂、口服液剂、巴氏杀菌的胃肠悬浮注射剂、少量或大量注射剂、冷冻的粉末注射剂、巴氏杀菌的粉末注射剂等。所有上述方法都是本领域技术人员已知的，记载于书籍中并通常被草药医生使用。

[0104] 酊剂是通过将草药悬浮在醇溶液例如葡萄酒或饮料酒中而制备。在悬浮一段时间后，可将所述液体(所述醇溶液)给药，例如每天2-3次，每次一茶勺。

[0105] 煎剂是通常形式的草药制品。它传统上在粘土罐中制备，但也可以在玻璃容器、釉质容器或不锈钢容器中制备。可以将所述制剂在水中浸泡一段时间，然后使之沸腾并慢沸至水量减少至例如一半。

[0106] 提取物是草药的基本组分的浓缩制品。一般而言，通过将所述草药悬浮在适当选择的溶剂中而从所述草药提取基本组分，所述溶剂一般是水、乙醇/水的混合物、甲醇、丁醇、异丁醇、丙酮、己烷、石油醚或其他有机溶剂。可以借助浸软、渗滤、再渗滤、逆流萃取、涡轮萃取(turboextraction)或者通过二氧化碳超临界(温度/压力)萃取而进一步促进所述提取过程。在过滤除去草药碎片后，可借助喷雾干燥、真空烘箱干燥、流体床干燥或冷冻干燥，将所述提取溶液进一步蒸发并因此浓缩，得到软提取物(浓稠浸膏)和/或最终得到经干燥的提取物——干燥浸膏。所述软提取物或干提取物还可进一步溶解在合适的液体中至用于给药的所需浓度，或者被加工成例如丸剂、胶囊剂、注射剂等形式。

[0107] 材料和方法

[0108] 植物材料

[0109] 总状升麻购自Glenbrook Farms Herbs and Such，Campbellsville，Kentucky。大三叶升麻、升麻和兴安升麻购自草药市场，随后由Purapharm就其种类进行验证。

[0110] 生物活性分子的提取和分离

[0111] 用于植物提取的步骤在图1中显示。简而言之，将总状升麻(1.8kg)碾碎，匀浆，然后悬浮在milli-Q水中(1∶5)1小时，同时进行连续超声处理。将上清液通过分析滤纸过滤，然后以乙酸乙酯(EtOAc)(1∶1)分配3次。将所得到的EtOAc提取物在真空中浓缩至干(35℃)，得到14.97g暗褐色残留物。将所述残留物再配制于甲醇(MeOH)中，然后通过以己烷(n-C6H14)分配进行分级分离。将所述MeOH级分浓缩并再配制于H2O中，然后以EtOAc和丁醇(n-BuOH)连续分配。得到4个级分，称为n-C6H14、EtOAc、n-BuOH和H2O。

[0112] 将对LPS诱导的TNF-α生产表现出抑制效应的级分使用n-C6H14、EtOAc和MeOH进行另外的硅胶60A(35-75μm)色谱，以得到6个级分。通过反相高效液相色谱(HPLC)-1(Lichrospher 100RP C18EC 5μ，250×4.6mm ID)，使用流速为1mL min 的25％乙腈(CH3CN)至90％CH3CN梯度洗脱而进一步纯化所述活性级分。

[0113] 在254、210和280nm下，使用Agilent 1200系列的快速扫描光二极管矩阵检测器组实现峰值检测。在200nm和300nm之间以1nm的间隔扫描洗脱峰值，以测定最大和最小吸光度。

[0114] 通过重复使用HPLC的纯化过程，在大约9.4分钟时洗脱了单一化合物，在290和325nm下具有最大UV吸光度，这表明它具有共轭芳香体系。该化合物(B22EES1-8-3)显示出抗炎症活性。

[0115] 阐明分子结构

[0116] 所生成的纯化合物(B22EES1-8-3)的结构可通过如下方式阐明：使用Bruker1 13
500MHz DRX NMR核磁共振仪，对于 H在500MHz下且对于 C NMR在125.765MHz下操作，使用氘代甲醇作为溶剂。无畸变极化转移增强(DEPT)实验是使用135°的转移脉冲进行，以得到对于CH和CH3的阳性信号以及对于CH2的阴性信号。在micrOTOF II 411ESI-TOF质谱仪(Bruker Daltonics)上进行HR-ESI-MS。以阴性电喷雾(ESI)模式，在100至1600m/z的扫描区间下，以2Hz的采样速率获得数据集。ESI参数如下：毛细管，3.2kV；雾化器压力，
4bar；干415气体流速，8L/min；干气体温度，200℃。

[0117] 所述化合物的13C NMR谱显示在以下的信号：δ68.6(t，C-1)，204.6(s，C-2)，46.4(t，C-3)，126.1(s，C-4)，117.7(d，C-5)，146.7(s，C-6)，145.8(s，C-7)，116.7(d，C-8)，
122.1(d，C-9)，168.3(s，C-1’)，115.3(d，C-2’)，147.6(d，C-3’)，128.9(s，C-4’)，114.9(d，C-5’)，148.2(s，C-6’)，151.8(s，C-7’)，112.6(d，C-8’)，123.1(d，C-9’) 和 56.5(q，MeO-7’)。另外，所述化合物在其HR-ESI-MS中显示m/z 357.0952的[M]-离子峰，与分子式C19H17O7(计算值357.0974)一致。

[0118] 使用HPLC-UV和UPLC-TOF-MS测定升麻和大三叶升麻中B22EES1-8-3的存在情况[0119] 依照上文描述的总状升麻提取步骤提取草药升麻和大三叶升麻。依照用于分离B22EES1-8-3的色谱条件，将草药升麻和大三叶升麻的提取物(CF22EES1-8和CH22EES1-8)注入带有PDA检测器的HPLC。记录各个样品的色谱图。还将CF22EES1-8和CH22EES1-8分别注入装配Xterra MSC18柱(150＊2.1mmID，3.5522μm)的Acquity UPLC系统(Waters，USA)。使用25％乙腈(CH3CN)至90％CH3CN梯度洗脱，以200μL/min的流速进行色谱分离。使用micrOTOF II ESI-TOF质谱仪(Bruker Daltonics)检测洗脱的化合物。以阴性电喷雾(ESI)模式，在100至1600m/z的扫描区间下，以2Hz的采样速率获得数据集。ESI参数如下：毛细管，3.2kV；雾化器压力，4bar；干气体流速，8L/min；干气体温度，200℃。

[0120] 通过与B22EES1-8-3的标准物比较它们的峰值，测定B22EES1-8-3在升麻和大三叶升麻的提取物中的存在情况。

[0121] 化学试剂

[0122] 来自大肠杆菌(E.coli)的内毒素(lipopolysacharride，LPS)购自Sigma，并且被用作TNF-α表达的诱导物。地塞米松(Sigma)被用作对照药物来抑制TNF-α的LPS诱导。

[0123] 细胞培养和原代血巨噬细胞分离

[0124] 通过如发明人以前报道中所述的Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia Biotech，14，15，34
Piscataway，NJ)密度梯度离心 ，自Hong Kong Red Cross提供的健康供体血液的血沉棕黄层(buffy coat)中分离人外周血单核细胞(PBMC)。简而言之，以每分钟3000转(rpm)离心所述血沉棕黄层15分钟，以分离所述血细胞和所述血浆。将所述热灭活血清过滤备用。

[0125] 用磷酸盐缓冲盐水(PBS)以1∶1的比例稀释所述细胞层。将所述稀释的细胞缓慢覆盖于Ficoll-Paque上并以2300rpm离心20分钟，用于从红细胞中分离单核细胞。将所述单核细胞层除出并以RPMI 1640培养基洗涤，直至上清液清澈。

[0126] 最后，将所述细胞再悬浮于添加5％自体血清的RPMI 1640培养基中，并培养1小时。然后除去非粘附性细胞，并将剩下的粘附性细胞在37℃和5％二氧化碳(CO2)下进一步再孵育24小时。

[0127] 使所述粘附性单核细胞脱离并将其接种于组织培养板上，再孵育7-14天，目的是使所述原代血单核细胞分化成原代血巨噬细胞(PBMac)。

[0128] 分离RNA和反转录

[0129] 通过TRIzol(Invitrogen)从进行或未进行总状升麻级分处理的原代血巨噬细胞提取总RNA。通过使用SuperScriptII系统(Invitrogen)依照制造商的说明书将信使RNA(mRNA)反转录(RT)成互补DNA(cDNA)。

[0130] 多聚酶链反应(PCR)和实时RT-PCR

[0131] 靶基因 的半定 量PCR测定 是在25μl反应 混合 物中进 行，所述 反应 混 合 物 包 含1.5mM MgCl2、0.2mM的 每 种 脱 氧 核 苷 三 磷 酸、0.25μM 的 每种 引 物、2 单 位 的 Taq 聚 合 酶 (Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ) 和 1μl 的 cDNA。 用 于 TNF-α 和 甘 油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶 (GAPDH) 的PCR 引 物 组 如 下 所 示。TNF-α(上 游：5 ′-GGCTCCAGGCGGTGCTTGTCC-3 ′ (SEQ ID NO：1)； 下 游：5 ′ -AGACGGCGATGCGGCTGATG-3 ′ (SEQ ID NO：2)) 和
GAPDH( 上 游：5 ′ -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ′ (SEQ ID NO：3)； 下 游：
5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(SEQ ID NO：4)。用于PCR的热循环条件是94℃维持30秒，60℃维持30秒和72℃维持1分钟。该循环反应重复24个以上循环。

[0132] 通过使用Applied Biosystems Universal Master Mix依照制造商的说明书进行定量RT-PCR。TNF-αTaqMan探针购自Applied Biosystems，18s RNA被用作内部参照。在每个定量RT-PCR测定中，对样品进行3次重复试验。

[0133] 酶联免疫吸附测定(ELISA)

[0134] 将经或未经B22EES1-8-3预处理的且经LPS处理的PBMac的培养上清液以不同的时间间隔收集，并在-70℃下保存。通过特异性针对该细胞因子的ELISA试剂盒(R&D system，Minneapolis，MN)测量所述分泌的TNF-α水平。

[0135] 制备细胞提取物

[0136] 为了收集全细胞裂解物，将PBMac以冷PBS洗涤并在冷裂解缓冲液(50mM三(羟甲基)氨基甲烷-氯(Tris-Cl)[pH7.4]；150mM氯化钠(NaCl)；50mM氟化钠(NaF)；10mM β-甘油磷酸盐；0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)；10％甘油；1％Triton X-100；1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)；1mM原钒酸钠；2μg/mL胃蛋白酶抑制剂A；2μg/mL抑酶肽和2μg/mL亮抑酶肽)中孵育20分钟。然后，在4℃下将所述裂解物离心20分钟。收集上清液并将其保存在下至-70℃直至使用。

[0137] 为了收集核蛋白提取物，将所述处理的细胞以PBS洗涤，并再悬浮于缓冲液A(10mM 4-(2- 羟 乙 基 )-1-哌 嗪 乙 磺 酸(HEPES)[pH7.9]、10mM 氯 化 钾 (KCl)、0.1mM EDTA、0.1mM乙二醇四乙酸(EGTA)、1mM二硫苏糖醇(DTT)、0.5mM苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulphonylfluoride或phenylmethylsulphonyl fluoride)(PMSF)、2μg抑酶肽、1mM原钒酸钠、2μg/mL胃蛋白酶抑制剂A、2μg/mL亮抑酶肽和50mM NaF)中维持15分钟。在这之后，加入终浓度0.625％的NP-40并剧烈混合，使细胞裂解。

[0138] 将所述细胞裂解物离心，并收集含细胞质蛋白的上清液，在-70℃下保存。将所述核沉淀物再悬浮于缓冲液C(20mM HEPES[pH 7.9]、0.4M NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1mM DTT和1mM PMSF)中在冰上维持15分钟以完全裂解核膜。然后，将所述核裂解物离心，收集含核蛋
34，35
白的上清液，并在-70℃下保存 。

[0139] 蛋白质印迹分析

[0140] 将全细胞裂解物(20μg)或核蛋白(2μg)通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并转移至硝酸纤维素膜，用于以分别特异性针对磷酸化形式或完整形式的ERK1/2和p38MAPK(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)、NF-κB p65蛋白和核纤层蛋白B(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)的抗体探测过夜。将所述膜以缀合有辣根过氧化物酶(BD Transduction Lab，San Diego，CA)的相应第二抗体孵育。通过使用增强化学发光试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)显影所述信号。为了量化来自所述蛋白质印迹的结果，扫描所述凝胶，并通过BioRad的计算机程序Quantity One分析带强度。

[0141] 本发明的范围不限于具体实施例和其中有关的建议步骤和用途，原因是可以在本发明对本领域技术人员提供的信息范围内进行修改。

[0142] 对本发明更完整的理解可以通过参考本发明的化合物、组合物和方法的以下具体实施例来获得。如下实施例举例说明了实施本发明的步骤。这些实施例不应被解释为限制性的。对本发明技术人员来说很清楚的是，所述实施例涉及使用可市购自已知来源(例如化学品供应库房(chemical supply house))的物质和试剂，因此未提供关于它们的详细信息。

[0143] 实施例1-提取并鉴定B22EES1-8-3

[0144] 通过以下方式得到浅褐色粉末：重复分配从总状升麻根茎制备的EtOAc级分，并且在硅胶和反相HPLC上依序进行色谱。详细步骤总结在图1中。

[0145] 使用HPLC，在大约9.4分钟洗脱所述化合物，为在波长254、210和280nm下具有UV吸光度的单一化合物(图2A)。在图2B中，所述化合物的UV吸光度在290和325nm下最大，这表明它具有共轭的芳香体系。所述化合物在其HR-ESI-MS中显示在m/z 357.0952- 1 13下的[M] 离子峰。与 H和 C谱数据(图3)结合，它被阐明为B22EES1-8-3。

[0146] 实施例2-生物测定

[0147] 总状升麻中负责抑制LPS诱导的TNF-α表达的化学化合物被鉴定。LPS公知是TNF-α的强诱导物，并且不使用细胞毒性剂不能容易地抑制其效应。

[0148] 将在原代巨噬细胞中对TNF-α诱导的细菌内毒素(脂多糖，LPS)刺激用作炎性疾病的模型，原因是TNF-α产生是关键免疫应答的指示物。

[0149] 将从总状升麻分离的个体提取物与PBMac孵育24小时，然后加入LPS再维持3小时。将所述经处理的样品的总RNA分离并使用特异性人TNF-α引物进行RT-PCR测定。这些结果表明级分B22EES1抑制LPS诱导的TNF-αmRNA表达(图4A，第2和4道)。在
B22EES1的亚级分中，仅B22EES1-4和B22EES1-8保持对TNF-α诱导的抑制活性(图4A，第12和20道)。

[0150] 实施例3-B22EES1-8-3对LPS诱导的细胞因子生产的效应

[0151] 在将B22EES1-8鉴定为负责对TNF-α的抑制效应后，将上文描述的B22EES1-8亚级分的活性分离并分析。单一分子，即B22EES1-8-3(缩写为B8-3)被发现是所述草药提取物中负责抗炎症效应的活性化合物。

[0152] 为了确认B8-3在抑制TNF-α生产中的活性，将B8-3与PBMac孵育24小时，然后加入浓度为1ng/mL和10ng/mL的LPS并维持24小时。收集培养上清液并通过ELISA测量所分泌的TNF-α的水平。

[0153] 在LPS浓度为1ng/mL和10ng/mL时，B8-3分别抑制了LPS诱导的TNF-α蛋白生产达47±19％和58±30％(图5A，第4道对比第5道，第6道对比第7道)。

[0154] 为了进一步比较B8-3与现有药物的效率，将地塞米松(强免疫抑制性皮质类固醇)被用作原型。将PBMac以地塞米松处理24小时，然后加入浓度为1ng/mL和10ng/mL的LPS并维持24小时。

[0155] 结果证明，在浓度为1.3和5.1μM时，地塞米松分别导致LPS诱导的TNF-α生产的显著抑制达32±7.5％和25±6.3％(图5B)。

[0156] 实施例4-B8-3导致的细胞因子下调的分子机制

[0157] 阐明了B8-3抑制LPS诱导的TNF-α生产所涉及的分子通路。已经明确记载了，38
在LPS处理的细胞中细胞因子生产的活化是通过LPS与其受体的结合而初始 。在结合所述受体后，信号传递激酶的级联被活化。在所活化的激酶中，MAP激酶在LPS诱导的细胞因子生产中起到关键作用。以前的研究表明，LPS和其他病原体对TNF-α的诱导需要ERK1/2
13，14，39
和p38MAPK的磷酸化和活化 。

[0158] 为了研究MAP激酶在TNF-α生产的B8-3抑制中的功能，将PBMac以B8-3处理24小时，然后加入LPS维持15分钟。随后收集蛋白质样品并进行蛋白质印迹。

[0159] 结果表明，LPS处理导致对两种不同MAP激酶(即ERK1/2和p38

[0160] MAPK)的磷酸化(图6，第2道)。以B8-3预处理时，ERK1/2的磷酸化(图6A，第2道对比第4道)，而不是LPS诱导的p38MAPK的磷酸化(图6B，第2道对比第4道)受到抑制。

[0161] 这些结果证明，B8-3的抗炎症活性可能部分地是由于其抑制ERK1/2磷酸化。

[0162] 沿着响应于LPS处理的由MAP激酶调节的信号传递通路，转录因子NF-κB的活化40
在诱导促炎细胞因子(包括TNF-α)中起到关键作用 。NF-κB的活化涉及对其特异性抑制物IκB的降解以及NF-κB亚基从细胞质易位至细胞核。根据本发明，加入B8-3并维持
24小时，然后加入LPS，减少了NF-κB p65亚基至细胞核中的易位。

[0163] 结果表明，将B8-3加入PBMac并维持24小时，然后加入LPS，减少了核级分中p65NF-kB的量(图6C，第2道对比第4道)，表明p65NF-kB至细胞核中的易位被B8-3抑制。一般而言，B8-3可抑制LPS诱导的激酶活性以及它们随后对用于TNF-α转录的核转录因子的活化。因此，本发明的化合物可用于调节在与炎症病症相关的细胞事件级联中NF-kB和/或ERK1/2下游的细胞内和/或细胞外活性。

[0164] 实施例5-使用HPLC-UV测定B22EES1-8-3在升麻和大三叶升麻中的存在情况[0165] 在相同的HPLC条件下，将B8-3的保留时间和UV吸光度与CF22EES1和CH22EES1-8的色谱图中的特征峰进行比较。在图7A和B中，两个样品都具有保留时间为约9.4min的峰，并且它们各自的UV吸光度与B8-3的UV吸光度相同(图2A&B)。这些结果表明，包括升麻和大三叶升麻的草药含有B8-3。

[0166] 实施例6-使用UPLC-TOF-MS测定B22EES1-8-3在升麻和大三叶升麻中的存在情况

[0167] 在相同的UPLC和ESI-MS条件下，将B8-3的保留时间和荷质比与CF22EES1-8和CH22EES1-8的色谱图和谱中的特征峰进行比较。在图8B和C中，两个样品都具有保留时间为约6min的峰，具有与化合物1相同的在m/z 357的离子峰(图8A)。这些结果表明，包括升麻和大三叶升麻的草药含有B8-3。

[0168] 参考文献

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