一种通过榨菜与紫甘蓝种间嵌合体创制榨菜新种质的方法

摘要

本发明公开了一种通过榨菜与紫甘蓝种间嵌合体创制榨菜新种质的方法，本发明利用已经建立的榨菜与紫甘蓝种间嵌合体通过常规的有性自交，获得具有显著性状变异的新种质；可以大大缩短创制新种质的周期，节省人力、物力消耗；本发明的方法创新性强，研究意义重大，为榨菜的种植创新与新品种的选育提供了一种崭新的途径。

权利要求

1.一种通过榨菜与紫甘蓝种间嵌合体创制榨菜新种质的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）选取6天苗龄的榨菜与紫甘蓝无菌幼苗，在无菌条件下将它们的一片子叶连同一半的顶端分生组织及部分下胚轴切下，并用激素处理液浸泡，然后取出进行茎尖靠接，插入诱芽培养基中培养诱导嵌合芽的再生；将嵌合芽切下后，于1/2MS培养基培养14天，然后在生根培养基中培养14-21天，从而获得稳定的榨菜与紫甘蓝种间嵌合体TTC；

（2）榨菜与紫甘蓝种间嵌合体TTC植株于田间种植，同期播种榨菜籽；

（3）嵌合体TTC植株开花后进行蕾期自交，获得嵌合体的有性自交后代GS1；比较GS1与榨菜性状的差异，确定GS1发生变异的性状；

（4）通过嵌合体与榨菜亲本正反交，获得杂种一代，杂种一代分别自交及与榨菜测交，统计性状遗传规律；

（5）GS1连续多代自交分别获得GS2、GS3，获得与榨菜亲本植物学性状显著差异的新种质GS3。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述激素处理液配方为

2 mg/L的6-苄氨基嘌呤（6-BA）+ l mg/L的α-萘乙酸(α-NAA)，溶剂为水；诱芽培养基配方为MS+0.1 mg/L 6-BA+3.0%蔗糖+0.8%琼脂粉，其pH值为5.8；所用的生根培养基配方为MS+0.1mg/L NAA+3.0%蔗糖+0.8%琼脂粉。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，平周嵌合体TTC命名依据为：大多数双子叶植株茎尖分生组织分为三层：L1-L2-L3，L1-茎尖分生组织最外层；

L2-中间层；L3-最内层；T =榨菜，C =紫甘蓝。

说明书

一种通过榨菜与紫甘蓝种间嵌合体创制榨菜新种质的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种蔬菜作物种质资源创新的新方法，更具体地说，涉及一种通过榨菜与紫甘蓝种间种间嵌合体的有性自交创制榨菜新种质的新方法。

背景技术

[0002] 丰富的种质资源是农作物优良品种选育的重要前提条件之一。常用的种质创新的方法有：辐射诱变、远缘杂交以及转基因技术等方法。然而，这些技术都存在一定的局限性。诱变育种能够产生大量的突变体，但是突变方向不确定，性状表现不一致，加大了新种质筛选的人力物力，增加了难度；远缘杂交不仅存在杂交不亲和性结实率低的问题，而且杂种后代还会出现“杂种不育”、“返亲遗传”、“剧烈分离”等障碍；而转基因技术不仅要依赖繁琐的再生体系，而且转基因的安全问题备受争议，使其很难在短时间广泛应用。

[0003] 近年来，不少研究者发现，农作物之间的嫁接可以诱导植物产生新的变异性状。然而，也有大量的研究结果与生产应用表明不同物种之间的嫁接并不能有效的诱导遗传变异，这在一定程度上阻碍了利用不同物种之间的嫁接来创新植物种质资源这项技术的广泛应用。对于无性嫁接诱导遗传变异的机理有多种解说，目前比较公认的解释是在嫁接植物体中，来自砧木的遗传信号物质能够通过胞间连丝和维管束转移到接穗中并调控接穗的生长发育模式。因此，不同物种细胞之间的遗传信号物质的交流是诱导遗传变异的重要原因之一。

[0004] 常用嫁接一般是采用接穗与砧木的上下嫁接，不同物种细胞只在接穗与砧木嫁接部位相邻。而通过不同物种之间茎尖嫁接形成的嵌合体，可以使不同物种细胞层紧密相邻，遗传信号物质可以进行短距离运输，有利于在不同物种细胞层间进行充分交流。在植物体中，由于其雌雄配子来源于单一细胞层（L2层），因此，L2细胞层与相邻的L1或L3细胞层之间的遗传信号物质的交流可以通过嵌合体的有性自交传递到后代，从而增加了获得具有遗传变异的后代以及具有新性状的种质资源的可能性。然而，到目前为止，对嵌合体材料的有性后代研究尚未见报道。

[0005] 榨菜是我国的特产蔬菜，由于遗传资源比较单一，缺乏有效的优良种质资源。因此，对榨菜种质资源的改良与创新成为了榨菜产业发展的主要任务。因此，在获得榨菜与紫甘蓝嵌合体的基础上，建立一种简单的、快速易行的、有应用的价值的榨菜种质创新的方法成为迫切需要。

[0006] 发明內容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种通过榨菜与紫甘蓝种间嵌合体创制榨菜新种质的方法。

[0007] 为了解决上述技术问题，本发明是通过以下步骤实现的：（1）选取适龄榨菜与紫甘蓝无菌苗，无菌条件下进行离体茎尖嫁接，获得榨菜与紫甘蓝种间周缘嵌合体TTC；
（2）种间嵌合体TTC植株于田间种植，同期对榨菜进行常规播种与田间管理；
（3）嵌合体TTC植株开花后进行蕾期自交，获得嵌合体的有性自交后代GS1；比较GS1与榨菜性状的差异，确定GS1发生变异的性状；
（4）通过嵌合体与榨菜亲本正反交，获得杂种一代，杂种一代分别自交及与榨菜测交，统计性状遗传规律。

[0008] （5）GS1连续多代自交分别获得GS2、GS3；确定发生变异的性状是否能够遗传；获得与榨菜亲本植物学性状显著差异的新种质GS3。

[0009] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用已经建立的榨菜与紫甘蓝种间嵌合体通过常规的有性自交，获得具有显著性状变异的新种质。可以大大缩短创制新种质的周期，节省人力、物力消耗。本发明的方法创新性强，研究意义重大，为榨菜的种植创新与新品种的选育提供了一种崭新的途径。

附图说明

[0010] 图1是榨菜TTT与GS1、GS2、GS3 植物学性状比较图；图2是榨菜TTT与GS3瘤状茎性状比较图。

具体实施方式

[0011] 植物间的无性嫁接可以诱导植物产生新的变异性状。对于无性嫁接诱导遗传变异的机理有多种解说，目前比较公认的解释是在嫁接植物体中，来自砧木的遗传信号物质能够通过胞间连丝和维管束转移到接穗中并调控接穗的生长发育模式。因此，不同物种细胞之间的遗传信号物质的交流是诱导遗传变异的重要原因之一。

[0012] 常用嫁接一般是采用接穗与砧木的上下嫁接，不同物种细胞只在接穗与砧木嫁接部位相邻，不能有效地诱导遗传变异。而通过不同物种之间茎尖嫁接形成的嵌合体，可以使不同物种细胞层紧密相邻，遗传信号物质可以进行短距离运输，有利于在不同物种细胞层间进行充分交流。在植物体中，由于其雌雄配子来源于单一细胞层（L2层），因此，L2细胞层与相邻的L1或L3细胞层之间的遗传信号物质的交流可以通过嵌合体的有性自交传递到后代，从而通过嵌合体的自交增加了获得具有遗传变异的后代以及具有新性状的种质资源的可能性。

[0013] 本发明的通过榨菜与紫甘蓝种间嵌合体创制榨菜新种质的方法主要步骤是：对榨菜与嵌合体进行常规田间管理，生长条件保持一致；对嵌合体植株进行蕾期自交授粉；比较自交后代与榨菜性状的差异。统计性状变异的遗传规律。

[0014] 实施例1本发明的方法具体实施如下：
（1）选取6天苗龄的榨菜与紫甘蓝无菌幼苗，在无菌条件下将它们的一片子叶连同一半的顶端分生组织及部分下胚轴切下，并用激素处理液浸泡，然后取出进行茎尖靠接，插入诱芽培养基中培养诱导嵌合芽的再生；将嵌合芽切下后，于1/2MS培养基培养14天，然后在生根培养基中培养14-21天，从而获得稳定的榨菜与紫甘蓝种间嵌合体TTC；
所用激素处理液配方为2 mg/L的6-苄氨基嘌呤（6-BA）+ l mg/L的α-萘乙酸(α-NAA)，溶剂为水。诱芽培养基配方为MS+0.1 mg/L 6-BA+3.0%蔗糖+0.8%琼脂粉，其pH值为5.8。

[0015] 平周嵌合体TTC命名依据为：大多数双子叶植株茎尖分生组织分为三层：L1-L2-L3，L1-茎尖分生组织最外层；L2-中间层；L3-最内层；T =榨菜，C =紫甘蓝。

[0016] 所用的生根培养基配方为MS+0.1mg/L NAA+3.0%蔗糖+0.8%琼脂粉。

[0017] （2）榨菜与紫甘蓝种间嵌合体TTC植株于田间种植，同期播种榨菜籽；当年十月上旬榨菜亲本播种，十一月上旬移栽田间，同期将嵌合体田间种植。

[0018] （3）嵌合体TTC植株开花后进行蕾期自交，获得嵌合体的有性自交后代GS1；比较GS1与榨菜性状的差异，确定GS1发生变异的性状；次年3月26日嵌合体植株始花期，而榨菜于3月20日始花期。对嵌合体植株及其榨菜亲本进行，单株蕾期自交授粉。用来取花粉的花序在蕾期提前套袋，花粉取自当天开放的花朵；用来接受花粉的花蕾为开花前2天左右的花蕾。

[0019] 自交获得嫁接嵌合体的有性后代，命名为GS1。TTC授粉50朵花，结籽901粒。

[0020] 通过本实施例培养获得的嫁接嵌合体TTC的自交后代（GS1）植物学特性与榨菜亲本相比产生了显著的变异，且群体变异性状表现一致。变异性状主要表现在植株生长势、瘤状茎、叶型（叶片形状差异，无叶片颜色差异）（图1）、表皮毛、茎尖等方面。榨菜亲本生长正常，生长势旺盛，瘤状茎成扁圆状、肉瘤突起明显，叶片为大披针状、半裂、羽状叶脉，无茎尖封顶现象。而GS1植株矮小，生长缓慢，瘤状茎畸形、变小，叶片前缘为全缘，基部深裂至中脉，叶脉呈现发散状，叶面卷曲、较小且厚、表皮毛密度大，茎尖封顶等现象。（表一）表一 GS1与TTT的基本生长参数比较（4）通过嵌合体与榨菜亲本正反交，获得杂种一代，杂种一代分别自交及与榨菜测交，统计性状遗传规律；
对嵌合体植株及其榨菜亲本进行蕾期回交（正反交）授粉，与榨菜亲本进行回交的嵌合体花粉分别取自TTC上的一个花朵，获得有性后代GF1（TTC×TTT）、GF1’（TTT×TTC）。GF1、GF1’性状处于亲本与自交后代之间，并且正反交后代性状差异不显著，因此该变异的遗传受核基因控制。随后以叶型为参照标准，通过GF1自交及测交实验，统计变异性状分离比，GF1与TTT测交后代中呈现TTT与GF1表型的棵数分别为277 、246，分离比为1:1；自交后代呈现TTT、GF1、GS1表型的数量为216、482、235，分离比为1：2：1。

[0021] （5）GS1连续多代自交分别获得GS2、GS3，获得与榨菜亲本植物学性状显著差异的新种质GS3；GS1多代自交，分别获得自交后代GS2、GS3。GS1、GS2播种与田间管理同榨菜，单株蕾期自交授粉。用来取花粉的花序在蕾期提前套袋，花粉取自当天开放的花朵；用来接受花粉的花蕾为开花前2天左右的花蕾。

[0022] 自交后代GS3与GS2、GS1相比，生长势、茎尖封顶趋于正常，瘤状茎畸形变弱，而叶型的变异能够稳定遗传（图1）。其中分别统计了GS1、 GS2、 GS3植株214、251、260棵，茎尖封顶棵数分别为160、29、8。

[0023] 新种质GS3与榨菜植物学性状的差异表现在：叶型、瘤状茎等方面，GS3植株叶片前缘为全缘、瘤状茎肉瘤突起不明显(图2)；另外GS3在抗软腐病方面表现优于榨菜，GS3与榨菜TTT的病情感染指数分别为34.5%、63.6%，感染指数=（∑病级株数x代表数值）/株数总数x发病最重级的代表数值）x 100（表二）。

[0024] 表二 榨菜与GS3抗软腐病统计上表中，感染指数 = (∑（病级株数x代表数值）/株数总数x发病最重级的代表数值) x 100；软腐病分级标准具体如下：0级-全不发病，Ⅰ级-开始发病，尚不显著，Ⅱ级-受害达全株1/3，Ⅲ级-受害达全株1/2，Ⅳ级-受害达全株2/3， Ⅴ级-全株腐烂。

[0025] 榨菜与紫甘蓝种间嫁接嵌合体通过有性自交为榨菜新种质资源的创制提供了一种新方法。

[0026] 嵌合体有性后代与亲本榨菜比较，变异性状表型显著，而且群体表现一致，变异性状能够遗传，叶型变异符合孟德尔遗传规律。

[0027] 通过对GS1与榨菜亲本的抑制性消减杂交（SSH），可以发现GS1与榨菜之间存在着基因表达的显著差异， 在GS1中共获得了262条上调表达和276条下调表达的有效基因序列。这些基因参与了植物生长发育、形态建成、代谢、蛋白质合成等重要途径。嵌合体有性后代与榨菜之间的基因表达差异，为通过嵌合体有性自交创制新种质提供了分子理论基础。

[0028] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。