一种间充质干细胞自体保存液转让专利
申请号 : CN201110352366.1
文献号 : CN102349500A
文献日 : 2012-02-15
发明人 : 申重阳 , 郑榆坤 , 海泉 , 王翔 , 张校通
申请人 : 成都清科生物科技有限公司
摘要 :
本发明公开了一种间充质干细胞自体保护液，由以下体积比的原料物制备而成：自体血小板裂解物，体积比1%~6%；溶液介质，体积比95%~97%；维生素C注射液，体积比0~1%；溶液介质为混合糖电解质注射液或者生理盐水注射液。该间充质干细胞保存液中含有的生长因子能维持细胞的活性状态，维生素C维持各种过氧化物酶的活性，同时混合糖电解质注射液十分适合细胞的保存，渗透压也有利于细胞吸收营养进行新陈代谢活动。间充质干细胞保存在该保存液中8h内细胞活性仍然大于90%，细胞活性变化不大于7%，在12h内间充质干细胞活性仍能维持在85%。本发明不仅满足对人体静脉回输安全的要求，还很好地解决了细胞长时间运输的保存的问题，使更多患者有机会接受间充质干细胞治疗。
权利要求 :
1.一种间充质干细胞自体保护液，其特征在于：由以下体积比的原料物制备而成：自体血小板裂解物 体积比1%~6%；
溶液介质 体积比95%~97%；
维生素C注射液 体积比0~1%；
所述间充质干细胞自体保护液的制备方法为将维生素C注射液加入到溶液介质，再加入自体血小板裂解物，配制成所需间充质干细胞自体保护液；
所述溶液介质为混合糖电解质注射液或者生理盐水注射液。
2.按照权利要求1所述的间充质干细胞自体保护液，其特征在于：由以下体积比的原料物制备而成：自体血小板裂解物 体积比4%；
溶液介质 体积比95%；
维生素C注射液 体积比1%。
3.按照权利要求1所述的间充质干细胞自体保护液，其特征在于：所述溶液介质为混合糖电解质注射液。
4.按照权利要求1所述的间充质干细胞自体保护液，其特征在于：所述自体血小板裂解物由如下方法制备：A、用8ml枸橼酸钠抗凝真空采血管, 分2管一共采取病人16 ml血液；
B、将步骤A采集的血液放入离心机离心，离心速度为1500rpm，离心时间为10min，离心结束后用吸取两真空采血管上部的血浆及靠近界面1mm的红细胞层转移到另一15ml离心管中；
C、将步骤B中离心管放入离心机离心，离心速度为3000rpm，离心时间为8 min，离心结束后吸取离心管上部含有少量未沉降血小板的血浆层至剩余血浆为3ml，立即加入10μl无菌的10%CaCl2溶液颠倒混匀，并在4℃放置8h，离心收集上清液即为自体血小板裂解物，
16ml静脉血可以得到4ml自体血小板裂解物。
5.按照权利要求1至4任一所述的间充质干细胞自体保护液，其特征在于：所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
6.按照权利要求5所述的间充质干细胞自体保存液，其特征在于：所述维生素C的浓度为50mg/ml。
说明书 :
一种间充质干细胞自体保存液
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种间充质干细胞自体保存液。
背景技术
[0002] 间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞广泛存在于全身多种组织中铭刻在体外培养扩增，并能在特定条件下分化成心肌细胞、神经细胞及脂肪细胞等。随着国内外学者对间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，目前已经可以从多种组织中分离出间充质干细胞。间充质干细胞具有支持造血和调节免疫等作用，在造血重建、组织修复、免疫治疗等方面具有广阔的临床应用前景。
[0003] 干细胞在运输过程需要保持是活性，但因为其要直接回输给患者所以保存液要能适用于静脉回输因此需要即能保护细胞活性，又对人体静脉回输安全的保存液。现有的干细胞保存液以0.9%氯化钠注射液为主，另外改进的还有葡萄糖氯化钠注射液等为主，这些保护液对人体静脉回输是安全的，但是因为渗透压等原因干细胞大量死亡，细胞经长时间运输后细胞活率很低，直接影响临床效果。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种间充质干细胞自体保存液，不仅满足对人体静脉回输安全的要求，还要提高间充质干经长时间运输后细胞活率。
[0005] 为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：提供一种间充质干细胞自体保护液，其特征在于：由以下体积比的原料物制备而成：自体血小板裂解物 体积比1%~6%；
溶液介质 体积比95%~97%；
维生素C注射液 体积比0~1%；
所述间充质干细胞自体保护液的制备方法为将维生素C注射液加入到溶液介质，再加入自体血小板裂解物，配制成所需间充质干细胞自体保护液；
所述溶液介质为混合糖电解质注射液或者生理盐水注射液。
溶液介质 体积比95%~97%；
维生素C注射液 体积比0~1%；
所述间充质干细胞自体保护液的制备方法为将维生素C注射液加入到溶液介质，再加入自体血小板裂解物，配制成所需间充质干细胞自体保护液；
所述溶液介质为混合糖电解质注射液或者生理盐水注射液。
[0006] 上述间充质干细胞自体保存液的优选配方为：自体血小板裂解物 体积比4%；
溶液介质 体积比95%；
维生素C注射液 体积比1%。
溶液介质 体积比95%；
维生素C注射液 体积比1%。
[0007] 所述溶液介质优选为混合糖电解质注射液。
[0008] 所述自体血小板裂解物由如下方法制备：A、用8ml枸橼酸钠抗凝真空采血管, 分2管一共采取病人16 ml血液；
B、将步骤A采集的血液放入离心机离心，离心速度为1500rpm，离心时间为10min，离心结束后用吸取两真空采血管上部的血浆及靠近界面1mm的红细胞层转移到另一15ml离心管中；
C、将步骤B中离心管放入离心机离心，离心速度为3000rpm，离心时间为8 min，离心结束后吸取离心管上部含有少量未沉降血小板的血浆层至剩余血浆为3ml，立即加入10μl无菌的10%CaCl2溶液颠倒混匀，并在4℃放置8h，离心收集上清液即为自体血小板裂解物，
16ml静脉血可以得到4ml自体血小板裂解物。
B、将步骤A采集的血液放入离心机离心，离心速度为1500rpm，离心时间为10min，离心结束后用吸取两真空采血管上部的血浆及靠近界面1mm的红细胞层转移到另一15ml离心管中；
C、将步骤B中离心管放入离心机离心，离心速度为3000rpm，离心时间为8 min，离心结束后吸取离心管上部含有少量未沉降血小板的血浆层至剩余血浆为3ml，立即加入10μl无菌的10%CaCl2溶液颠倒混匀，并在4℃放置8h，离心收集上清液即为自体血小板裂解物，
16ml静脉血可以得到4ml自体血小板裂解物。
[0009] 所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
[0010] 所述维生素C的浓度为50mg/ml。
[0011] 自体血小板裂解物是从病人自身血液中提取分离得到的，其中含有血小板衍生生长因子、转化生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮细胞生长因子。这些因子共同作用可以提供给细胞一个更加适应的生存环境。
[0012] 混合糖电解质注射液为新海能混合糖电解质注射液；混合糖电解质注射液作为干细胞保存液的基液，既可以补充细胞内液也可以补充细胞外液，所含的缓冲盐很好地维持了酸碱平衡。
[0013] 维生素C浓度为50mg/ml，维生素C的加入可以帮助细胞维持各种过氧化物酶的活性，防止氧自由基对细胞膜和细胞器造成的损伤，对较长时间保存的情况下维持细胞活性起到关键作用。
[0014] 本发明提供的间充质干细胞自体保存液利用患者自体血小板裂解物和维生素C加入混合糖电解质注射液中制成。该间充质干细胞保存液中含有的生长因子能维持细胞的活性状态，维生素C维持各种过氧化物酶的活性，同时混合糖电解质注射液十分适合细胞的保存，渗透压也有利于细胞吸收营养进行新陈代谢活动。间充质干细胞保存在该保存液中8h内细胞活性仍然大于90%，细胞活性变化不大于7%，在12h内间充质干细胞活性仍能维持在85%。本发明不仅满足对人体静脉回输安全的要求，还很好地解决了细胞长时间运输的保存的问题，使更多的患者可以有机会接受到间充质干细胞治疗。
具体实施方式
[0015] 下面结合实施例对本发明做详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限定。
[0016] 实施例一：保存液1： 自体血小板裂解物 体积比4%；
混合糖电解质注射液 体积比95%；
维生素C注射液 体积比1%；
保存液2： 自体血小板裂解物 体积比4%；
生理盐水注射液 体积比95%；
维生素C注射液 体积比1%；
1.1 操作步骤：
1.1.1将自体血小板裂解物、混合糖电解质注射液、维生素C按上述比例配制出保存液
1；将自体血小板裂解物、生理盐水注射液、维生素C注射液按上述比例配制出保存液2；
1.1.2分别用保存液1和保存液2配制脂肪间充质干细胞悬液，装入2ml冻存管中，其
6
中脂肪间充质干细胞数量为3×10/ml；各配制9管，3管为一组，设置6组分别在4℃保存
8h、12h、24h；
1.1.3用Invitrogen公司全自动细胞计数仪Countess进行细胞计数。每组结果取平均值如表1所述。
混合糖电解质注射液 体积比95%；
维生素C注射液 体积比1%；
保存液2： 自体血小板裂解物 体积比4%；
生理盐水注射液 体积比95%；
维生素C注射液 体积比1%；
1.1 操作步骤：
1.1.1将自体血小板裂解物、混合糖电解质注射液、维生素C按上述比例配制出保存液
1；将自体血小板裂解物、生理盐水注射液、维生素C注射液按上述比例配制出保存液2；
1.1.2分别用保存液1和保存液2配制脂肪间充质干细胞悬液，装入2ml冻存管中，其
6
中脂肪间充质干细胞数量为3×10/ml；各配制9管，3管为一组，设置6组分别在4℃保存
8h、12h、24h；
1.1.3用Invitrogen公司全自动细胞计数仪Countess进行细胞计数。每组结果取平均值如表1所述。
[0017] 表1：脂肪间充质干细胞在保存液1和保存液2中细胞活率随时间变化的检测结果保存液1 保存液2
0h 97.7% 97.7%
8h 94.2% 61.8%
12h85.8% 44.3%
24h77.5% 14.2%
从表1中可以看出，由混合糖混合糖电解质注射液作为溶液介质制备的保存液，大大提高了脂肪间充质干细胞的存活率。
0h 97.7% 97.7%
8h 94.2% 61.8%
12h85.8% 44.3%
24h77.5% 14.2%
从表1中可以看出，由混合糖混合糖电解质注射液作为溶液介质制备的保存液，大大提高了脂肪间充质干细胞的存活率。
[0018] 实施例二：2.1 操作步骤：
2.1.1 将体积比为1%、2%、3%、4%、5%、6%的自体血小板裂解物和体积比为1%的维生素C注射液及剩余为混合糖电解质注射液配制成保存液；
2.1.2分别用不同体积比自体血小板裂解物的保存液配制脂肪间充质干细胞悬液，装
6
入2ml冻存管中，其中脂肪间充质干细胞数量为3×10/ml；各配制6管，3管为一组，设置
12组分别在4℃保存8h、12h；
2.1.3 用Invitrogen公司全自动细胞计数仪Countess进行细胞计数。每组结果取平均值如表2所述。
2.1.1 将体积比为1%、2%、3%、4%、5%、6%的自体血小板裂解物和体积比为1%的维生素C注射液及剩余为混合糖电解质注射液配制成保存液；
2.1.2分别用不同体积比自体血小板裂解物的保存液配制脂肪间充质干细胞悬液，装
6
入2ml冻存管中，其中脂肪间充质干细胞数量为3×10/ml；各配制6管，3管为一组，设置
12组分别在4℃保存8h、12h；
2.1.3 用Invitrogen公司全自动细胞计数仪Countess进行细胞计数。每组结果取平均值如表2所述。
[0019] 表2：脂肪间充质干细胞在不同体积比自体血小板裂解物的保存液中随时间变化的检测结果从表2中可以看出，随着自体血小板裂解物在保存液中体积比的增大，脂肪间充质干细胞活率的变化是增大的，峰值出现在自体血小板裂解物在保存液中体积比为4%时，继续增加自体血小板裂解物在保存液中体积比例不能显著性提高细胞活率，考虑抽血量因素，自体血小板裂解物在保存液中体积比4%最为合适。
[0020] 实施例三：保存液3： 自体血小板裂解物 体积比4%；
混合糖电解质注射液 体积比95%；
混合糖电解质注射液 体积比95%；