一种积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物及其制备方法、定量分析方法和应用

摘要

本发明涉及一种积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物，该组合物主要由乌索烷型的积雪草酸单葡萄糖苷、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和齐墩果烷型的切布苷II组成，其中积雪草酸单葡萄糖苷、羟基积雪草酸单葡萄糖苷、切布苷II的质量比为1∶0.5～2∶0.1～1，且三者质量百分含量之和不小于50％。该组合物是以积雪草提取物为底物，经β-葡萄糖苷酶水解或能产生β-葡萄糖苷酶的微生物发酵水解，再经过正丁醇萃取或大孔吸附树脂分离纯化得到。本发明还提供了一种定量分析方法，即利用添加适量β-环糊精的流动相进行三种组分的HPLC定量分析。该组合物经药效学研究证明，具有显著地抑制肿瘤细胞和成纤维细胞的活性，可以用于肿瘤和疤痕增生的治疗。

权利要求

1.一种积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物，其特征在于，该组合物主要由乌索烷型的积雪草酸单葡萄糖苷、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和齐墩果烷型的切布苷II组成。

2.权利要求1所述的组合物，其特征在于，积雪草酸单葡萄糖苷、羟基积雪草酸单葡萄糖苷、切布苷II的质量比为1∶0.5～2∶0.1～1，三者在组合物中质量百分比之和不小于50％。

3.权利要求2所述的组合物，其特征在于，积雪草酸单葡萄糖苷、羟基积雪草酸单葡萄糖苷、切布苷II的质量比为1∶0.7～1.5∶0.3～0.8，三者在组合物中质量百分比之和不小于80％。

4.权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在积雪草提取物的水溶液中加入积雪草提取物重量0.1～50％的β-葡萄糖苷酶或固载的β-葡萄糖苷酶，20～60℃水解0.5～72小时；或者加入微生物培养基，灭菌处理，接种能产生β葡萄糖苷酶的微生物，20～45℃发酵2～8天；反应体系中积雪草提取物的质量浓度为0.1～20％；

(2)过滤或离心分离得到含积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物的发酵液或酶解液；

(3)将所含积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物的酶解液或酵解液进行分离纯化，包括以下步骤：a、将酶解液浓缩至体积与积雪草提取物重量比例为1～5L/kg，用1～10倍体积水饱和正丁醇分1～3次萃取，合并所得正丁醇相，即得组合物的正丁醇萃取液；或将酶解液上大孔吸附树脂柱吸附，3～5倍柱床体积水洗除去杂质，2～5倍柱床体积20～80％体积浓度乙醇或甲醇水溶液洗脱，得醇洗脱液；

b、将正丁醇萃取液或醇洗脱液减压浓缩、真空干燥，即得组合物。

5.权利要求4所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述的积雪草提取物选自积雪草总苷、积雪草醇提取物、积雪草水提取物或积雪草醇水混合溶液提取物。

6.权利要求4所述的组合物的制备方法，其特征在于，酶解液在上大孔吸附柱吸附前有一预处理步骤：减压浓缩至固形物重量百分含量为1-30％；

或，减压浓缩至固形物重量百分含量为30-60％，加入3-4倍体积95％乙醇沉淀，过滤或离心分离沉淀，上清液浓缩除去乙醇，加水稀释至固形物重量百分含量为1-30％。

7.权利要求4所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述的β-葡萄糖苷酶为主要水解断裂β-1，6糖苷键的β-葡萄糖苷酶。

8.权利要求4所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述的能产生β葡萄糖苷酶的微生物选自青霉属真菌、曲霉属真菌、木霉属真菌、酵母属真菌、芽孢杆菌属细菌或乳酸菌属细菌。

9.权利要求4所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述的能产生β葡萄糖苷酶的微生物选自拟青霉、扩展青霉、桔青霉、米曲霉、灰绿曲霉、黑曲霉、李氏木霉、康氏木霉、绿色木霉、啤酒酵母、面包酵母、多粘性芽孢杆菌或乳酸菌。

10.权利要求1所述所述组合物在制备疤痕治疗药物或肿瘤疾病治疗药物中的应用。

11.权利要求1所述组合物与医药学上可接受的辅料配合制成的口服制剂、注射剂或皮肤外用制剂。

12.权利要求1所述组合物的HPLC定量分析方法，其特征在于，HPLC流动相由β-环糊精、水以及甲醇和乙腈中的至少一种组成。

13.权利要求12所述组合物的HPLC定量分析方法，其特征在于，HPLC流动相为含

0.1～1mmol/Lβ-环糊精的水溶液，且含有体积百分比为15％～50％甲醇或乙腈，或者含有体积百分比为15％～50％甲醇和乙腈。

说明书

一种积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物及其制备方法、定量

分析方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属中药领域，涉及一种积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物。另外，本发明还提供了一种生物转化积雪草提取物制备积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物的制备方法及其组合物的定量分析方法和用途。

背景技术

[0002] 积雪草(Centella asiatica(L.)Urb)又称落得打、崩大碗、半边钱，为伞形科积雪草属植物，其始载于《神农本草经》，列为中品。其性寒，味苦、辛，具有清热利湿、解毒消肿之功效，主要用于湿热黄疸，中暑腹泻，砂淋血淋，痈肿疮毒，跌打损伤。积雪草是民间广东地区常用中草药，利用积雪草外用及内服治病在我国已有两千多年历史。现代研究表明，积雪草具有抗菌消炎、抗抑郁、抗肿瘤、促进创伤愈合和治疗增生性瘢痕的作用，积雪草提取物对硬皮病及烧伤瘢痕等纤维化疾病有明显的疗效，能有效地促进伤口愈合。积雪草通过增加角质化细胞中MCP-1的表达从而促进VEGF的生成，同时促进MCP-1巨噬细胞生成IL-1β，提高烧伤处血管的生成而达到治疗烧伤的目的。

[0003] 积雪草富含乌索烷型和齐墩果烷型两类五环三萜皂苷，其中主要成分为积雪草苷(asiaticoside)、羟基积雪草苷(madecassoside)和积雪草苷B(asiaticoside B)。目前已经分离到的五环三萜成分的结构式如下：

[0004]

[0005] A乌索烷型

[0006] 1.积雪草酸(asiatic acid)：R1＝H，R2＝H

[0007] 2.羟基积雪草酸(6β-hydroxyasiatic acid)：R1＝OH，R2＝H

[0008] 3.积雪草苷(asiaticoside)：R1＝H，R2＝Trisaccharide unit

[0009]

[0010] 4.羟基积雪草苷(madecassoside)：R1＝OH，R2＝Trisaccharide unit [0011] 5.积雪草二糖苷(asiaticodiglycoside)：R1＝H，

[0012]

[0013] 6.羟基积雪草二糖苷(centellasaponin B)：R1＝OH，

[0014]

[0015] 7.积雪草酸单葡萄糖苷(asiatic acid-28-O-β-D glucopyranoside)：R1＝H，R2＝β-D-glucopyranosyl

[0016] 8. 羟 基 积 雪 草 酸 单 葡 萄 糖 苷 (centelloside C)：R1 ＝ OH，R2 ＝β-D-glucopyranosyl

[0017]

[0018] B齐墩果烷型

[0019] 1.Terminolic acid：R1＝OH，R2＝H

[0020] 2.积雪草苷B(asiaticoside B)：R1＝OH，R2＝Trisaccharide unit [0021]

[0022] 3.scheffoleoside A：R1＝H，R2＝Trisaccharide unit

[0023] 4.centellasaponin B：R1＝OH，

[0024] 5.切布苷II(chebuloside II)：R1＝OH，R2＝glucopyranosyl

[0025] 迄今为止还未见有积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物及其制备工艺研究、质量标准研究和用途的报道。

发明内容

[0026] 本发明旨在采用现代制药工艺，提供一种具有抗癌作用和能够抑制瘢痕成纤维细胞活力的积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物。

[0027] 该组合物中，积雪草酸单葡萄糖苷、羟基积雪草酸单葡萄糖苷、切布苷II的质量比为1∶0.5～2∶0.1～1，三者在组合物中质量百分比之和不小于50％，优选积雪草酸单葡萄糖苷、羟基积雪草酸单葡萄糖苷、切布苷II的质量比为1∶0.7～1.5∶0.3～0.8，三者在组合物中质量百分比之和不小于80％。

[0028] 本发明的另一目的在于提供一种积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物的制备方法。 [0029] 上述积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物的制备方法，以积雪草提取物为原料，用β-葡萄糖苷酶或能产生β-葡萄糖苷酶的微生物来生物转化制备积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物，其反应原理是β-葡萄糖苷酶水解乌索烷型和齐墩果烷型积雪草三萜酸二和/或三葡萄糖苷28位上两个葡萄糖之间的(1→6)-β-D-葡萄糖苷键，生成积雪草三萜酸单葡萄糖苷，反应式如下：

[0030]

[0031]

[0032] R为2α，3β，23α-三羟基乌苏-12-烯-28-酸基，或2α，3β，6β，23α-四羟基乌苏-12-烯-28-酸基，或2α，3β，6β-三羟基乌苏-12-烯-28-酸基，或2α，3β，23α-三羟基齐 墩果-12-烯-28-酸基，或2α，3β，6β，23α-四羟基齐 墩果-12-烯-28-酸基，或3β，6β，23α-三羟基齐墩果-12-烯-28-酸基，或2α，3β，
23α-三羟基齐墩果-13-烯-28-酸基。

[0033] 本发明的组合物采用生物转化方法提取，具体包括以下步骤：

[0034] (1)在积雪草提取物的水溶液中加入积雪草提取物重量0.1～50％的β-葡萄糖苷酶或固载的β-葡萄糖苷酶，20～60℃水解0.5～72小时；或者加入微生物培养基，灭菌处理，接种能产生β葡萄糖苷酶的微生物，20～45℃发酵2～8天；反应体系中积雪草提取物的质量浓度为0.1～20％；

[0035] (2)过滤或离心分离得到含积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物的发酵液或酶解液； [0036] (3)将所含积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物的酶解液或酵解液进行分离纯化。 [0037] 上述的β-葡萄糖苷酶来源于植物或微生物，能水解β-1，2、1，3、1，4和1，6糖苷键，如苦杏仁酶，优选来源于真菌的主要水解断裂β-1，6糖苷键的β-葡萄糖苷酶。 [0038] 上述的能产生β葡萄糖苷酶的微生物选自青霉属真菌、曲霉属真菌、木霉属真菌、酵母属真菌、芽孢杆菌属细菌或乳酸菌属细菌，如拟青霉、扩展青霉、桔青霉、米曲霉、灰绿曲霉、黑曲霉、李氏木霉、康氏木霉、绿色木霉、酿酒酵母、面包酵母、多粘性芽孢杆菌或乳酸菌，优选使用主要产生β-1，6葡萄糖苷酶的拟青霉、扩展青霉、桔青霉等青霉属真菌。 [0039] 上述方法中，所述的积雪草提取物选自积雪草总苷、积雪草醇提取物、积雪草水提取物或积雪草醇水混合溶液提取物。

[0040] 上述方法中，对积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物的酶解液或发酵液进行分离纯化具体可采用如下方法：

[0041] 正丁醇萃取法：

[0042] (1)将酶解液或发酵液浓缩至体积与积雪草提取物重量比例为1～5L/kg，用1～10倍体积水饱和正丁醇分1～3次萃取，合并所得正丁醇相，即得组合物的正丁醇萃取液； [0043] (2)将正丁醇萃取液减压浓缩，真空干燥，粉碎，即得组合物；

[0044] 或者，大孔吸附树脂法：

[0045] (1)将酶解液或发酵液上大孔吸附树脂柱吸附，3-5倍柱床体积水洗除去杂质，2-5倍柱床体积20-80％体积浓度乙醇或甲醇水溶液洗脱，得醇洗脱液；

[0046] (2)将醇洗脱液减压浓缩，真空干燥，粉碎，即得组合物。

[0047] 上述大孔吸附树脂法中，将酶解液或发酵液上大孔吸附树脂柱吸附前，可以有一预处理步骤：将酶解液或发酵液减压浓缩至固形物重量百分含量为1-30％；或减压浓缩至固形物重量百分含量为30-60％，加入3-4倍体积95％乙醇沉淀，过滤或离心分离沉淀，上清液浓缩除去乙醇，加水稀释至固形物重量百分含量为1-30％。

[0048] 本发明的组合物经药效学研究证明，具有显著地抑制肿瘤细胞和成纤维细胞的活性作用，可以用于肿瘤和疤痕增生的治疗。该组合物可与医药学上可接受的辅料配合使用，制成胶囊、片剂、颗粒剂、粉剂和口服液等口服制剂；水针、粉针或大输液等注射剂；或凝胶剂、软膏剂、乳剂或醑剂等皮肤外用制剂等产品。

[0049] 用本发明的组合物进行抑制人肝癌细胞株生长的实验研究，实验结果显a示：当达到一定浓度时，积雪草三萜酸单葡萄糖苷溶液对HepG2细胞增殖有显著抑制作用。 [0050] 用本发明的组合物进行抑制瘢痕成纤维细胞株生长的实验，实验结果显示：当达到一定浓度时，积雪草三萜酸单葡萄糖苷溶液对瘢痕成纤维细胞活力具有显著抑制作用。 [0051] 另外，本发明还提供一种积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物及其制剂产品的定量分析方法，采用HPLC进行积雪草酸单葡萄糖苷、羟基积雪草酸单葡萄糖苷和切布苷II三种组分的定量分析，其中的流动相由β-环糊精、水、甲醇或/和乙腈组成。流动相优选含0.1～1mmol/Lβ-环糊精，且体积百分比为15～50％甲醇或/和乙腈的水溶液。

附图说明

[0052] 图1为实施例4所得积雪草三萜酸单葡萄糖苷HPLC图谱。

[0053] 图2为切布苷II对照品HPLC图谱。

[0054] 图3为羟基积雪草酸单葡萄糖苷对照品HPLC图谱。

[0055] 图4为积雪草酸单葡萄糖苷对照品HPLC图谱。

具体实施方式

[0056] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。

[0057] 实施例1

[0058] (1)称取1kg积雪草水提取物，加水至5kg；

[0059] (2)加入1g的黑曲霉β-葡萄糖苷酶，40℃水解72小时；

[0060] (3)过滤分离酶解液，减压浓缩至2L，用6L水饱和正丁醇分1次萃取，得正丁醇萃取液；将正丁醇萃取液减压浓缩、真空干燥，即得积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物。 [0061] 采用含0.1mmol/Lβ-环糊精，且体积百分比为15％乙腈的水溶液作流动相进行HPLC测定，结果组合物中切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷、积雪草酸单葡萄糖苷的质量百分含量分别为14.8％、23.5％、26.4％，三者质量百分含量之和为64.7％。 [0062] 实施例2

[0063] (1)称取1kg积雪草醇提取物，加水至40Lkg；

[0064] (2)加入50g苦杏仁酶，20℃水解24小时；

[0065] (3)离心分离酶解液，减压浓缩至4L，用4L水饱和正丁醇分3次萃取，得正丁醇萃取液；将正丁醇萃取液减压浓缩、真空干燥，即得积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物。 [0066] 采用含1.0mmol/Lβ-环糊精，且体积百分比为50％乙腈的水溶液作流动相进行HPLC测定，结果组合物中切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷、积雪草酸单葡萄糖苷的质量百分含量分别为18.2％、28.1％、27.4％，三者质量百分含量之和为73.7％。 [0067] 实施例3

[0068] (1)称取1kg积雪草总皂苷，加水至1000kg，

[0069] (2)加入0.5kg的扩展青霉β-葡萄糖苷酶，60℃水解0.5小时，

[0070] (3)过滤分离酶解液，上10L型号为D101的大孔树脂柱吸附，水洗去除杂质，用40L 60％体积浓度乙醇溶液洗脱，得乙醇洗脱液。将乙醇洗脱液减压浓缩、真空干燥，即得积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物。

[0071] 采用含0.4mmol/Lβ-环糊精，且体积百分比为30％甲醇的水溶液作流动相进行HPLC测定，结果组合物中切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷、积雪草酸单葡萄糖苷的质量百分含量分别为22.0％、31.5％、29.7％，三者质量百分含量之和为83.2％。 [0072] 实施例4

[0073] (1)称取1kg积雪草醇水提取物，加入10kg葡萄糖、10kg淀粉、10kg黄豆饼粉，加水至1000kg，121℃灭菌30分钟，

[0074] (2)接入李氏木霉，20℃发酵8天，

[0075] (3)过滤分离发酵液，减压浓缩至约5L，上10L型号为HPD100型大孔吸附柱吸附，水洗去除杂质，用20L 80％体积浓度乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物。采用含0.4mmol/Lβ-环糊精，且体积百分比为28％乙腈的水溶液作流动相进行HPLC测定，图1所示为本实施例的HPLC图谱，根据与图2、图3和图4的对比，峰1为切布苷II，峰2为羟基积雪草酸单葡萄糖苷，峰3为积雪草酸单葡萄糖苷，结果显示组合物中切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷、积雪草酸单葡萄糖苷的质量百分含量分别为21.0％、32.7％、27.3％，三者质量百分含量之和为81.0％。 [0076] 实施例5

[0077] (1)称取1kg积雪草总皂苷，加入1kg葡萄糖、1kg淀粉、0.5kg黄豆饼粉，加水至50kg，121℃灭菌30分钟；

[0078] (2)接入面包酵母，28℃发酵5天；

[0079] (3)离心分离发酵液，进行预处理：减压浓缩至约3L，加入10L95％乙醇沉淀，过滤或离心分离，上清液浓缩除去乙醇，加水稀释至10L；

[0080] (4)预处理完成后上10L型号为HPD700型大孔吸附柱吸附，水洗去除杂质，用50L20％体积浓度乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、真空干燥，即得积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物。

[0081] 采用含0.5mmol/Lβ-环糊精，且体积百分比为10％甲醇和20％乙腈的水溶液作流动相进行HPLC测定，结果组合物中切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷、积雪草酸单葡萄糖苷的质量百分含量分别为22.2％、33.8％、29.5％，三者质量百分含量之和为85.5％。 [0082] 实施例6

[0083] (1)称取1kg积雪草总皂苷，加入50g葡萄糖、50g酵母膏、牛肉膏50g、黄豆饼粉100g，加水至5kg，121℃灭菌15分钟；

[0084] (2)接入乳酸菌，45℃发酵2天；

[0085] (3)离心分离发酵液，减压浓缩至约1L，用2L水饱和正丁醇分2次萃取，得正丁醇萃取液；将正丁醇萃取液减压浓缩、真空干燥，即得积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物。 [0086] 采用含0.4mmol/Lβ-环糊精，且体积百分比为28％乙腈的水溶液作流动相进行HPLC测定，结果组合物中切布苷II、羟基积雪草酸单葡萄糖苷、积雪草酸单葡萄糖苷的质量百分含量分别为21.6％、31.1％、30.1％，三者质量百分含量之和为82.7％。 [0087] 实施例7积雪草三萜酸单葡萄糖苷片剂的制备

[0088] 称取实施例4制备得到的积雪草三萜酸单葡萄糖苷1kg、淀粉0.3kg、微晶纤维素0.2kg，混匀，用10％淀粉浆湿法制粒，干燥，加硬脂酸镁8g，总混，压片，即得积雪草三萜酸单葡萄糖苷片。

[0089] 实施例8积雪草三萜酸单葡萄糖苷水针剂的制备

[0090] 称取实施例1制备得到的积雪草三萜酸单葡萄糖苷纯品1kg，注射用水加至10L，搅拌溶解，过滤，灭菌，分装，即得积雪草三萜酸单葡萄糖苷水针剂。

[0091] 实施例9积雪草三萜酸单葡萄糖苷软膏剂的制备

[0092] 取硬脂酸15kg、凡士林10kg、甘油单硬脂酸酯3kg，加热并搅拌均匀，即为油相；另取实施例5制备得到的积雪草三萜酸单葡萄糖苷1kg、氢氧化钠0.5kg、甘油10kg、尼泊金乙酯0.1kg、蒸馏水60.4kg，搅拌溶解，即为水相。水相加热至50℃，将油相慢慢倒入水相中，边倒边搅拌，搅拌均匀，即得积雪草三萜酸单葡萄糖苷软膏剂。

[0093] 实施例10积雪草三萜酸单葡萄糖苷凝胶剂的制备

[0094] 取卡波姆-940 1kg，加入蒸馏水浸泡，搅拌使其溶胀成均匀糊状，再分别加入尼泊金乙酯25g，吐温-80 0.5kg，滴加三乙醇胺调节pH至6.0～8.0(作为空白基质备用)；另取实施例6制备得到的积雪草三萜酸单葡萄糖苷1kg，加入PEG-600 2.5kg、甘油2.5kg，搅拌使其溶解后加入空白基质中，加水至50L，搅拌均匀，即得。

[0095] 实施例11积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物抑制人肝癌细胞株生长的实验研究 [0096] 1材料与仪器

[0097] 1.1实验材料

[0098] HepG2(人肝癌细胞株)由复旦大学提供；积雪草三萜酸单葡萄糖苷(按实施例3方法制备，纯度大于80％)；MEM培养基(Gibco公司产品，美国)；小牛血清(杭州四季青生物工程公司产品)；MTT(Amresco公司产品，美国)；其余未特殊注明的试剂均为进口或国产分析纯。

[0099] 1.2主要仪器

[0100] Spectra Max 190酶标仪(Molec-ular device，美国)；细胞培养箱(SHELLAB，美国)。

[0101] 2实验方法

[0102] 2.1细胞培养

[0103] HepG2细胞用含10％小牛血清的MEM培养基培养。将细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，2～3d传代1次。

[0104] 2.2MTT法测细胞存活率

[0105] 4×104ml-1细胞100μl接种于96孔细胞培养板中培养24h，加不同浓度积雪草三萜酸单葡萄糖苷处理24h，弃去培养基，每孔加100μl MTT(D-hank’S液溶解，浓度为1g/L)，37℃继续孵育4h后，吸去培养液，每孔加DMSO 100μl，待结晶物充分溶解，1h后用酶标仪于570nm处测光密度。结果用抑制率表示，计算公式如下：抑制率＝(对照组平均D570-给药组平均D570)/(对照组平均D570-空白组平均D570)×100％

[0106] 3结果

[0107] 3.1羟基积雪草酸单葡萄糖苷抑制肿瘤细胞增殖

[0108] HepG2细胞经终浓度分别为10，20，30，40μmol/L的积雪草三萜酸单葡萄糖苷溶液处理后，细胞生长受到抑制，细胞形态改变，如突起消失，胞体皱缩变圆等。与对照组比较，低浓度积雪草三萜酸单葡萄糖苷(20μmol/L)组对HepG2细胞的生长没有明显影响；当剂量达到40μmol/L时，积雪草三萜酸单葡萄糖苷对HepG2细胞增殖有显著抑制作用，抑制率达81％，由此积雪草三萜酸单葡萄糖苷在HepG2细胞株上的Ic50值为26μmol/L。 [0109] 表1羟基积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物对人肝癌细胞株(HepG2)和子宫颈癌细胞株(Hela)的抑制作用(抑制率：％)

[0110]剂量(μg/ml) 10 20 40 80 100 IC50
Hela -7.17±4.45 1.33±8.41 13.07±19.35 32.26±2.46 33.15±5.15 142
HepG2 -5.58±9.28 -4.21±12.49 35.89±11.46 70.13±1.37 71.85±0.59 58[0111] 实施例12积雪草三萜酸单葡萄糖苷组合物抑制瘢痕成纤维细胞株生长的实验研究

[0112] 1材料与仪器

[0113] 1.1材料

[0114] 瘢痕成纤维细胞取材于瘢痕疙瘩病人皮肤的瘢痕组织；积雪草三萜酸单葡萄糖苷(按实施例3方法制备，纯度大于80％)；DMEM培养基(Hyclone公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)(Sigma公司)。

[0115] 1.2仪器

[0116] CO2细胞培养箱(德国Heraeus)；酶标仪(芬兰Wellscan MK3型)；倒置显微镜(德国MPS30型)。

[0117] 2方法

[0118] 2.1药物配制

[0119] 积雪草三萜酸单葡萄糖苷溶液：积雪草三萜酸单葡萄糖苷加入少量培养液，充分溶解后0.45μm滤膜过滤除菌，用培养液稀释至0.125、0.25、0.50、1.00、2.00mg/mL。 [0120] 2.2瘢痕成纤维细胞培养

[0121] 无菌条件下手术切取瘢痕真皮层组织块约0.5-1mm，接种于含DMEM培养液的培养瓶中，实验选取处于对数生长期的第4-7代。

[0122] 2.3瘢痕成纤维细胞形态学观察

[0123] 消化单层培养细胞，以每孔l×104个接种于96孔培养板中，留1孔仅加培养液作为空白孔。待细胞贴壁后吸出原液，设立对照组与实验组，每个样本均设4个复孔。对照组换液，每孔加含血清的培养液100L，实验组加入含不同浓度的药物溶液各100μL，移入恒温箱内继续培养，分别于24h、48h、72h在倒置显微镜下观察并摄像。

[0124] 2.4MTT比色法观测瘢痕成纤维细胞活力

[0125] 以上96孔板的细胞分别于固定的3个时间段摄像后，每孔即加入MTF20μL(空白孔不加)，放回恒温箱继续培养4.5h。取出培养板，吸除孔内的液体，每孔加入150μL的二甲基亚砜(DMSO)，振荡5min使结晶充分溶解。以空白孔调零，在酶标仪上检测波长为490nm的吸光值(A值)，计算药物作用于成纤维细胞活力后的抑制率。

[0126] 抑制率＝(空白对照组A490值-试验药物组A490值)/空白对照组A490值×100％ [0127] 3结果

[0128] 3.1瘢痕成纤维细胞形态学变化

[0129] 3.1.1空白对照组

[0130] 镜下可见外形狭长、胞核呈梭形、走向趋于一致的细胞，多呈平行排列并有一定弧度。细胞中央有圆形或卵圆形核，部分细胞可见向外伸出2-3个长短不一的突起，为成纤维细胞。随着培养时间的增加，细胞数量增多，细胞间隙变窄，呈条索状分布。 [0131] 3.1.2积雪草三萜酸单葡萄糖苷实验组

[0132] 当药物浓度为0.50mg/mL时，12h后细胞就变短，出现少许脱壁、漂浮的细胞。在24h、48h、72h这3个时间段内，随着培养时间的增加，贴壁细胞数量进一步减少，细胞间隙变大。72h后培养液中成形的细胞少见。

[0133] 3.2MTT法测定瘢痕成纤维细胞活力的变化

[0134] 根据积雪草三萜酸单葡萄糖苷对瘢痕成纤维细胞活力测定结果，分别计算对瘢痕成纤维细胞的抑制率，见表2。由此可见，积雪草三萜酸单葡萄糖苷对瘢痕成纤维细胞活力具有显著抑制作用。

[0135] 表2积雪草三萜酸单葡萄糖苷对瘢痕成纤维细胞活力的抑制作用(抑制率：％) [0136] 。