生血丸在制备预防低剂量电离辐射致细胞损伤药物中的应用

摘要

本发明公开了生血丸在制备预防或修复低剂量电离辐射致骨髓细胞损伤药物中的应用；其中所述的预防或修复骨髓细胞损伤指的是：抑制癌前细胞的增殖。所述的预防和修复指的是：对低剂量辐照带来的染色体断裂加以修复。本发明从血液淋巴细胞、骨髓微核率的变化；自由基的清除能力；癌前细胞增殖的抑制等方面，检验生血丸抗环境污染致畸的功效，为生血丸的临床应用开辟更广阔的前景。

权利要求

1.生血丸在制备预防或修复低剂量电离辐射致骨髓细胞损伤药物中的应用；其中所述的预防或修复骨髓细胞损伤指的是：抑制癌前细胞的增殖。

2.生血丸在制备提前预防低剂量电离辐射致白血病、多脏器肿瘤发生药物中的应用。

3.生血丸在制备早期修复低剂量电离辐射致白血病、多脏器肿瘤发生药物中的应用。

4.权利要求1所述的应用，其中所述的预防和修复指的是：对低剂量辐照带来的染色体断裂加以修复。

说明书

生血丸在制备预防低剂量电离辐射致细胞损伤药物中的应

用

技术领域

[0001] 本发明属于中药制剂技术领域，涉及中药的新用途，更具体的说是生血丸在制备预防或修复低剂量电离辐射致骨髓细胞损伤药物中的应用。

背景技术

[0002] 达仁堂生血丸源于中医研究院广安门医院名老中医谢海洲教授数十年临床之验方。善于补肾阳和肾精，精足则血旺。现代研究，生血丸有保肝利胆、抗肿瘤、抗氧化、镇静、降血糖等多种作用，治疗放、化疗后的全血细胞减少、再生障碍性贫血有确切疗效。方中有鹿茸、黄柏、山药、炒白术、桑枝、白扁豆、稻芽、紫河车。具有补肾健脾，填精补髓之功效。主药鹿茸温肾壮阳、强筋健骨、生精益血，是峻补元阳之要药，用于治疗精血两亏，活血又补血，具有促进造血之功能；紫河车益气、养血、补精，有强壮作用；白术、山药为健脾开胃之品，于大补之中防滋腻，有益气生血之作用：黄柏为泻火滋阴、清解清泻之品，取其缓解滋补过峻之作用而有利于体内吸收，该方组方严谨，临床应用功效确切。

[0003] 众所周知，各种各样的污染威胁着我们赖以生存的环境。例如无处不在的辐射----家用电器电视、电冰箱、空调、微波炉、吸尘器等；办公设备：手机、电脑、复印机、电子仪器、医疗设备等；家庭装饰：大理石、复合地板、墙壁纸、涂料等；周边环境中的高压线、变电站、电视（广播）信号发射塔等；自然环境中的太阳黑子等。在辐射源集中的环境中工作、学习、生活的人，容易失眠多梦、记忆力减退、体虚乏力、免疫力低下等，其癌细胞的生长速度比正常人快二十四倍。为临床寻求一种能保护细胞，修复损伤，防止DNA突变的中成药是当务之急。前期的实验（生血丸对骨髓抑制小鼠造血调控的实验研究）表明生血丸能显著提高骨髓抑制小鼠外周血血像和骨髓有核细胞计数；提高骨髓抑制小鼠外周血网织红细胞的计数；可促进骨髓抑制小鼠骨髓细胞从G0/G1期进入增殖周期；提高骨髓抑制小鼠体外培养造血干祖细胞集落的产率；能有效调节骨髓微环境中TPO、EPO和G-CSF的表达，从而促进外周血像的提升。

发明内容

[0004] 本发明公开了生血丸在制备预防或修复低剂量电离辐射致骨髓细胞损伤药物中的应用；其中所述的预防或修复骨髓细胞损伤指的是：抑制癌前细胞的增殖。

[0005] 本发明进一步公开了生血丸在制备提前预防低剂量电离辐射致白血病、多脏器肿瘤发生药物中的应用。

[0006] 本发明进一步还公开了生血丸在制备早期修复低剂量电离辐射致白血病、多脏器肿瘤发生药物中的应用。

[0007] 本发明所述的预防和修复指的是：对低剂量辐照带来的染色体断裂加以修复。

[0008] 本发明所述的低剂量电离辐射指的是：自然界存在的天然辐射；家用电器和办公设备产生的辐射；放射医学中，应用于诊断和治疗的医用X射线、γ射线等。根据UNSCEAR1988年报告，低剂量是指低于0.2Gy（Gy是吸收剂量单位）的剂量。在实际应用中，一般将低于0.5Gy的剂量称为低剂量。长期接触低剂量辐射，射线会导致机体造血系统、神经系统、性腺、视神经、眼晶体及免疫系统的损伤,外周血淋巴细胞染色体、微核尤为敏感,常出现异常现象。

[0009] 本发明的实验结果提示生血丸能很好地预防和治疗低剂量辐照带来的染色体断裂；生血丸能预防性降低和清除羟自由基和超氧阴离子；生血丸能有效产生ODC，抑制多胺的合成，抑制变异细胞的增殖。

[0010] 本发明以达仁堂生血丸为实验用药，从血液淋巴细胞、骨髓微核率的变化；自由基的清除能力；癌前细胞增殖的抑制等方面，检验生血丸抗环境污染致畸的功效，为生血丸的临床应用开辟更广阔的前景。

具体实施方式

[0011] 为了更充分的解释本发明的实施，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。

[0012] 实施例1第一部分 生血丸修复低剂量辐照致骨髓细胞损伤的病理研究
1 材料和方法
1.1 动物
中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供雄性BalB/C小鼠150只，体重
20±2g，8-12周龄,许可证号SCXK—（军）2007—004。

[0013] 1.2 主要材料和试剂快速姬姆萨染液：南京建成科技，批号：20101109
类标准胎牛血清：100ml，中美合资兰州民海生工程有限公司，批号：20100921肝素钠注射液： 2ml，1.25万单位，批号：20100502
羟自由基检测试剂盒：南京建成科技，批号：20110224
超氧阴离子检测试剂盒：南京建成科技，批号：20110303
鸟氨酸脱羧酶ELISA试剂盒：华北制药金坦生物技术股份有限公司，批号：E03O0007生血丸干粉：达仁堂制药厂提供
1.3 主要仪器和设备
OLYMPUS显微镜： 日本，BX51型
酶标仪：上海科华实验系统有限公司， ST-360型
高速低温离心机：美国sigma公司，3k-30型
电子分析天平： Sartorius德国，BP61型
137
Cs γ射线源： Nordion, Ottawa, Canada ，Gamma cell 40 Exactor
1.4 动物模型制备、分组和给药
BalB/C小鼠150只，雄性，体重20±2g，8-12周龄。分为五组：正常组30只，普食，正常饮水，16天；模型组1，30只，0.4GyX射线辐照4天后，普食，正常饮水12天；模型组2，30只，普食，正常饮水12天后，0.4GyX射线辐照4天；预防组30只，生血丸2.5g/kg饲胃，正常饮水12天后，0.4GyX射线辐照4天；治疗组30只，0.4GyX射线辐照4天后，生血丸2.5g/kg，正常饮水12天。

[0014] 1.5 外周血淋巴细胞微核率的检测方法小鼠目内眦眶静脉取血0.1ml，肝素抗凝,与1/2量的3%明胶放入离心管中,加盖混匀,垂直至于37℃水浴箱中自然沉降40分钟左右。吸取上清液，注入离心管中，1000rpm/5分钟，弃上清，取沉淀物推片，干后，甲醇固定1分钟，瑞-姬氏染色1 0分钟。

[0015] 微核计数标准：在油镜下观察1000个淋巴细胞，按Country-man的标准确定微核，即微核大小为主核的1/20～1/3，与主核核膜完全分离，形态较规正，圆形或椭圆形，染色性与主核相似或稍淡，无明显折光性。观察5000个淋巴细胞中所含微核的淋巴细胞数。

[0016] 1.6 骨髓细胞微核率的检测方法小鼠颈椎脱臼法处死以后，取双侧的小鼠股骨,剪去骨的两端,用小牛血清冲洗骨髓,直至骨髓腔发白为止。将骨髓冲洗液1500r/min离心8min,弃上清,然后用约0. 5mL的小牛血清将沉淀悬浮起来。每个载玻片滴一滴,涂开后于空气中自然干燥,甲醇固定15min,晾干,瑞姬染色15min,细水流冲洗晾干,即可观察。统计1000个骨髓细胞中所含微核的细胞。

[0017] 1.7 骨髓细胞抑制羟自由基能力的检测方法小鼠颈椎脱臼法处死以后，取双侧的小鼠股骨,剪去骨的两端,用生理盐水冲洗骨髓,直至骨髓腔发白为止。将骨髓冲洗液1500r/min离心8min,弃上清。细胞匀浆，按羟自由基检测试剂盒说明书操作，各样本以吸光值表示（OD）。

[0018] 1.8 骨髓细胞抗超氧阴离子能力的检测方法小鼠颈椎脱臼法处死以后，取双侧的小鼠股骨,剪去骨的两端,用生理盐水冲洗骨髓,直至骨髓腔发白为止。将骨髓冲洗液1500r/min离心8min，弃上清。细胞匀浆，采用比色法测定抗超氧阴离子活性，操作步骤按试剂盒说明书进行。蛋白测定采用考马斯亮蓝法。各样本以吸光值表示（OD）。

[0019] 1.9 骨髓细胞鸟氨酸脱羧酶（ODC）表达的检测方法小鼠颈椎脱臼法处死以后，取双侧的小鼠股骨,剪去骨的两端,用生理盐水冲洗骨髓,直至骨髓腔发白为止。将骨髓冲洗液1500r/min离心8min，弃上清。细胞匀浆，按ELISA试剂盒说明书操作，在酶标仪以波长450nm检测。各样本以吸光值表示（OD）。

[0020] 2 结果2.1生血丸对低剂量辐照小鼠外周血淋巴细胞及骨髓细胞微核率的影响
表1 生血丸对低剂量辐照小鼠外周血淋巴细胞及骨髓微核率的影响（
,n=10）
★ 模型组1vs 空白组，p<0.05；◆模型组2vs空白组，p<0.05；▲预防组vs 模型组2，p<0.05；■治疗组vs 模型组1, p<0.05。

[0021] 结果显示：模型组1、模型组2均比正常组外周血淋巴细胞、骨髓细胞微核率显著增加（p<0.05）；生血丸预防组及治疗组的微核率明显少于模型组2和模型组1（p<0.05）。

[0022] 2.2生血丸对低剂量辐照小鼠骨髓细胞羟自由基、超氧阴离子表达的影响表2 生血丸对低剂量辐照小鼠骨髓细胞羟自由基、超氧阴离子表达的影响（ ,n=10）★模型组1vs空白组，p<0.05；◆模型组2vs 空白组，p<0.05；▲预防组vs模型组2，p<0.05；■治疗组vs模型组1，p<0.05。

[0023] 结果显示：模型组1、模型组2的骨髓细胞羟自由基、超氧阴离子均比正常组表达显著增加（p<0.05）；生血丸预防组及治疗组的骨髓细胞羟自由基、超氧阴离子的表达明显少于模型组2和模型组1（p<0.05）。

[0024] 2.3生血丸对低剂量辐照小鼠骨髓细胞鸟氨酸脱羧酶（ODC）表达的影响表3生血丸对低剂量辐照小鼠骨髓细胞鸟氨酸脱羧酶(ODC)表达的影响（ ,n=10）空白组 预防组 模型组1 模型组2 治疗组
ODC(OD) 0.453±0.19 0.397±0.27▲ 0.216±0.19★ 0.178±0.43◆ 0.438±0.21■★模型组1vs空白组，p<0.05；◆模型组2vs 空白组，p<0.05；▲预防组vs模型组2，p<0.05；■治疗组vs模型组1，p<0.05。

[0025] 结果显示：模型组1、模型组2的骨髓细胞鸟氨酸脱羧酶（ODC）表达均比正常组显著减少（p<0.05）；生血丸预防组及治疗组ODC的表达明显高于模型组2和模型组1（p<0.05）。

[0026] 3讨论当射线作用于间期细胞的染色体时,可导致染色体损伤,包括染色单体断裂和染色体断片,在细胞分裂末期形成子细胞时,这些单体断裂和断片可滞留于胞质中形成微核。
因此,微核率的高低可以间接反映机体的吸收辐射的剂量。有研究表明，放射工作人员周围血淋巴细胞平均微核细胞率和平均微核率分别为3.27‰和3.43‰,明显高于对照组(P<0.01),表明低剂量电离辐射对放射工作人员的遗传物质有一定损伤。这些工种涉及到使用放射性仪表的钢铁、采矿、焦化厂等；质检部门使用的X、γ射线工业探伤机；医院使用的拍片机、CT机等放射线诊断仪器。

[0027] 自由基是指具有未配对电子的原子、离子或分子等类物质,自由基性质活泼,可损伤蛋白质、脂质、核酸等。超氧阴离子自由基、羟自由基、一氧化氮自由基等含氧的自由基