一种从魔芋飞粉中制备神经酰胺的方法

摘要

本发明涉及一种从魔芋飞粉中制备神经酰胺的方法，其特征在于包括如下操作步骤：a)神经酰胺的粗提：以魔芋飞粉为原料，用乙醇溶液提取，然后用石油醚萃取；b)硅胶柱层析纯化：将硅胶湿法装柱，湿法上样，用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱；c)中压C18键合硅胶ODS柱层析纯化：湿法装柱，湿法上样；用乙醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，干燥得纯度95％以上神经酰胺。该工艺生产成本低，适合工业化生产。

权利要求

1.一种从魔芋飞粉中制备神经酰胺的方法，其特征在于包括如下操作步骤：

(a)神经酰胺的粗提：以魔芋飞粉为原料，用乙醇溶液提取，提取完毕后过滤，浓缩，回收乙醇，然后将浓缩液用石油醚萃取2次，合并石油醚相，回收石油醚得棕色的神经酰胺浸膏，即神经酰胺样品I；

(b)硅胶柱层析纯化：将硅胶湿法装柱，并用初始洗脱剂平衡层析柱；神经酰胺样品I用初始洗脱剂溶解，湿法上样；用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，分步收集流出液，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品II：(c)中压C18键合硅胶ODS柱层析纯化：将C18键合硅胶湿法装柱，用加压装置进行压缩，并用初始洗脱剂平衡层析柱；将上述的神经酰胺样品II用初始洗脱剂进行溶解，湿法上样；用乙醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，分步收集流出液，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品III；经HPLC-ELSD检测，神经酰胺样品III的纯度可以到达95％以上。

2.按照权利要求1所述的一种从魔芋飞粉中制备神经酰胺的方法，其特征在于所述的步骤(a)中：

(a)神经酰胺的粗提：以魔芋飞粉为原料，用浓度为75％～95％乙醇溶液提取，料液比为固液比魔芋飞粉∶乙醇溶液1∶3～5，提取的温度为60～80℃，提取时间为1～2h；

提取完毕后过滤，浓缩，回收乙醇，然后将浓缩液用60～90℃馏分石油醚萃取2次，搅拌时间为0.5～1.5h，静置时间为0.5h，料液比为体积比浓缩液∶石油醚1∶2～4，合并石油醚相，回收石油醚得棕色的神经酰胺浸膏，即神经酰胺样品I。

3.按照权利要求1所述的一种从魔芋飞粉中制备神经酰胺的方法，其特征在于所述的步骤(b)中：

(b)硅胶柱层析纯化：将300～400目硅胶活化，活化温度为105～110℃，活化时间为1～2h；硅胶湿法装柱后，用初始洗脱剂平衡层析柱；神经酰胺样品I用初始洗脱剂溶解，湿法上样；上样量为1～5g粗品/100g硅胶；，然后用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱剂石油醚-乙酸乙酯的体积比分别为95∶5、85∶15、75∶25、60∶40、

40∶60，其中95∶5和85∶15两种洗脱剂使用量各为1BV，后三种洗脱剂的使用量各为

2BV，分步收集流出液，洗脱速度为2～4BV/h，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品II。

4.按照权利要求1所述的一种从魔芋飞粉中制备神经酰胺的方法，其特征在于所述的步骤(c)中：

(c)中压C18键合硅胶ODS柱层析纯化：称取适量的C18键合硅胶用初始流动相进行浸泡，并且搅拌，待硅胶中没有气泡时，湿法装入中压色谱柱中；然后用加压装置进行压缩，使压缩后的C18键合硅胶柱在正常流速下的工作压力为5～20bar，并用初始洗脱剂平衡层析柱；将上述的神经酰胺样品II用初始洗脱剂进行溶解，湿法上样，上样量为0.1～0.5g样品/100g C18键合硅胶；用乙醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱剂乙醇-水的体积比分别为90％、75％、60％，每种洗脱剂的量为2～2.5BV，洗脱速度为1～1.5BV/h，用TLC检测流出液，分步收集流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品III；

经HPLC-ELSD检测，神经酰胺样品III的纯度可以到达95％以上。

说明书

一种从魔芋飞粉中制备神经酰胺的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种从魔芋飞粉中制备神经酰胺的方法。

背景技术

[0002] 魔芋(konjac)属于被子植物门、单子叶植物纲、天南星科，是具有球茎的多年生草本植物。据统计，我国有魔芋属植物26种，其中14种为我国特有，目前魔芋总产量占全世界的三分之一，且每年都在不断增加。魔芋为喜阴、喜湿、怕热、不耐寒、怕渍水的作物，生长环境要求特殊，全世界范围内适宜种植的区域极为有限。在我国，其主要分布于湖南、四川、湖北、云南、贵州、台湾等地。湖北省恩施州夏无酷暑、冬少严寒、土壤微酸性且富含硒元素，自然条件得天独厚，是种植魔芋的理想地之一。全州总种植规模达到60万亩，其中商品基地45万亩，种芋基地15万亩，年实现种植产值25亿元，魔芋精(微、纯)粉以及饮料、食品涂料、可溶可食薄膜总加工产值达75亿元，年销售各类魔芋产品在25,000吨以上。目前，我国的魔芋精粉加工方法大体上可分为干法和湿法，魔芋飞粉是魔芋精粉生产过程中产生的副产物，占加工前魔芋粉质量的35％～45％。由于魔芋飞粉含有异味以及抗营养因子，且葡甘聚糖的含量低，制约了其在食品、医药等领域的应用，仅湖北省每年就有约85％的魔芋飞粉未被利用。

[0003] 然而，魔芋飞粉中含有大量的有效成分，大约含有50％的总糖、20％的蛋白质、0.5％的脂肪、2.5％的纤维素、7％的矿物质以及0.15％～0.20％的神经酰胺。神经酰胺，即N-脂酰神经鞘胺醇，是鞘磷脂的重要组成单位，是生物体内一类重要的功能物质，也是生物体内重要的脂质第二信使。神经酰胺具有抗肿瘤、诱导人结肠癌细胞凋亡、诱导人鼻咽癌细胞凋亡、抗肝毒性、降血脂、降血糖等药理作用，以及减肥、对皮肤有保湿、抗衰老、美白等作用，广泛应用于医药、保健品以及日用品中。

[0004] 神经酰胺制品有天然和化学合成两类，在医药领域主用是天然的神经酰胺。以前，一些发达国家主要从牛脑中提取丰富的神经酰胺，但是自1986年“疯牛病”发生以来，动物性神经酰胺的安全性广受质疑，动物来源的神经酰胺制品已被植物性神经酰胺制品所取代。天然神经酰胺主要从大豆、大米、小麦、酵母、魔芋等植物中提取，但是米糠和小麦中的神经酰胺含量仅0.01％～0.02％，魔芋精粉中的含量约为0.026％，而魔芋飞粉中的神经酰胺的含量为0.15％～0.20％，是神经酰胺提取的重要原料，具有很高的开发前景。

发明内容

[0005] 本发明要解决的问题是提供一种从魔芋飞粉中制备神经酰胺的方法。

[0006] 本发明一种从魔芋飞粉中制备神经酰胺的方法，其特征在于包括如下操作步骤：

[0007] (a)神经酰胺的粗提：以魔芋飞粉为原料，用乙醇溶液提取，提取完毕后过滤，浓缩，回收乙醇，然后将浓缩液用石油醚萃取2次，合并石油醚相，回收石油醚得棕色的神经酰胺浸膏，即神经酰胺样品I；

[0008] (b)硅胶柱层析纯化：将硅胶湿法装柱，并用初始洗脱剂平衡层析柱；神经酰胺样品I用初始洗脱剂溶解，湿法上样；用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，分步收集流出液，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品II；

[0009] (c)中压C18键合硅胶ODS柱层析纯化：将C18键合硅胶湿法装柱，用加压装置进行压缩，并用初始洗脱剂平衡层析柱；将上述的神经酰胺样品II用初始洗脱剂进行溶解，湿法上样；用乙醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，分步收集流出液，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品III；经HPLC-ELSD检测，神经酰胺样品III的纯度可以到达95％以上。

[0010] 本发明一种从魔芋飞粉中制备神经酰胺的方法，其特征在于包括如下操作步骤：

[0011] (a)神经酰胺的粗提：以魔芋飞粉为原料，用浓度为75％～95％乙醇溶液提取，料液比为固液比魔芋飞粉∶乙醇溶液1∶3～5，提取的温度为60～80℃，提取时间为1～2h；提取完毕后过滤，浓缩，回收乙醇，然后将浓缩液用60～90℃馏分石油醚萃取2次，搅拌时间为0.5～1.5h，静置时间为0.5h，料液比为体积比浓缩液∶石油醚1∶2～4，合并石油醚相，回收石油醚得棕色的神经酰胺浸膏，即神经酰胺样品I；

[0012] (b)硅胶柱层析纯化：将300～400目硅胶活化，活化温度为105～110℃，活化时间为1～2h；硅胶湿法装柱后，用初始洗脱剂平衡层析柱；神经酰胺样品I用初始洗脱剂溶解，湿法上样；上样量为1～5g粗品/100g硅胶；，然后用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱剂石油醚-乙酸乙酯的体积比分别为95∶5、85∶15、75∶25、60∶40、40∶60，其中95∶5和85∶15两种洗脱剂使用量各为1BV，后三种洗脱剂的使用量各为
2BV，分步收集流出液，洗脱速度为2～4BV/h，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品II；

[0013] (c)中压C18键合硅胶ODS柱层析纯化：称取适量的C18键合硅胶用初始流动相进行浸泡，并且搅拌，待硅胶中没有气泡时，湿法装入中压色谱柱中；然后用加压装置进行压缩，使压缩后的C18键合硅胶柱在正常流速下的工作压力为5～20bar，并用初始洗脱剂平衡层析柱；将上述的神经酰胺样品II用初始洗脱剂进行溶解，湿法上样，上样量为0.1～0.5g样品/100gC18键合硅胶；用乙醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱剂乙醇-水的体积比分别为90％、75％、60％，每种洗脱剂的量为2～2.5BV，洗脱速度为1～1.5BV/h，用TLC检测流出液，分步收集流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品III；经HPLC-ELSD检测，神经酰胺样品III的纯度可以到达95％以上。

[0014] 本发明提供了一种从魔芋飞粉中制备高纯度神经酰胺的方法，是利用魔芋飞粉为原料，通过硅胶柱层析技术联合中压C18键合硅胶柱层析技术制备高纯度的神经酰胺。

[0015] 1、神经酰胺的粗提

[0016] 以魔芋飞粉为原料，用75％～95％(v/v)乙醇于60～80℃搅拌提取1～2h，料液比为1∶3～1∶5，提取完毕后过滤，收集滤液，滤液转入酒精回收装置，回收酒精至浓缩液中的酒精度为0～20％，然后往浓缩液中加入2～4倍体积的60～90℃石油醚进行萃取，搅拌0.5～1.5h后静置分层，收集醚相，萃取2次，合并醚相，将醚相浓缩至浸膏状，得棕色的神经酰胺样品I；

[0017] 2、硅胶柱层析纯化神经酰胺

[0018] 2.1硅胶的活化

[0019] 称取300～400目的硅胶于105～110℃活化1～2h。

[0020] 2.2湿法装柱

[0021] 将活化好的硅胶放入容器中，并加入适量的石油醚，顺着固定方向搅拌，待硅胶中没有气泡时，湿法装入中压色谱柱中。并用初始洗脱剂平衡层析柱。

[0022] 2.3湿法上样和洗脱

[0023] 将上述的神经酰胺粗品I用初始流动相溶解后湿法上样，上样量为1～5g粗品/100g硅胶。然后用石油醚-乙酸乙酯(95∶5，85∶15，75∶25，60∶40，40∶60，v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，95∶5和85∶15两种洗脱剂使用量各为1BV，后三种洗脱剂的使用量各为2BV，分步收集流出液，洗脱速度为2～4BV/h，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品II。硅胶层析柱经甲醇再生后可重复使用。

[0024] 3、中压C18键合硅胶(ODS)柱层析纯化神经酰胺

[0025] 3.1湿法装柱

[0026] 称取适量的C18键合硅胶用初始流动相进行浸泡，并且搅拌，待硅胶中没有气泡时，湿法装入中压色谱柱中。然后用加压装置进行压缩，使压缩后的C18键合硅胶柱在正常流速下的工作压力为5～20bar，并用初始洗脱剂平衡层析柱。

[0027] 3.2湿法上样和洗脱

[0028] 将上述的神经酰胺样品II用初始洗脱剂溶解，湿法上样，上样量为0.1～0.5g样品/100g C18键合硅胶。以乙醇-水(90％，75％，60％，v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，每种洗脱剂的量为2～2.5BV，分步收集流出液，洗脱速度为1～1.5BV/h，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品III。经HPLC-ELSD检测，神经酰胺样品III的纯度可以到达95％以上。其它低含量的神经酰胺样品重新上柱进行回收利用。中压C18键合硅胶层析柱经甲醇再生后可重复使用。

[0029] 4、检测

[0030] 本发明中主要使用TLC法定性和HPLC-ELSD法定量分析检测神经酰胺。

[0031] TLC定性方法：

[0032] 硅胶板的活化：110℃，30min；展开剂：氯仿∶甲醇∶醋酸＝19∶0.9∶0.1(v/v/v)；

[0033] 显色剂I：0.1％茜素(取0.1g茜素，用少量乙醇溶解后，定容至100mL备用)；显色方式：喷雾显色；

[0034] 显色剂：10％硫酸铜磷酸溶液(取10g无水硫酸铜，用10％的磷酸溶液溶解后定容至100mL备用)；显色方式：浸泡3min后在140℃下烘30min，观察颜色的变化。

[0035] HPLC定量法：

[0036] 仪器和色谱条件：Waters 2695分离单元+Alltech ELSD3300蒸发光散射检测器；Masslynx 4.0色谱工作站；色谱柱：Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇/水(v/v)，梯度洗脱；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：20μL；蒸发光散射检测器漂移管的温度：40℃，氮气流速：1.5L/min，检测灵敏度：2。

[0037] 本发明与现有技术比较，是利用魔芋飞粉为原料，通过硅胶柱层析技术联合中压C18键合硅胶柱层析技术制备高纯度的神经酰胺。该工艺生产成本低，适合工业化生产。

附图说明

[0038] 附图为魔芋飞粉神经酰胺制备工艺流程图。

具体实施方式

[0039] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

[0040] 实施例1

[0041] (1)神经酰胺的粗提

[0042] 取魔芋飞粉100g于三口平底烧瓶中，加入300mL 75％乙醇溶液，连接好冷凝管，磁力搅拌提取1h，同时用电接点温度计控制温度为50±1℃，提取完毕，过滤，将神经酰胺的乙醇提取液转移至旋转蒸发器中进行浓缩至乙醇浓度为10％，将浓缩液转移至干净的三口平底烧瓶中，按浓缩液体积加入2倍量的60～90℃石油醚，搅拌0.5h，转移至分液漏斗中静置0.5h，分层后收集上层的醚相，萃取2次。合并醚相，回收石油醚浓缩至浸膏，得棕色的神经酰胺样品I，重量为1.31g；

[0043] (2)硅胶柱层析纯化

[0044] 按上样量为1～5g粗品/100g硅胶，称取300～400目硅胶100g于105～110℃活化1h，然后将活化好的硅胶放入容器中，并加入适量的石油醚，顺着固定方向搅拌，待硅胶中没有气泡时，湿法装入硅胶色谱柱中，硅胶柱为40*190mm，柱体积约为250mL。然后用初始洗脱剂500mL以8mL/min的流速平衡层析柱。

[0045] 将上述的神经酰胺粗品I用初始流动相溶解后湿法上样，分别用石油醚-乙酸乙酯(v/v)95∶5、85∶15、75∶25、60∶40、40∶60为洗脱剂进行梯度洗脱，95∶5和85∶15两种洗脱剂使用量各为1BV，后三种洗脱剂的使用量各为2BV，分步收集流出液，洗脱速度为2BV/h，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品II，重量为0.22g。硅胶层析柱经甲醇再生后可重复使用；

[0046] (3)中压C18键合硅胶柱层析纯化神经酰胺

[0047] 按上样量为0.1～0.5g样品/100g C18键合硅胶，称取C18键合硅胶100g，用初始流动相进行浸泡，并且搅拌，待硅胶中没有气泡时，湿法装入中压色谱柱中。然后用加压装置进行压缩，使压缩后的C18键合硅胶柱在正常流速下的工作压力为10bar，并用初始洗脱剂平衡层析柱。

[0048] 将上述的神经酰胺样品II用初始洗脱剂溶解，湿法上样，以乙醇-水(v/v)90％、75％、60％，为洗脱剂进行梯度洗脱，每种洗脱剂的量为500mL，分步收集流出液，洗脱速度为4mL/min，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品III。经HPLC-ELSD检测，神经酰胺样品III的纯度可以到达95.0％，重量为0.061g。其它低含量的神经酰胺样品重新上柱进行回收利用。中压C18键合硅胶层析柱经甲醇再生后可重复使用。

[0049] 实施例2

[0050] (1)神经酰胺的粗提

[0051] 取魔芋飞粉100g于三口平底烧瓶中，加入400mL 85％乙醇溶液，连接好冷凝管，磁力搅拌提取1.5h，同时用电接点温度计控制温度为60±1℃，提取完毕，过滤，将神经酰胺的乙醇提取液转移至旋转蒸发器中进行浓缩至乙醇浓度为10％，将浓缩液转移至干净的三口平底烧瓶中，按浓缩液体积加入3倍量的60～90℃石油醚，搅拌1.0h，转移至分液漏斗中静置0.5h，分层后收集上层的醚相，萃取2次。合并醚相，回收石油醚浓缩至浸膏，得棕色的神经酰胺样品I，重量为1.29g；

[0052] (2)硅胶柱层析纯化

[0053] 按上样量为1～5g粗品/100g硅胶，称取300～400目硅胶于105～110℃活化1.5h，然后将活化好的硅胶放入容器中，并加入适量的石油醚，顺着固定方向搅拌，待硅胶中没有气泡时，湿法装入中压色谱柱中，硅胶柱为40*190mm，柱体积约为250mL。然后用初始洗脱剂500mL以10mL/min的流速平衡层析柱。

[0054] 将上述的神经酰胺粗品I用初始流动相溶解后湿法上样，分别用石油醚-乙酸乙酯(v/v)95∶5、85∶15、75∶25、60∶40、40∶60为洗脱剂进行梯度洗脱，95∶5和85∶15两种洗脱剂使用量各为1BV，后三种洗脱剂的使用量各为2BV，分步收集流出液，洗脱速度为3BV/h，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品II，重量为0.19g。硅胶层析柱经甲醇再生后可重复使用；

[0055] (3)中压C18键合硅胶柱层析纯化神经酰胺

[0056] 按上样量为0.1～0.5g样品/100g C18键合硅胶，称取C18键合硅胶100g，用初始流动相进行浸泡，并且搅拌，待硅胶中没有气泡时，湿法装入中压色谱柱中。然后用加压装置进行压缩，使压缩后的C18键合硅胶柱在正常流速下的工作压力为12bar，并用初始洗脱剂平衡层析柱。

[0057] 将上述的神经酰胺样品II用初始洗脱剂溶解，湿法上样，以乙醇-水(v/v)90％、75％、60％，为洗脱剂进行梯度洗脱，每种洗脱剂的量为550mL，分步收集流出液，洗脱速度为5mL/min，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品III。经HPLC-ELSD检测，神经酰胺样品III的纯度可以到达95.7％，重量为0.072g。其它低含量的神经酰胺样品重新上柱进行回收利用。中压C18键合硅胶层析柱经甲醇再生后可重复使用。

[0058] 实施例3

[0059] (1)神经酰胺的粗提

[0060] 取魔芋飞粉100g于三口平底烧瓶中，加入500mL 90％乙醇溶液，连接好冷凝管，磁力搅拌提取1.5h，同时用电接点温度计控制温度为70±1℃，提取完毕，过滤，将神经酰胺的乙醇提取液转移至旋转蒸发器中进行浓缩至乙醇浓度为5％，将浓缩液转移至干净的三口平底烧瓶中，按浓缩液体积加入4倍量的60～90℃石油醚，搅拌1.0h，转移至分液漏斗中静置0.5h，分层后收集上层的醚相，萃取2次。合并醚相，回收石油醚浓缩至浸膏，得棕色的神经酰胺样品I，重量为1.35g；

[0061] (2)硅胶柱层析纯化

[0062] 按上样量为1～5g粗品/100g硅胶，称取300～400目硅胶于105～110℃活化1.5h，然后将活化好的硅胶放入容器中，并加入适量的石油醚，顺着固定方向搅拌，待硅胶中没有气泡时，湿法装入中压色谱柱中，硅胶柱为40*190mm，柱体积约为250mL。然后用初始洗脱剂500mL以9mL/min的流速平衡层析柱。

[0063] 将上述的神经酰胺粗品I用初始流动相溶解后湿法上样，分别用石油醚-乙酸乙酯(v/v)95∶5、85∶15、75∶25、60∶40、40∶60为洗脱剂进行梯度洗脱，95∶5和85∶15两种洗脱剂使用量各为1BV，后三种洗脱剂的使用量各为2BV，分步收集流出液，洗脱速度为4BV/h，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品II，重量为0.20g。硅胶层析柱经甲醇再生后可重复使用；

[0064] (3)中压C18键合硅胶柱层析纯化神经酰胺

[0065] 按上样量为0.1～0.5g样品/100g C18键合硅胶，称取C18键合硅胶100g，用初始流动相进行浸泡，并且搅拌，待硅胶中没有气泡时，湿法装入中压色谱柱中。然后用加压装置进行压缩，使压缩后的C18键合硅胶柱在正常流速下的工作压力为16bar，并用初始洗脱剂平衡层析柱。

[0066] 将上述的神经酰胺样品II用初始洗脱剂溶解，湿法上样，以乙醇-水(v/v)90％、75％、60％，为洗脱剂进行梯度洗脱，每种洗脱剂的量为600mL，分步收集流出液，洗脱速度为5mL/min，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品III。经HPLC-ELSD检测，神经酰胺样品III的纯度可以到达95.2％，重量为0.064g。其它低含量的神经酰胺样品重新上柱进行回收利用。中压C18键合硅胶层析柱经甲醇再生后可重复使用。

[0067] 实施例4

[0068] (1)神经酰胺的粗提

[0069] 取魔芋飞粉100g于三口平底烧瓶中，加入400mL 95％乙醇溶液，连接好冷凝管，磁力搅拌提取1.5h，同时用电接点温度计控制温度为80±1℃，提取完毕，过滤，将神经酰胺的乙醇提取液转移至旋转蒸发器中进行浓缩至乙醇浓度为20％，将浓缩液转移至干净的三口平底烧瓶中，按浓缩液体积加入4倍量的60～90℃石油醚，搅拌1.0h，转移至分液漏斗中静置0.5h，分层后收集上层的醚相，萃取2次。合并醚相，回收石油醚浓缩至浸膏，得棕色的神经酰胺样品I，重量为1.28g；

[0070] (2)硅胶柱层析纯化

[0071] 按上样量为1～5g粗品/100g硅胶，称取300～400目硅胶于105～110℃活化1.5h，然后将活化好的硅胶放入容器中，并加入适量的石油醚，顺着固定方向搅拌，待硅胶中没有气泡时，湿法装入中压色谱柱中，硅胶柱为40*190mm，柱体积约为250mL。然后用初始洗脱剂500mL以8mL/min的流速平衡层析柱。

[0072] 将上述的神经酰胺粗品I用初始流动相溶解后湿法上样，分别用石油醚-乙酸乙酯(v/v)95∶5、85∶15、75∶25、60∶40、40∶60为洗脱剂进行梯度洗脱，95∶5和85∶15两种洗脱剂使用量各为1BV，后三种洗脱剂的使用量各为2BV，分步收集流出液，洗脱速度为4BV/h，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品II，重量为0.21g。硅胶层析柱经甲醇再生后可重复使用；

[0073] (3)中压C18键合硅胶柱层析纯化神经酰胺

[0074] 按上样量为0.1～0.5g样品/100g C18键合硅胶，称取C18键合硅胶100g，用初始流动相进行浸泡，并且搅拌，待硅胶中没有气泡时，湿法装入中压色谱柱中。然后用加压装置进行压缩，使压缩后的C18键合硅胶柱在正常流速下的工作压力为20bar，并用初始洗脱剂平衡层析柱。

[0075] 将上述的神经酰胺样品II用初始洗脱剂溶解，湿法上样，以乙醇-水(v/v)90％、75％、60％，为洗脱剂进行梯度洗脱，每种洗脱剂的量为600mL，分步收集流出液，洗脱速度为6mL/min，用TLC检测流出液，合并具有相同成份的流出液，回收溶剂，干燥得神经酰胺样品III。经HPLC-ELSD检测，神经酰胺样品III的纯度可以到达95.1％，重量为0.076g。其它低含量的神经酰胺样品重新上柱进行回收利用。中压C18键合硅胶层析柱经甲醇再生后可重复使用。