一种特异识别血小板αIIbβ3的抗栓药物RWR

摘要

本发明提供了一种小分子多肽，对RGD三肽进行改造，根据RGD特异结合αIIbβ3的特点，在其N端增加疏水性氨基酸和碱性氨基酸，第四位增加一个疏水性氨基酸W，第五位增加一个碱性氨基酸R，该小肽序列为Arg-Gly-Asp-Trp-Arg，其蛋白质一级结构为RGDWR，可提高其特异结合αIIbβ3能力，又能以较小的分子量降低免疫原性，解决现有抗血栓制剂存在的缺陷。

权利要求

1.一种小分子多肽RWR，其蛋白质一级结构为RGDWR，即Arg-Gly-Asp-Trp-Arg。

2.制备权利要求1所述多肽RWR的方法，其特征是，该方法采用9-芴甲氧羰基法，首先将Arg的羧基通过酰胺键与Wang树脂多肽合成载体连接，然后在缩合剂作用下根据五肽序列从C端向N端延伸肽链，缩合后用20％的二甲基甲酰胺溶液去除9-芴甲氧羰基保护基；

肽链合成后，用三氟乙酸在室温下搅拌，震荡，过滤，在去除侧链保护基的同时，使肽链从树脂上解离下来，利用茚三酮试剂检测脱保护和缩合的完全程度；合成的产物经RP-HPLC C18反相色谱柱纯化，得到RWR。

3.权利要求1所述多肽RWR在制备治疗血栓性疾病药物中的应用。

说明书

一种特异识别血小板αIIbβ3的抗栓药物RWR

技术领域：

[0001] 本发明涉及蛋白质多肽领域，具体地讲，涉及一种能够特异识别血小板表面整合素αIIbβ3的多肽及其制备和应用。背景技术：

[0002] 心脑血管疾病如心肌梗死、脑梗塞是一种严重威胁人类健康的重大疾病，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。心脑血管疾病具有发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高，并发症多即“四高一多”的特点，已成为人类死亡病因最高的头号杀手。即使应用目前最先进、完善的治疗手段，仍有50％以上心脑血管疾病幸存者生活不能自理。

[0003] 众多心脑血管疾病的发生、发展都和病理性血栓形成有关。迄今已用于临床的血栓抑制剂有很多种。传统的溶栓抗栓药物虽具有一定的抑制血栓生成作用，但其局限性不容忽视。例如溶栓药尿激酶、链激酶，TPA等在不同程度上存在着特异性差，需用量大，有出血倾向以及使用后再次栓塞等缺点，抗栓药阿斯匹林对高切应力所致的血小板活化无抑制作用，而且当冠脉狭窄程度增加时抗栓效果减弱。而且现有绝大多数的抗血小板聚集药，只能阻止血小板活化途径中的一条通路，当某一特定通路被充分抑制时，血小板仍可通过其它途径活化，引起血小板聚集。基于传统血栓生成抑制剂的局限性，科学家们仍在 继续研究新的血栓抑制剂，不断探索疗效确切、成本低廉的抗血栓药。

[0004] 血栓形成的共同通路也即关键环节是：纤维蛋白α链的RGD(Arg-Gly-Asp)模体特异识别血小板表面αIIbβ3受体，介导纤维蛋白与血小板的结合，该过程犹如链条，把相邻的血小板连在一起，形成血栓。由于RGD模体具有与αIIbβ3受体特异结合的特性，因此含有RGD序列的多肽即可以竞争性抑制纤维蛋白与血小板的结合，从而抑制血栓形成，即可以阻断血栓形成的最后通路。

[0005] RGD是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸组成的三肽。1984年Pierschbacher和Ruoslahti首次确定了RGD序列为人纤维连接蛋白与其受体结合位点。研究发现：RGD广泛存在于细胞识别系统。基质蛋白中的RGD是与细胞表面特异受体相互作用的识别位点，这些细胞表面膜蛋白是广泛分布的超级家族-粘附受体的成员，称为整合素。整合素在正常情况下无活性，一旦在激素，细胞因子或其它因素的刺激下，其构型和亲合力发生改变，整合素受体与特异性配体的RGD结构结合，引起细胞内一系列生化改变，进而影响多种组织细胞功能的调控，包括细胞凋亡，分化，增殖，迁移，粘附，血小板聚集等一系列病理生理过程。

[0006] 国内外对RGD多肽的生物学活性进行的大量研究，证明了RGD多肽在疾病治疗方面具有广阔的应用前景。RGD及类似物对预防和治疗心脑血管疾病、骨质疏松以及由细胞粘连异常而导致的肿瘤等疾病具有重要作用，人工合成的RGD多肽或化合物也具有类似的生物学活性，含有RGD多肽已成为医学研究的热点。1991年J.Samanen 等合成了一系列含有RGD序列的小肽，经过药理活性试验发现了它们可抑制纤维蛋白原与血小板的结合，抑制血栓的形成。众多实验研究表明，RGD多肽作为αIIbβ3受体拮抗剂，可以阻断血栓形成的最终通路，理论上具有彻底抑制血栓形成的功能。

[0007] 目前一些科学家通过人工合成一些RGD序列的小肽进行基础及临床试验，已取得一定的成果。如RGDS，DRGDW，GRGDSPA等都可抑制纤维蛋白与血小板结合，抑制血栓形成。新近的实验研究表明，用氨基酸替代法研究RGD与血小板αIIbβ3结构和活性的关系时发现，用Val取代Arg将使RGD的活性降低10倍，用Ala取代Gly出现类似结果，用Glu取代Asp将使其功能完全丧失。逆转RGDS和RGDV序列将使其对血小板抑制功能完全丧失。另有实验研究表明，GRGDSP六肽(Gvy-Ay-Gy-Asy-Ser-Pro)可直接抑制纤维蛋白(Fg)与血小板的结合；Eward等发现RGDS明显抑制Fg和ADP激活的血小板结合；Rote等发现含RGD序列的SC-4992呈量依赖抑制血栓形成，抑制ADP和花生四烯酸引起的血小板聚集。其中RGD序列是高度保守的，是识别受体必需的。天然存在的含RGD的多肽和人工合成含RGD的小肽，一般都具有相似的功能，既可以抑制血栓形成、也具有抑制肿瘤转移和骨质疏松的功能。因此，RGD类似物作用广泛但不特异，如何提高其作用的特异性及活性，是研究人员的关注热点，也是本课题组多年来的研究重点。

[0008] 近年来，本实验室通过突变Echistatin RGD模体周边部分氨基酸，得到两种不同的突变体，建立了这两种突变体的基因工程生产工 艺，并进行了药效学研究，系统研究了RGD周边氨基酸的变化对其活性的影响，在RGD模体周边氨基酸突变研究方面积累了不少的经验。研究表明，第四位氨基酸对其活性影响最大，以疏水氨基酸为佳，疏水性越强，其抑制纤维蛋白与αIIbβ3结合力越强。本项研究即对RGD进行改造，增加两个氨基酸，以增强其作用的特异性和高效性。

[0009] 本发明的目的，在于提供一种能够特异识别和抑制血栓形成的多肽，从而克服现有血栓生成抑制剂及一些溶栓药物存在的副作用大、特异性不强等问题，以期在临床治疗中发挥高效、特异抑制血栓形成的功效。本发明所述一种特异识别血小板αIIbβ3的抗栓药物RWR，迄今尚未见有国内外的相关报道。发明内容：

[0010] 本发明提供了一种全新的小分子多肽，对RGD进行改造。根据RGD能特异结合αIIbβ3的特点，增加一个疏水性氨基酸和一个碱性氨基酸，第四位增加一个疏水性氨基酸W，第五位增加一个碱性氨基酸R，可提高其特异结合αIIbβ3能力，又能以较小的分子量降低免疫原性，解决现有抗血栓制剂存在的缺陷。本发明所述小肽序列为Arg-Gly-Asp-Trp-Arg，其蛋白质一级结构为RGDWR，该化合物能显著提高其生物学活性，降低RGD类似物的副作用。

[0011] 本发明的要点之一在于，提供一种新的小分子多肽设计与合成，将氨基酸序列设计为：Arg-Gly-Asp-Trp-Arg，其蛋白质一级结构为RGDWR，将其命名为RWR。 [0012] 本发明的要点之二在于，RWR作用机理独特，与纤维蛋白原竞 争αIIbβ3受体拮抗剂，竞争性地抑制纤维蛋白原与血小板结合(即抑制血栓形成的最后共同通路)的作用，尤其是，课题组创造性引入第四位氨基酸W，第五位氨基酸R与RGD模体共同发挥作用，大大增强了RGD的作用，提高了其活性和特异性，可以高效抑制任何激活剂引起的血小板聚集，因此它作用的彻底性和高效性是不言而喻的。

[0013] 发明优点：

[0014] 本发明的优点与积极效果在于，可以利用化学合成、基因工程与蛋白质工程技术，设计并制备一种小分子多肽，所述多肽具有明显抑制血栓生成的作用，且具有副作用小，特异性强，活性高和较小的免疫原性；同时具有结构简单，成本低廉，易于合成的特点，具有广阔的市场和临床应用前景。

[0015] 实施方案：

[0016] 以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0017] <实施例1>Arg-Gly-Asp-Trp-Arg的合成、纯化与鉴定

[0018] 应用9-芴甲氧羰基(Fmoc)方法，采用Wang树脂(Wang Resin)多肽合成载体，首先将Arg的羧基通过酰胺键与wang-Resin连接，然后根据五肽序列从C端向N端延伸肽链，每步缩合都加入缩合剂如苯并三氮唑-N，N，N，N-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，1-羟基-苯并-三氮唑(HOBt)，缩合后用20％的DMF(二甲基甲酰胺)溶液去除Fmoc保护基。肽链合成后，用TFA(三氟乙酸)在室温下搅拌， 震荡，过滤，在去除侧链保护基的同时，使肽链从树脂上解离下来。利用茚三酮试剂检测脱保护和缩合的完全程度。合成的RWR经RP-HPLC(反相高压液相色谱)C18反相色谱柱纯化，0.1％TFA和乙腈(0-30％)梯度洗脱，流速10mL/min，检测波长215nm，纯度大于90％。应用ESI-MS，元素分析确证其结构与理论值一致。

[0019] <实施例2>：体外抗栓作用的活性实验及量效关系研究

[0020] 于清晨空腹经肘静脉采人血，以3.8％枸橼酸钠抗凝(血与抗凝剂的体积比为9∶1)，室温下，1000r/min离心8min，取上层血浆即为富血小板血浆(PRP platelet-rich plasma)，分离PRP。将余血再以3000r/min离心10min，取上层血浆得贫血小板血浆(PPP platelet-poor plasma)，用PPP调整PRP，使血小板数约为25万/μL。取PRP400μL，分别加入NS(阴性对照)及不同浓度的替罗非班(Tirofiban)(200、100、50、25、12.5μM阳性对照)/小肽RWR(100、50、20、12.5、6.25μM终浓度)50μl，采用比浊法测定血小板聚集率(测定仪为Helena的Packs-4型血小板聚集仪)，37℃以900r/min，在血小板聚集仪上搅拌，孵育2min后分别加入二磷酸腺苷(ADP)50μl，同时开始测定。所有接触血液用品均为一次性塑料制品。

[0021] 结果表明，RWR在体外对ADP诱导的家兔血小板聚集具有明显抑制作用。随着剂量增加，作用增强，呈现出量效相关性。各剂量组与对照组比较，均有显著性差异(P＜0.05)。RWR的IC50值为19.7μmol/L；替罗非班的IC50值为39.5μmol/l，见表1。 [0022] 表1RWR、Tirofiban对ADP诱导血小板聚集的IC50值

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