致病杆菌抗菌肽及其在抑制病原真菌和细菌生长中的应用

摘要

本发明涉及一种含有不多于20个氨基酸的肽段和其应用，目的是为了提供一种能抑制病原真菌和细菌生长的致病杆菌抗菌肽，1.0μg/ml抗菌肽用于抑制病原真菌生长时，对辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、禾谷镰刀菌和灰葡萄孢菌的抑制率分别为60.01％、74.00％、49.21％、60.71％；1.0μg/ml抗菌肽用于抑制细菌生长时，对枯草芽孢杆菌、番茄疮痂病菌、青枯菌、普通变形杆菌和巨大芽孢杆菌分别形成19.04±0.2mm、16.47±0.35mm、10.75±0.41mm、10.3±0.33mm、7.3±0.28mm的抑菌圈。本发明致病杆菌抗菌肽，其氨基酸序列为GPVGLLSSPGSLPPVGGAP。

权利要求

1.一种致病杆菌抗菌肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的致病杆菌抗菌肽在制备抑制病原真菌生长药物中的应用，其中，所述病原真菌为辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、禾谷镰刀菌和/或灰葡萄孢菌。

3.权利要求1所述的致病杆菌抗菌肽在制备抑制细菌生长药物中的应用，其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、番茄疮痂病菌、青枯菌、普通变形杆菌和/或巨大芽孢杆菌。

说明书

致病杆菌抗菌肽及其在抑制病原真菌和细菌生长中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种含有不多于20个氨基酸的肽段。

背景技术

[0002] 抗菌肽是一类具有抗菌活性的多肽类物质，其分子量通常在几百到一万道尔顿之间，氨基酸个数从几个到几十个不等。因为其具有性质稳定、广谱抗菌、且不易产生耐受菌株等诸多优点而备受青睐。另有报道，抗菌肽是先天免疫反应中进化比较保守的一种产物，几乎所有生物都存在抗菌肽。申请人从昆虫病原线虫共生菌中挖掘新结构的抗菌肽，不仅可以提供宝贵的抗菌资源，而且为共生菌的开发利用开辟了新的途径。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种能抑制病原真菌和细菌生长的致病杆菌(Xenorhabdus budapestensis NMC-10)抗菌肽及其应用。

[0004] 一种致病杆菌抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

[0005] 本发明还涉及致病杆菌抗菌肽在抑制病原真菌生长中的应用。

[0006] 本发明致病杆菌抗菌肽在抑制病原真菌生长中的应用，其中所述病原真菌为辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、禾谷镰刀菌和/或灰葡萄孢菌。

[0007] 本发明还涉及致病杆菌抗菌肽在抑制细菌生长中的应用。

[0008] 本发明致病杆菌抗菌肽在抑制细菌生长中的应用，其中所述细菌为枯草芽孢杆菌、番茄疮痂病菌、青枯菌、普通变形杆菌和/或巨大芽孢杆菌。

[0009] 本发明与现有技术不同之处在于提供一种致病杆菌抗菌肽，1.0μg/ml的该抗菌肽用于抑制病原真菌生长时，对辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、禾谷镰刀菌和灰葡萄孢菌的抑制率分别为60.01％、74.00％、49.21％、60.71％；1.0μg/ml的该抗菌肽用于抑制细菌生长时，对枯草芽孢杆菌、番茄疮痂病菌、青枯菌、普通变形杆菌和巨大芽孢杆菌分别能形成19.04±0.2mm、16.47±0.35mm、10.75±0.41mm、10.3±0.33mm、7.3±0.28mm的抑菌圈。

[0010] 下面结合附图对本发明致病杆菌抗菌肽及其在抑制病原真菌和细菌生长中的应用作进一步说明。

附图说明

[0011] 图1是通过不同饱和度的硫酸铵沉淀所获得沉淀物的抑菌活性；

[0012] 图2是NMC-10粗提物进行离子交换层析的层析图，其中“Q穿”表示穿透峰、E1表示第一洗脱峰、E2表示第二洗脱峰；

[0013] 图3A是离子交换层析收集的各组分对辣椒疫霉菌的抑制作用；其中：“总”表示NMC10粗提物，“穿”表示穿透峰组分，E1表示第一洗脱峰组分、E2表示第二洗脱峰组分；

[0014] 图3B是离子交换层析收集的各组分对枯草芽孢杆菌的抑制作用；其中：“总”表示NMC10粗提物，“穿”表示穿透峰组分，E1表示第一洗脱峰组分、E2表示第二洗脱峰组分；

[0015] 图4是离子交换层析收集的各组分进行Tricine-SDS-PAGE的电泳图；其中：“稀释总”表示稀释过的NMC10粗提物，“Q穿”表示穿透峰组分，E1表示第一洗脱峰组分、E2表示第二洗脱峰组分；

[0016] 图5是穿透峰组分进行反相层析的图谱；图中5-10代表反相层析中收集管的编号；

[0017] 图6是反相层析中收集的各组分对辣椒疫霉菌的抑制作用；图中1-10代表反相层析中收集管的编号；

[0018] 图7是将活性最强的收集管5-8中的组分分别稀释2、8、64倍后测定其对辣椒疫霉菌的抑制作用，图中5A、5B、5C分别表示收集管5中的组分稀释2、8、64倍，图中6A、6B、6C分别表示收集管6中的组分稀释2、8、64倍，图中7A、7B、7C分别表示收集管7中的组分稀释2、8、64倍，图中8A、8B、8C分别表示收集管8中的组分稀释2、8、64倍；

[0019] 图8是收集管8中的组分再次进行反相层析的图谱，2C2-12，2D9-12都表示收集管的编号；

[0020] 图9A是再次进行反相层析时收集的各组分进行Tricine-SDS-PAGE的电泳图，2C2-3和2C4都表示收集管编号；

[0021] 图9B是再次进行反相层析时收集的各组分对辣椒疫霉菌的抑制作用；

[0022] 图10是2C2-3继续进行反相层析分离纯化时获得的一个组分质谱图。

具体实施方式

[0023] 实施例1 致病杆菌培养及发酵代谢液制备

[0024] 采用NBTA培养基(营养琼脂45g，氯化三苯基四氮唑0.04g，溴百里酚蓝0.025g溶于蒸馏水1000ml，调节pH至7.2)对致病杆菌NMC10菌株进行型态鉴定，挑取蓝色I型单菌落(I型菌是能吸收培养基中的染料，菌落呈现蓝色；II型菌是不能吸收培养基中的染料，菌落成红色)在TSB培养基(胰蛋白胨1.5g，大豆蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，用100ml蒸馏水配制而成，调节pH为7.2±0.2)中进行摇瓶震荡培养，培养条件为28℃、180rpm培养48h。5000rpm离心去除菌体细胞，上清液用于抗菌肽分离。

[0025] 实施例2 抗菌代谢物的提取

[0026] (1)硫酸铵沉淀

[0027] 对所得上清液进行硫酸铵沉淀，使硫酸铵分别达到不同的饱和度，4℃过夜，12000rpm离心收集沉淀。用适当体积20mMTris缓冲液(pH7.4)对沉淀物进行重悬，再利用透析袋脱盐，先使用蒸馏水、后使用20mMTris缓冲液进行透析，每隔4h更换一次溶液，透析
48小时。透析袋选取截留分子量在8000D-12000D之间，透析的前期由于浓度差较大需要较频繁地更换缓冲液，并且使用干燥剂聚乙二醇(PEG20000)去除样品中过量的水分使透析能更加充分，循环往复直至透析完成。将透析处理后的提取物用直径为0.22μm的滤膜过滤进，所得到的澄清液体即为NMC-10粗提物。以枯草芽孢杆菌为指示菌、用琼脂扩散抑菌圈试验检测不同饱和度硫酸铵沉淀物的抑菌活性，研究结果证明，硫酸铵饱和度为85％左右时，沉淀的蛋白(指一次性加入硫酸铵使饱和度为85％时，沉淀得到的所有蛋白)抑菌活性较高(见图1)。其中本发明中的琼脂扩散抑菌圈法的步骤为：

[0028] 在NA斜面(蛋白胨10g、氯化钠5.0g、牛肉浸出粉3g、琼脂12g、自来水1000ml)上培养指示菌，温度为28℃，待出现菌苔后用0.85％的生理盐水将菌苔洗下并重悬制成菌悬液，在紫外分光光度计下调节菌悬液OD600＝0.33，然后按照1％(体积百分数)的比例添加到抗生素鉴定培养基(蛋白胨5g、氯化钠3.5g、葡萄糖1g、牛肉浸出粉1.5g、磷酸氢二钾3.68g、酵母浸出粉3g、磷酸二氢钾1.32g、水1000ml)上，在平板上均匀打若干个孔，每孔加入20μl待测样品，28℃培养一天观察抑菌圈大小。对照平板只在孔中加入等量的无菌水。

[0029] (2)离子交换层析分离：

[0030] 用离子交换层析分离NMC-10粗提物，层析柱为MONO Q，每次上样5ml，平衡液为20mM的Tris-HCl，洗脱液为20mM的Tris-HCl与1M NaCl，流速1ml/min。梯度洗脱，有一个组分未挂在离子交换柱上，将该组分称为穿透峰，0％-45％这个梯度出现了第一洗脱峰，
45％-100％出现了第二洗脱峰(45％和100％指的是1M的NaCl在洗脱液中所占的体积百分比)，收集穿透峰和两个洗脱峰，分别记为Q穿和E1、E2(见图2)，通过琼脂扩散抑菌圈试验分别测定所得各组分对辣椒疫霉菌和枯草芽孢杆菌的抑制活性(分别见图3A和图3B)。

[0031] 分析层析图并比较层析分离效果与抑菌活性的相关程度，各个组分的积分面积与峰高见表1。

[0032] 表1 阴离子交换层析参数

[0033]

[0034] 由图3(A)和图3(B)可以看出，Q穿和E1对枯草芽孢杆菌和辣椒疫霉菌均有抑制活性，其中以Q穿为主，且对两种指示菌的抑制作用具有很强的相关性(就是说对枯草芽孢杆菌抑制作用好的组份对辣椒疫霉抑制作用也好)。如图4所示，第一洗脱峰E1的蛋白电泳显示有三个主要条带，表观分子量分别在20kD、10kD和3kD左右。但是三个条带的切胶回收组分不再具有之前的抑菌活性。这可能是由于单个蛋白条带不是抑菌活性成分，也可能是起作用的组分并非蛋白组分。值得注意的是总蛋白和穿透峰两个主要活性组分的蛋白条带都有严重的拖尾现象，并且经过100倍的稀释仍然无法去除，这极有可能是因为样品中具有某些复杂结构的组分。从表1可以看出，离子柱的穿透峰面积占总面积的15.43％，根据抑菌圈大小分析，穿透峰的抑菌活性占到总活性的70％以上，因此极有可能活性组分主要在穿透峰中，因此下一步选择收集穿透峰组分进一步分离纯化。

[0035] (3)反相层析纯化

[0036] 反相层析常见于小分子多肽的分离，将穿透峰组分用甲醇或乙腈溶解仍然具有较强的抑菌活性，并且单独的甲醇和乙腈溶剂对枯草芽孢杆菌和辣椒疫霉菌都没有抑制作用，因此下一步分离策略采用将步骤(2)得到的穿透峰组分冷冻干燥后再用有机溶剂重溶，为反相层析准备样品。反相层析的具体条件如下：柱子采用Zorbax SB-C18柱，直径4.6mm、柱长250mm、粒径5μm，进样体积为1000ul，平衡缓冲液为20mM甘氨酸-盐酸，洗脱缓冲液为100％乙腈。多次重复上样并根据峰宽收集组分，反相层析图谱见图5。

[0037] 通过琼脂扩散抑菌圈试验，测定反相层析中不同收集管中的组分对辣椒疫霉菌的抑制作用，检测活性前将样品冷冻干燥后并用无菌水重溶，主要活性组分的抑菌测定结果见图6。从图6中可以看出，活性主要集中在收集管5-8的样品中，为了进一步比较各组分间活性强弱，将收集管5-8中的样品分别稀释2倍、8倍和64倍重新通过琼脂扩散抑菌圈试验测定活性，稀释2倍、8倍和64倍的样品分别记为A、B、C。从图6和图7可以看出，收集管8中的组分为主要活性组分，将8号样品重新进行反相层析，层析具体条件同前，层析结果见图8。

[0038] 收集合并收集管8中的样品再次进行反相层析，通过琼脂扩散抑菌圈实验测定所得各个组分对辣椒疫霉菌的抑制作用(见图9A)，结果发现，收集管中的样品从2C2-3一直到2C12-2D9均具有明显的抑菌活性。对各个样品进行Tricine-SDS-PAGE(见图9B)，发现样品2C2-3和2C4的蛋白条带较为单一，且所有具有活性的样品均含有一条表观分子量在3kD左右的条带，选定这两个样品作为主要活性组分进行重复收集，为下一步精细分离准备样品。

[0039] (4)进一步分离与鉴定

[0040] 将上一步收集的样品2C2-3和2C4重新进行反相层析，反相层析条件同前，在这两个组分中都检测到一个高纯度的组分(见图10)，可以用于生物质谱鉴定。

[0041] 对上述纯化的样品用MALDI-TOF-TOF进行质谱鉴定，用De novo手动拼接的方法获得一个组分的氨基酸序列，即一条含有19个氨基酸组成的肽段，对应的分子量为1657.8444Da，氨基酸序列如下：GPVGLLSSPGSLPPVGGAP，将其命名为GP-19，如氨基酸序列表中的SEQID NO：1所示。

[0042] 将其氨基酸序列到NCBI全库和抗菌肽数据库APD进行BLAST序列分析，未发现相同序列。同源性最高仅为40.9％，数据库的比对结果见表2。

[0043] 表2 GP-19的序列比对结果

[0044]

[0045] 实施例3 合成多肽对病原真菌和细菌的抑制作用

[0046] 将人工合成的GP-19，用无菌水溶解，得到合成多肽溶液，用平板含毒培养基法和琼脂扩散抑菌圈法测定了对4种真菌和5种细菌的抑菌活性，结果表明，该抗菌肽对辣椒疫霉菌和大丽轮枝菌等四种病原真菌和5种细菌均有较好的抑制作用(见表3和表4)。其中，平板含毒培养基法和琼脂扩散抑菌圈法的过程如下所述：

[0047] 平板含毒培养基法：将合成多肽溶液与融化的PDA培养基(马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15克、自来水1000毫升)混合，使终浓度为1.0μg/ml，制成含多肽平板，将培养好的每一种供试真菌菌饼各自移到一个含多肽平板中央，以只添加无菌水、不添加合成多肽溶液的平板为对照，25℃培养5天，测量菌落生长直径，并按照以下公式计算菌落生长抑制率：生长抑制率＝(对照菌落扩展直径-处理菌落扩展直径)/对照菌落扩展直径*100％。

[0048] 琼脂扩散抑菌圈法：在NA斜面(蛋白胨10g、氯化钠5.0g、牛肉浸出粉3g、琼脂12g、自来水1000ml)上培养各种供试细菌，温度为28℃，待出现菌苔后用0.85％的生理盐水将菌苔洗下并重悬制成菌悬液，在紫外分光光度计下调节菌悬液OD600＝0.33，然后按照1％(体积百分数)的比例添加到抗生素鉴定培养基(蛋白胨5g、氯化钠3.5g、葡萄糖
1g、牛肉浸出粉1.5g、磷酸氢二钾3.68g、酵母浸出粉3g、磷酸二氢钾1.32g、水1000ml)上，在平板上均匀打若干个孔，每孔加入20μl待测样品，28℃培养一天观察抑菌圈大小。对照平板只在孔中加入等量的无菌水。

[0049] 表3 1.0μg/ml GP-19对植物病原真菌的抑制作用

[0050]

[0051]

[0052] 表4 1.0μg/ml GP-19对细菌的抑制活性

[0053]

[0054] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。