最新中国发明专利
/
2013-12-04

ING4与OSM双基因共表达载体及其应用转让专利

申请号 : CN201110293713.8

文献号 : CN102352368B

文献日 :

基本信息:

PDF:

法律信息:

相似专利:

发明人 : 杨吉成 , 马士崟

申请人 : 苏州大学

摘要 :

本发明属于腺病毒载体领域，具体公开了一种重组腺病毒载体Ad-ING4-OSM及其制备方法：以转移质粒pAdTrack-CMV-polyA-promoter为基础，并且在其多克隆位点的BglII、SalI之间插有ING4片段，在NotI、HindIII酶切位点之间OSM片段，制得重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM；将所述重组转移质粒与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒采用氯化钙法共转化BJ5183感受态细菌，筛选后经PacI酶切后再用脂质体转染QBI-293A细胞，经多轮感染和扩增后获得重组腺病毒载体Ad-ING4-OSM；该Ad-ING4-OSM组重组腺病毒与Ad-ING4、Ad-OSM单基因组相比对人喉癌Hep-2细胞及其裸鼠移植瘤呈现明显的抑瘤增效协同作用和放疗增敏协同效应；而且对抑制SPC-A1肺腺癌细胞的生长和诱导细胞凋亡呈现叠加的抑癌增效作用。

权利要求 :

1.一种含有ING4和OSM基因的重组转移质粒，所述含有ING4和OSM基因的基因重组转移质粒为pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM；所述基因重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM以转移质粒pAdTrack-CMV-polyA-promoter为基础，并且在pAdTrack-CMV-polyA-promoter的多克隆位点的 Bgl II、Sal I之间插有ING4片段，在Not I、 Hind III酶切位点之间OSM片段。

2. 一种含有ING4和OSM基因的重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体为Ad-ING4-OSM；所述重组腺病毒载体的制备方法为：将权利要求1所述重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒采用氯化钙法共转化BJ5183感受态细菌，筛选后经PacI酶切后再用脂质体转染QBI-293A细胞，经多轮感染和扩增后获得重组腺病毒载体Ad-ING4-OSM。

3. 权利要求1所述重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM或权利要求2所述重组腺病毒载体Ad-ING4-OSM在制备治疗癌症药物中的应用。

4. 权利要求1所述重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM或权利要求2所述重组腺病毒载体Ad-ING4-OSM在制备放疗增敏药物中的应用。

说明书 :

ING4与OSM双基因共表达载体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于腺病毒载体领域，具体涉及一种将ING4和OSM基因插入载体中形成重组载体并以此制备得到的腺病毒载体以及所得腺病毒载体的应用。

背景技术

[0002] 现有技术中，从基因方面着手探讨喉癌发生、发展机制以及治疗方法成为了近年来癌症研究的重点方向之一。肿瘤基因治疗就是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞，使其发挥特定的功能，继而执行对肿瘤的杀伤和抑制作用，或保护正常细胞免受化学治疗和放射治疗的损伤。自1990年Rosenberg等首次利用逆转录病毒载体基因转移技术治疗晚期癌症以来，肿瘤基因治疗有了突飞猛进的发展，越来越多的肿瘤基因治疗药物被批准进入临床试验，基因治疗有望在不久的将来成为肿瘤治疗的又一常规手段。为使众多目的基因具有更高的靶向性，杀伤性与稳定性，在载体选择方面，要从对基因表达的时间长短，靶细胞转导效率，可能产生的毒副作用等方面综合权衡。虽然腺病毒载体在体内应用时仍存在作用时间短等问题，但因其可以感染分裂和非分裂细胞、病毒滴度高、不整合到宿主染色体中、能够同时表达多种基因等优点而被广泛用于肿瘤的基因治疗中。由于肿瘤的发生和发展是一个多阶段、多因素的复杂过程，涉及多种基因的异常，因而多基因联合治疗、从多个环节控制肿瘤的发生和发展往往显得更为合理。
[0003] ING4基因是近年来发现的ING（inhibitor of growth family，肿瘤生长抑制因子）家族成员之一，它由Shiseki等在2003年首次发现得到，后来被确定为一种重要的肿瘤生长抑制因子。ING4基因定位于人染色体12p13.3，大小约13kb，有8个外显子和7个内含子组成，cDNA全长1380bp，编码248个氨基酸，其编码蛋白位于细胞核内，在人类正常组织中均有表达。ING4广泛参与基因转录的调控、细胞的增殖、凋亡和衰老、细胞接触抑制、血管生成抑制、DNA的损伤修复以及肿瘤转移侵袭的抑制。研究表明，ING4基因在多种肿瘤中易发生缺失突变或表达下调，并与肿瘤发生和肿瘤恶性程度密切相关。近年来，不少研究将ING4基因包装进腺病毒，通过腺病毒载体将ING4基因导入人类多种肿瘤细胞中，包括人肺腺癌细胞系A549、前列腺癌细胞、恶性黑色素瘤细胞系M14，结果显示，Ad-ING4感染的肿瘤细胞生长受到抑制，凋亡率明显高于感染空腺病毒载体的细胞组，可见ING4基因表达对肿瘤细胞有抑制生长、诱导凋亡的作用。Gunduz等研究发现ING4基因在头颈部鳞癌中表达有所下降，推断其在头颈部肿瘤中具有重要作用，但其功能与机制尚有待进一步研究。
[0004] OSM(oncostatin M)最初是由Zarling 等从U937组织型淋巴瘤细胞( histiocytic lymp homacells) 培养上清液中分离的一种对A375黑色素瘤细胞有生长抑制作用的细胞因子，隶属于IL-6超家族，该家族成员包括IL-6，IL-11，LIF，ciliary neurotro-phic factor (CNTF)，cardiotropin-1 (CT-1)，novel neutrophin-1/B cell–stimulating factor-3 (NNT-1/BSF-3 )等，他们由于受体结构类似（均含有 gp130 等基本亚单位）而具有相似的功能。由于OSM在结构、功能以及遗传性能上类似于leukemia inhibitory factor (LIF)，因此曾一度被认为是另一种LIF，但OSM亦具有很多独特的性能，包括抑制肿瘤细胞生长，刺激造血，炎症反应、促进巨噬细胞分化，对神经营养肽的诱导作用，调节胆固醇代谢以及对骨细胞的作用。人类抑瘤素M（hOSM）是一种耐热、耐酸的单链糖蛋白，其分子量为28000 ，基因定位于22号染色体q12上，cDNA编码252个氨基酸，它是一种能抑制肿瘤细胞增殖和促进正常成纤维细胞生长的多肽，已报道OSM对黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌等多种实体瘤具有抑制作用，其作用机制可能与下述因素有关：与其受体结合后，通过JAK/STAT信号传导途径，作用于靶基因，如CDKIS的P21WAF1/CIPI，P27KLPI等，使细胞生长阻滞；通过下调癌基因如抑制如c-myc的表达而抑制细胞增殖；或通过免疫效应抑制细胞增殖。目前已经有不少研究利用腺病毒介导OSM基因来进行肿瘤基因治疗，如胰腺癌、肝癌、黑色素瘤。
[0005] 如上所述，ING4是一种新型的肿瘤生长抑制因子，它主要在细胞内发挥抑瘤作用；OSM具有广谱的抑癌效应，主要在细胞外发挥作用；二者一旦发生基因缺失或突变常会导致多种肿瘤的发生。
[0006] 放射治疗是肿瘤治疗的重要方法之一，但即使是治疗剂量的放射线也对人体有不同程度的损伤，这在很大程度上限制了放疗的应用与发展。肿瘤的基因-放射治疗( gene-radiotherapy) 是近年提出的肿瘤治疗新思路，其原理是将辐射诱导基因(radiation-inducible gene)的调控序列与肿瘤杀伤基因相偶联转染进肿瘤细胞，在对肿瘤实施局部照射时诱导基因表达，通过射线与基因的双重作用杀伤肿瘤。肿瘤的基因-放射治疗不但可以进一步提高疗效，还能在保证疗效的前提下降低放射剂量，减少对人体的损伤。研究表明，ING4基因可以提高胰腺癌细胞对放疗的敏感性，OSM基因在黑色素瘤中可以被射线诱导增强表达，从而达到基因与射线的双重抑瘤效果，但ING4以及OSM在喉癌中是否具有放疗增敏效应尚未见报道。
[0007] 综上所述，现有技术中并未见到有关ING4和OSM双基因共表达质粒载体和腺病毒载体的构建和共表达的报道，对ING4和OSM基因共表达的两种蛋白产物，在肿瘤治疗中能否发挥抑制肿瘤细胞及其移植瘤的生长和诱导肿瘤细胞凋亡等的协同或叠加抑癌效应。特别是二者的联合对肿瘤放射治疗能否发挥放疗增敏效应、增强放疗效果，至今国内外均未见报道，为此现已成为当今肿瘤治疗中的研究热点，也是肿瘤治疗中为提高肿瘤治疗的疗效急切需要解决的难题。

发明内容

[0008] 本发明的发明目的是提供一种含有ING4和OSM基因的重组转移质粒、含有ING4和OSM基因的重组腺病毒载体，使得腺病毒介导的ING4和OSM双基因可以在肿瘤细胞中稳定转录及表达，并呈现明显的抑瘤增效协同作用。
[0009] 为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种含有ING4和OSM基因的重组转移质粒，所述含有ING4和OSM基因的重组转移质粒为pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM。
[0010] 上 述 技 术 方 案 中，所 述 重 组 转 移 质 粒 pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM 以 转 移 质 粒 pAdTrack-CMV-polyA-promoter 为 基 础，并 且 在pAdTrack-CMV-polyA-promoter的多克隆位点的 Bgl II、Sal I之间插有酶切扩增出的ING4片段，在Not I、 Hind III酶切位点之间插有酶切扩增出的OSM片段。
[0011] 上述技术方案中，所述重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM的制备方法为：在已有的pAdTrack-CMV-polyA-promoter改造转移质粒基础上，在多克隆位点的 Bgl II、Sal I之间插入酶切的ING4片段，构建pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter单基因重组转移质粒，然后在pAdTrack-CMV- ING4-poly-A-promoter重组转移质粒的Not I、 Hind III酶切位点之间插入酶切扩增出的OSM片段构建得到pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM重组转移质粒。
[0012] 上述技术方案中，pAdTrack-CMV-polyA-promoter改造转移质粒的制备方法可参考文献：.盛伟华,谢宇锋,杨吉成. Ad-ING4-PolyA-Promoter-IL-24双基因共表达载体构建及表达.中华微生物学和免疫学杂志，2010，30（8）：695-703（通迅作者：杨吉成）。
[0013] 进一步的技术方案中，将重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒采用氯化钙法共转化BJ5183感受态细菌，筛选后经PacI酶切后再用脂质体转染QBI-293A细胞，经多轮感染和扩增后获得重组腺病毒载体Ad-ING4-OSM。
[0014] 本发明同时要求保护上述重组腺病毒载体Ad-ING4-OSM。
[0015] 上述重组腺病毒载体Ad-ING4-OSM能抑制肿瘤细胞生长并诱导其凋亡，这种作用显著优于Ad-ING4、Ad-OSM单基因组，而且还呈现明显的抑瘤增效协同作用；因此，本发明要求保护上述重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM、重组腺病毒载体Ad-ING4-OSM在制备治疗癌症药物中的应用；优选地，所述癌症包括：喉癌、肺癌。
[0016] 上述重组腺病毒载体Ad-ING4-OSM在治疗喉癌时具有放疗增敏作用，因此，本发明同时要求保护上述重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM、重组腺病毒载体Ad-ING4-OSM在制备放疗增敏药物中的应用；优选地，所述放疗增敏药物为治疗喉癌的放疗增敏药物。
[0017] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
[0018] 1、本发明成功构建了ING4和OSM双基因共表达腺病毒载体。
[0019] 2、本发明所述Ad-ING4-OSM双基因共表达在体内外均能抑制人喉癌Hep-2细胞及其裸鼠移植瘤的生长并诱导其凋亡，这种作用显著优于Ad-ING4、Ad-OSM单基因组（P<0.05），而且还呈现明显的抑瘤增效协同作用 (Q体外＝1.18,Q体内=1.38) ；在体外能抑制SPC-A1肺腺癌细胞的生长并诱导其凋亡，这种作用显著优于Ad-ING4、Ad-OSM单基因组，而且还呈现明显的抑瘤增效协同作用。
[0020] 3、本发明所述Ad-ING4-OSM双基因共表达更具显著上调P21、P27、Bax、Caspase-3和下调Survivin、Cox-2、Bcl-2等细胞周期和凋亡相关蛋白的表达； Ad-ING4-OSM双基因共表达更具显著下调肿瘤血管形成因子CD34表达的效应。

附图说明

[0021] 附图1.实施例一中ING4和OSM双基因共表达模式示意图；
[0022] 附图2.实施例一中pAdTrack-CMV转移质粒图谱；
[0023] 附图3A.实施例一中pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter重组转移载体构建和鉴定；A：pAdTrack-CMV- ING4-poly-A-promoter重组转移载体质粒PCR鉴定：M: DL2000Marker; 1: ING4目的条带；
[0024] 附图3B.实施例一中pAdTrack-CMV-OSM-polyA-promoter重组转移载体质粒Bgl II、Sal I双酶切鉴定：M: DL2000Marker; 1: 载体质粒条带和ING4目的条带；
[0025] 附图4A.实施例一中pAdTrack-CMV-ING4-polyA+promoter-OSM重组转移载体质粒 PCR鉴定：M: DL2000Marker; 1: OSM目的条带；
[0026] 附图4B.实施例一中pAdTrack-CMV-ING4- polyA+promoter -OSM重组转移载体质粒Not I、Hind III双酶切鉴定：M: DL2000Marker; 1: 载体质粒条带和OSM目的条带；
[0027] 附图5.实施例一中同源重组克隆质粒（BJ5183）琼脂糖电泳分子量大小鉴定，其中，1、2：为pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4- polyA+promoter-OSM同源重组阳性克隆；3：pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4- polyA+promoter-OSM同源重组阴性克隆；4 为pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-CMV-OSM转移质粒；5普通的同源重组质粒；
[0028] 附图6.实施例一中各组基因重组腺病毒感染QBI-293A细胞照片；
[0029] 附图7.实施例一中RT-PCR鉴定ING4和/或OSM基因在QBI-293A细胞中的转录，其中，1.PBS；2.Ad-GFP；3. Ad-ING4；4. Ad-OSM；5.AD-ING4-OSM；6. 2kb DNA Marker；
[0030] 附图8.实施例二中喉癌Hep-2细胞感染病毒后白光与荧光照片；
[0031] 附图9.实施例二中腺病毒介导的ING4和/或OSM基因在喉癌Hep-2细胞中的转录鉴定，其中，1.PBS；2.Ad-GFP；3. Ad-ING4；4. Ad-OSM；5.AD-ING4-OSM；6. 2kb DNA Marker；
[0032] 附图10.实施例二中OSM和ING4蛋白表达的Western blot鉴定，其中，1.PBS；2.Ad-GFP；3. Ad-ING4；4. Ad- OSM；5.Ad-ING4- OSM；
[0033] 附图11.实施例二中不同剂量重组腺病毒对喉癌Hep-2细胞的作用；
[0034] 附图12.实施例二中重组腺病毒对喉癌Hep-2细胞的生长抑制曲线，注：ING4、OSM单基因重组腺病毒组分别与PBS，Ad-GFP组比较， P＜0.05；Ad--ING4-OSM双基因组分别与Ad-ING4、Ad-OSM单基因重组比较，P＜0.05；
[0035] 附图13.实施例二中Hochest33258 染色检测喉癌Hep-2细胞凋亡的核形态学变化（×100）；
[0036] 附图14.实施例二中FCM检测各组腺病毒对喉癌Hep-2细胞细胞周期的影响；注：Ad-ING4、Ad-OSM以及AD-ING4-OSM分别与细胞对照组(PBS组)和Ad-GFP阴性对照组相比，p<0.05；
[0037] 附图15.实施例二中流式细胞仪对喉癌Hep-2细胞凋亡率测定的结果；
[0038] 附图16.实施例二中RT-PCR分析Hep-2细胞P21、P27、P53和Survivin的mRNA转录水平，其中，1.PBS；2.Ad-GFP；3. Ad-ING4；4. Ad-OSM；5.AD-ING4-OSM；
[0039] 附图17.实施例二中喉癌Hep-2细胞凋亡相关基因的半定量分析结果；注：ING4、OSM单基因重组腺病毒组分别与PBS，Ad-GFP组比较， P＜0.05；Ad-ING4-OSM双基因组分别与Ad-ING4、Ad-OSM单基因组比较，ΔP＜0.05；
[0040] 附图18A.实施例三中五组人喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤的瘤体照片，其中，1. Ad-ING4-OSM；2. Ad-OSM；3.Ad-ING4；4. Ad-GFP；5. PBS；
[0041] 附图18B.实施例三中Ad-OSM、Ad-ING4、Ad-ING4-OSM对人喉癌移植瘤移植瘤治疗后体积变化曲线；
[0042] 附图18C.实施例三中各组腺病毒作用后喉癌裸鼠移植瘤平均重量变化；注：ING4、OSM单双基因腺病毒组分别与PBS，Ad-GFP组比较， P＜0.05；Ad-ING4-OSM组分别与Ad-ING4、Ad-OSM单基因重组腺病毒组比较，P＜0.05；
[0043] 附图18D.实施例三中各组腺病毒对喉癌裸鼠移植瘤的抑制率；注：Ad-ING4-OSM组分别与Ad-ING4、Ad-OSM单基因重组腺病毒组比较，P＜0.05，Q=1.38；
[0044] 附图19.实施例四中各组腺病毒对喉癌Hep-2细胞的抑制作用；单纯放疗组、Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒组分别与细胞对照组，Ad-GFP空载体腺病毒组比较，P＜0.05；基因联合放疗组分别与单纯放疗组、Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒组比较，P＜0.05，Q=1.21；
[0045] 附图20A.实施例四中各组腺病毒对喉癌Hep-2细胞相关基因表达变化的影响；其中，1. 细胞对照组；2.Ad-GFP；3. AD-ING4-OSM；4. 8Gy；5. AD-ING4-OSM +8Gy； [0046] 附图20B.实施例四中细胞凋亡相关基因的半定量分析结果；单纯放疗组、Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒组分别与细胞对照组，Ad-GFP空载体腺病毒组比较，P＜0.05；基因联合放疗组分别与单纯放疗组、Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒组比较，P＜0.05；
[0047] 附图21.实施例四中检测各组喉癌细胞细胞周期变化结果；放疗组、Ad-ING4-OSM组以及AD-ING4-OSM+放疗组分别与细胞对照组(PBS组)和Ad-GFP阴性对照组相比，p<0.05；
[0048] 附图22.实施例四中流式细胞仪对喉癌Hep-2细胞凋亡率测定的结果；放疗组、Ad-ING4-OSM组、Ad-ING4-OSM联合放疗组分别与PBS，Ad-GFP组比较， P＜0.05；Ad-ING4-OSM联合放疗组分别与放疗组、Ad-ING4-OSM组比较，P＜0.05；
[0049] 附图23A.实施例四中喉癌裸鼠移植瘤实物图；
[0050] 附图23B.实施例四中喉癌裸鼠移植瘤体积-时间变化曲线；放疗组、Ad-ING4-OSM组、Ad-ING4-OSM联合放疗组分别与PBS，Ad-GFP组比较， P＜0.05；Ad-ING4-OSM联合放疗组分别与放疗组、Ad-ING4-OSM组比较，P＜0.05；
[0051] 附图23C.实施例四中喉癌裸鼠移植瘤平均重量变化；放疗组、Ad-ING4-OSM组、Ad-ING4-OSM联合放疗组分别与PBS，Ad-GFP组比较， P＜0.05；Ad-ING4-OSM联合放疗组分别与放疗组、Ad-ING4-OSM组比较，P＜0.05；
[0052] 附图23D.实施例四中不同因素对喉癌裸鼠移植瘤的抑制率；Ad-ING4-OSM联合放疗组分别与放疗组、Ad-ING4-OSM组比较，P＜0.05，Q=1.17；
[0053] 附图24A.实施例四中各组瘤组织中ING4/OSM表达的检测；
[0054] 附图24B.实施例五中重组腺病毒对凋亡、细胞周期、血管生成相关因子表达的影响；
[0055] 附图25.实施例五中腺病毒介导的ING4和/或OSM基因在SPC-A1肺腺癌细胞中的转录鉴定(RT-PCR)，其中，1.PBS；2.AdV；3.Ad-ING4；4.Ad-OSM；5.Ad-ING4-OSM；
[0056] 附图26.实施例五在SPC-A1肺腺癌细胞中ING4和OSM蛋白表达的Western blotting鉴定，其中，1.Ad-ING4；2Ad-ING4-OSM；3.Ad-OSM；4.Adv；5.PBS；
[0057] 附图27.实施例五中Ad-ING4-OSM等对SPC-A1肺腺癌细胞生长的影响；
[0058] 附图28A.实施例五中PI染色法检测Ad-ING4-OSM对SPC-A1肺腺癌细胞周期的流式测定结果；
[0059] 附图28B.实施例五中PI染色法检测Ad-OSM对SPC-A1肺腺癌细胞周期的流式测定结果；
[0060] 附图28C.实施例五中PI染色法检测Ad-ING4对SPC-A1肺腺癌细胞周期的流式测定结果；
[0061] 附图29.实施例五中流式细胞仪检测Ad-ING4-OSM等对SPC-A1肺腺癌细胞凋亡率测定的结果比较；
[0062] 附图30.实施例五中RT-PCR 检测 SPC-A1细胞中凋亡相关基因，其中，1.PBS；2.Ad；3.Ad-ING4；4.Ad-OSM；5.Ad-ING4-OSM；
[0063] 附图31.实施例五中Western blotting检测SPC-A1细胞中 Caspase-3的表达，其中，PBS；2.Ad；3.Ad-ING4；4.Ad-OSM；5.Ad-ING4-OSM。

具体实施方式

[0064] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
[0065] 实施例一：基因重组腺病毒载体的构建及其检测
[0066] 材料：Bgl II、Sal I、Not I、 Hind III限制性内切酶、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTPmix Oligo d(T)18、DL2000marker、Ribonuclease Inhibitor购自TaKaRa公司；逆转录酶MMLV、Lambda DNA/HindIII marker购自MBI公司；PmeI、PacI购自New EnglandBiolads公司；日常型小量质粒抽提试剂盒、PCR产物清洁试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司；pAdTrack-CMV-ING4-IRES-hOSM质粒、pAdTrack-CMV-poly-A-promoter质 粒、QBI-293A 包 装 细 胞、pAdTrack-CMV-polyA +promoter-OSM质粒、pAdEasy-1骨架质粒、大肠杆菌DH5α、BJ5183细菌、空载体腺病毒Ad-GFP等均为本实验室保存；引物：β-actin、ING4、OSM基因引物（如表1）均由上海Sangon合成；RPMI-1640购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自杭州赛乐生物有限公司；6孔细胞培养板购自CORNING公司； UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉等生化试剂购自上海生工生物技术有限公司。
[0067] 表1 PCR扩增所用引物及其序列
[0068]
[0069] 参 考 文 献：He TC,Zhou S,da Costa LT,Yu J,Kinzler KW,Vogelstein B.A simplified system for generating recombinant adenoviruses.Proc Natl Acad Sci U S A.1998;95(5):2509- 2514.的流程构建腺病毒表达载体，采用双启动子介导的ING4和OSM双基因腺病毒共表达模式，示意图如图1；在已成功构建的pAdTrack-CMV-polyA-promoter改造转移质粒基础上，在多克隆位点（如图2）的 Bgl II、Sal I之间插入ING4片段，构建pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter单基因重组转移质粒，然后在pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter重组转移质粒的Not I、 Hind III酶切位点之间插入OSM片段构建pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-OSM重组转移质粒，具体操作程序如下：
[0070] （一） pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter重组转移质粒的构建：
[0071] 用Bgl II、 Sal I双酶切本科室已构建的pAdTrack-CMV-ING4-IRES-hOSM质粒和pAdTrack-CMV-polyA-CMV（简称空载体：Ad -GFP）质粒5h后，按试剂盒回收方法割胶回收目的片段并纯化；在4℃条件下经T4DNA连接酶连接酶切回收的目的片段；过夜后将连接产物进行转化， 涂布于Kana培养平板上培养，CaCl2法制备DH5a大肠杆菌感受态细胞并转化，+然后挑阳性克隆鉴定；将阳性克隆挑取后接种至5mLLB中，并加入5μLKana 筛选，于37℃摇床中振荡培养过夜，抽提质粒，进行鉴定。
[0072] 上述连接体系如下：
[0073]纯化的双酶切ING4基因片段 8μL
纯化的双酶切pTrack-CMV-polyA-promoter质粒大片段 8μL
10×Buffer 2μL
T4DNA Ligase 2μL
终体积 20μL
[0074] 鉴定的常用方法有2种：PCR鉴定、双酶切鉴定；鉴定结果为：以重组载体pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter质粒为模板，P1、P2为引物PCR能扩增出ING4目的基因片段，其大小与预期扩增的ING4理论值大小（750bp）相一致[图3(A)]； 以Bgl II, Sal I双酶切pAdTrack-CMV- ING4-poly-A-promoter重组转移载体质粒能够释放出约750bp大小的片段[图3(B)]；鉴定结果表明ING4目的基因已经成功亚克隆于pAdTrack-CMV- polyA+promoter质粒中。
[0075] （二） pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM重组转移质粒的构建：
[0076] 用NotI、HindIII分别双酶切构建的pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter质粒和本科室已构建好的pAdTrack-CMV-poly-A-promoter-OSM质粒5h后，按试剂盒回收方法割胶回收目的片段并纯化；在4℃条件下经T4DNA连接酶连接酶切回收的目的片段；过夜后将连接产物进行转化，涂布于Kana培养平板上培养，CaCl2法制备DH5a大肠杆菌感受态细+胞并转化，然后挑阳性克隆鉴定；将阳性克隆挑取后接种至5mLLB中，并加入5μLKana 筛选，于37℃摇床中振荡培养过夜，抽提质粒，进行鉴定。
[0077] 上述连接体系如下：
[0078]纯化的双酶切OSM基因片段 8μL
纯化的双酶切pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter质粒大片段 8μL
10×Buffer 2μL
T4DNA Ligase 2μL
终体积 20μL
[0079] 鉴定结果为：以重组载体pAdTrack-CMV-ING4- polyA+promoter -OSM质粒为模板，P3、P4为引物PCR能扩增出OSM目的基因片段，其大小与预期扩增的OSM理论值大小（750bp）相一致[图4(A)]； 以Not I、 Hind III双酶切pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM重组转移载体质粒能够释放出约750bp大小的片段[图4(B)]；鉴定结果表明OSM目的基因已经成功亚克隆于pAdTrack-CMV- ING4-polyA+promoter质粒中。
[0080] （三） 同源重组腺病毒质粒的构建：
[0081] 将 构 建 的 pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter 和 pAdTrack-CMV- ING4–poly-A-promoter-OSM重组转移质粒用Pme I 37℃单酶切2h线性化后，分别与+pAdEasy-1腺病毒骨架质粒采用氯化钙法共转化BJ5183感受态细菌，用Kana 平板筛选，挑取阳性克隆后抽提质粒，进行琼脂糖电泳，根据分子量大小初步筛选出pAdEasy-l -pAdTrack-CMV-ING4 -poly-A- promoter（简称pAd-ING4-PolyA-Promoter）和pAdEasy-l –pAdTrack -CMV-ING4-poly-A –promoter-OSM(简称pAd-ING4-PolyA-Promoter-OSM)同源重组克隆，再转化DH5a后大量扩增和抽提质粒进行PCR和PacI单酶切鉴定。
[0082] 琼脂糖电泳结果如[图5]所示，同源重组质粒分子量明显大于未同源重组的转移质粒；pAdTrack-CMV-ING4-polyA+promoter-OSM与pAdEasy-1共转化组所挑的5个克隆有2个为阳性克隆（1,2为同源重组阳性克隆，5为阳性对照）结果表明转移质粒与骨架质粒同源重组成功，为重组腺病毒的包装创造了条件。
[0083] （四） 同源重组腺病毒的包装和扩增：
[0084] 将pAd-ING4-PolyA-Promoter同 源 重 组 腺 病 毒 质粒 和 pAd-ING4–polyA –promoter-OSM同源重组腺病毒质粒经PacI酶线性化酶切后，割胶回收大片段，按Lipofectamine2000操作说明分别转染70%QBI-293A（293A）人胚肾细胞中进行包装。3-5d后在荧光显微镜下观察荧光，7-10d后收集细胞悬液，1000r/min离心5min，细胞沉淀以无菌PBS重悬后，将细胞悬液于-80℃和37℃间反复冻融3次，以2000r/min离心5min，得到含有第一代病毒的上清；将此第一代重组腺病毒粗提液在QBI-293A细胞中经过多轮感染和扩增后，即可获得高滴度的重组腺病毒病毒子Ad-ING4-poly-A-promoter(简称Ad-ING4)和Ad-ING4-poly-A -promoter-OSM（简称Ad-ING4-OSM）腺病毒，将得到的病毒置于-80℃保存待用。
[0085] 将pAd-ING4-PolyA-Promoter同 源 重 组 腺 病 毒 质粒 和 pAd-ING4–polyA –promoter-OSM同源重组腺病毒质粒经PacI酶线性化酶切后，胶回收大片段，以LipofectaminTM2000脂质体分别转染QBI-293A包装细胞后，荧光显微镜下可见GFP的表达，且荧光强度随转染后时间延长逐渐增强。转染10d后分别收集第一代重组腺病毒粗提液。以第一代病毒液再感染QBI-293A细胞，二次感染的细胞在倒置显微镜下可观察到荧光，并出现CPE，结果表明重组腺病毒在QBI-293A细胞中包装成功。
[0086] 将第二代重组腺病毒Ad-GFP（本科室已有）、Ad-OSM（本科室已有）、Ad-ING4（已构建）以及Ad -ING4-OSM（已构建）分别感染70%贴壁的QBI-293A细胞，48h后收集细胞，将细胞悬液于-80℃及37℃充分冻融3次，取上清，反复扩增后，病毒保存于-80℃备用。各组腺病毒感染QBI-293A细胞光镜CPE和荧光照片如[图6]所示。
[0087] （五） 重组腺病毒的RT-PCR鉴定：
[0088] 将Ad-ING4和Ad-ING4-OSM腺病毒感染QBI-293A细胞48h后，1000r/min离心5min，收集上述病毒感染后细胞，并同时以单基因Ad-OSM、空病毒载体Ad-GFP感染QBI-293A细胞及未感染病毒的QBI-293A细胞作为对照，PBS洗涤2次，按UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书操作提取各组细胞总RNA，用ING4、OSM及内参β-actin的引物进行RT-PCR，分别鉴定ING4、OSM及内参β-actin在QBI-293A细胞中的转录。
[0089] 反转录合成cDNA：
[0090] 用20μl RT反应体系来合成cDNA第一链，方法如下：
[0091] 1） 取2µg总RNA，加入0.5µg Oligo(dT)18，补DEPC-H2O至12µl，70℃作用 5min，使RNA解螺旋，以利于逆转录；
[0092] 2）加入5×RT Buffer 4µl、10mmol/L dNTPmix 2µl和0.5µl Rnasin inhibitor，37℃作用5min；
[0093] 3）补加 1µl M-MLV逆转录酶至总体积为20μl，置42℃孵育1 h，再置于70℃反应10 min后即得cDNA模板。
[0094] PCR反应：
[0095] 将所得到的cDNA模板与上述引物进行PCR扩增：
[0096]ddH2O 36μl
10×ReactionBuffer(含Mg2+) 5μl
dNTPs(10mmol/L) 1μl
上游引物(50μmol/L) 1μl
下游引物(50μmol/L) 1μl
cDNA模板 5μl
TaqDNA聚合酶 1μl
总共 50μl
[0097] 具体反应条件同上，部分PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
[0098] 收集经Ad-ING4-OSM、Ad-ING4、Ad-OSM、Ad-GFP感染的QBI-293A细胞和未收集经Ad-ING4-OSM、Ad-ING4、Ad-OSM、空病毒载体Ad-GFP感染的QBI-293A细胞和未经感染的QBI-293A细胞，提取其总RNA进行RT-PCR，以P1、P2、P3、P4、P5、P6为引物分别鉴定ING4、OSM和β-actin基因在QBI-293A细胞中的转录和表达（图7）。由图可见，Ad-ING4-OSM感染组可出现预期的目的条带：750bp的ING4条带和750bp的OSM基因条带；Ad- ING4组只出现750bp的ING4基因条带；Ad-OSM组只出现750bp的OSM基因条带；空病毒载体Ad-GFP组和未感染组没有出现ING4和OSM基因条带。RT-PCR结果初步表明成功构建了由腺病毒介导ING4和OSM双基因共表达重组腺病毒表达载体Ad- ING4-OSM。
[0099] （六） 重组病毒效价测定：
[0100] 病毒效价测定时，将生长良好的QBI-293A细胞经胰酶消化后计数，稀释细胞浓度5 -6
为10 个/ml，然后以100µl/孔接种于96孔板上。培养24h后，将收获的重组病毒子按10 -7 -8 -9
、10 、10 、10 稀释，每个稀释度设3个复孔，并按 100µl/孔接种，37℃、5%CO2培养18h后，荧光显微镜下计数，按公式：病毒效价(pfu/ml)=(平均荧光数×10)/相应稀释度，计算病毒效价。
[0101] 重组病毒子按10-6 、10-7 、10-8、10-9稀释，感染QBI-293A细胞18h后，荧光显微镜下计数荧光细胞数目，并按公式：病毒效价(pfu/ml)=(平均荧光数×10)/相应稀释度，计9
算病毒效价。经测定，各组基因重组腺病毒效价均可达10 pfu/ml，满足实验要求。
[0102] 实施例二：Ad-ING4-OSM对人喉癌Hep-2细胞生长抑制效应的实验研究；
[0103] 试剂：已构 建的Ad-ING4、Ad-OSM、 Ad-ING4-OSM和 空病 毒载体 Ad-GFP, RPMI-1640培养基购自GIBCO公司；6孔、24孔和96孔细胞培养板购自CORNING公司；MTT购自美国Sigma公司；新生小牛血清购自杭州赛乐生物科技公司；Trizol试剂盒购自invitrogen公司； MMLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶、dNTPmix、Oligo(dT)18、DNA marker购自TaKaRa；β-actin抗体购自碧云天生物技术研究所；小鼠抗人ING4、小鼠抗人OSM抗体购自abcam公司；硝酸纤维素膜（NC膜）、Western blot化学发光试剂盒和暗盒购自上海普利莱基因技术有限公司；HRP标记的兔抗小鼠IgG二抗购自武汉博士德生物技术有限公司；
Hochest33258染色试剂盒、PI购自南京凯基生物科技发展有限公司；Annexin-v-PE/7-AAD凋亡试剂盒购于Southern Biothech公司；PCR扩增的上下游引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如下表所示：
[0104]
[0105] 细胞株：人喉癌细胞株喉癌Hep-2为本室保存，QBI-293A细胞由复旦大学生命科学学院微生物学教研室钟江教授惠赠，均以含10%小牛血清的1640培养基培养。
[0106] 1.2.1重组腺病毒对人喉癌Hep-2细胞感染效率的测定
[0107] 将生长状态良好的喉癌Hep-2细胞经胰酶消化后计数，以含10%胎牛血清的5
RPMI1640培养基稀释细胞浓度为10 个/ml，然后以100µl/孔（104个/孔）接种于96孔板上，37℃、5%CO2孵箱中培养24h，24小时后吸去原有培养基，然后将基因重组复制缺陷型腺病毒Ad-GFP、Ad-ING4、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM按50、100、150、200 MOI分别感染喉癌Hep-2细胞，加含2%小牛血清的RPMI1640培养基100µl/孔，每个梯度设3个复孔，37℃、5%CO2孵箱中培养48h后显微镜下计数200个细胞，然后换用荧光镜计数荧光细胞数，确定感染百分率。
[0108] 喉癌Hep-2细胞感染病毒后白光与荧光照片参见图8，由图可知：以50、100、150、200、250不同感染复数（MOI）的Ad-GFP感染细胞后，按公式感染率=荧光细胞数/细胞总数计算，其感染率分别为20%、45%、60%、96%、100%。经观测感染复数（MOI）为250的Ad-GFP感染喉癌Hep-2细胞后，细胞发生CPE现象，对细胞增殖抑制率为18.3% ，与细胞对照组增殖抑制率3.5%比较有显著差异（P <0.05），而感染复数为200的Ad-GFP对细胞增殖抑制率为6.9 % ，与细胞对照组增殖抑制率3.5%比较没有显著差异(P>0.05) ，因此确定200MOI为最适感染剂量，后续实验均按此计算所需病后续实验均按此计算所需病毒量；
[0109] 。
[0110] 1.2.2腺病毒介导的外源性ING4和/或OSM基因在喉癌Hep-2细胞中表达的鉴定[0111] 1.2.2.1 RT-PCR检测外源性ING4和/或OSM基因的转录
[0112] 以1.2.1筛选的腺病毒最佳感染剂量（200MOI）的Ad-GFP、Ad-ING4、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM分别感染70%生长状态良好的喉癌Hep-2细胞，37℃、5%CO2孵箱中培养48h后收集细胞，用Trizol法分别抽提总RNA进行RT-PCR检测腺病毒介导的外源性ING4、OSM基因在喉癌Hep-2细胞中的转录。
[0113] RT-PCR步骤：
[0114] 第一步：取3μl总RNA(约5μg)，lμl Oligo(dT)1（8 0.5μg/μl），DEPC-Treated H2O 8μl，混匀，70℃ 5min，立刻放置于冰上冷却。
[0115] 第二步：后依次加入5xReaction buffer 4μl，Ribonuclease inhibitor(20u/μl)lμl，
[0116] dNTPmix 2μl，混匀，37℃ 5min.
[0117] 第三步：加入MMLV逆转录酶1μl至终体积为20μl；42℃作用1h，70℃作用10min，立刻放置于冰上冷却，获得cDNA第一链。
[0118] 各组取cDNA模板1μl，在50μl体系中进行PCR反应，所用引物:ING4(P3、P4)、OSM(P5、P6)和GAPDH（P1、P2）各1μl（25μM），dNTPmix1μl，Taq DNA聚合酶1μl（5U/μl），加双蒸水至终体积为50μl。PCR条件为：94℃预变性2min，94℃变性55s，58℃退火55s，72℃延伸55s，共循环30次，最后72℃后延伸10min。各取RT-PCR扩增产物5μl于琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0119] 利用RT-PCR分别鉴定OSM、ING4、内参照GAPDH基因在喉癌Hep-2细胞中的转录，RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后显示如下（图9）：在2kbDNA Marker左侧，Ad-ING4和Ad -ING4-OSM组的ING4（750bp）、GAPDH（240bp）出现预期大小阳性条带；在2kbDNA Marker右侧，Ad-OSM和Ad -ING4-OSM组的OSM（750bp）、GAPDH出现预期大小阳性条带；而Ad-GFP和PBS组均只有内参照GAPDH出现阳性条带，也未测出细胞自身内源性ING4和/或OSM基因mRNA转录；RT-PCR鉴定结果表明目的基因ING4和/或OSM能在喉癌Hep-2细胞中有效转录。
[0120] 1.2.2.2 Western blot法检测外源性ING4和/或OSM基因的表达
[0121] 按1.2.1筛选的最佳感染剂量为200MOL的腺病毒感染喉癌Hep-2细胞，分为细胞对照组、Ad-GFP组、Ad-OSM组、Ad-ING4组和Ad -ING4-OSM组5组，感染48h后倒掉培养基，7
用预冷的 PBS洗涤2 ～3 次，倒净吸干培养瓶里的液体，然后按10 细胞/ml细胞裂解液的比例加细胞裂解液（含终浓度为1mM PMSF蛋白酶抑制剂），将培养瓶置于冰上裂解30min，要不时晃动使裂解液与细胞充分接触，裂解后用细胞刮子迅速将细胞刮下收集到离心管中，
4℃下12000r/min离心5min，取总蛋白上清，并以4:1的比例与5×SDS蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮沸5min，将样品用分离胶为12％、浓缩胶为6%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳（100V，2h），并200mA，2h将蛋白转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上，NC膜用5％脱脂奶粉
37℃封闭1h；分别用小鼠抗人ING4(1∶1000)和小鼠抗人OSM抗体(1∶1000)在37℃作用2h或4℃下过夜，TBST洗涤3次，每次10min；再分别加HRP标记的兔抗小鼠IgG二抗，
37℃作用2h，TBST洗涤3次，每次10min；最后将NC膜与发光工作液（等体积A和B溶液混合）充分接触，室温孵育3min，暗室进行压片曝光、显影和定影。
[0122] Western blot结果(如图10)显示，Ad--ING4-OSM双基因重组腺病毒感染喉癌Hep-2组可产生24kD的与抗人OSM抗体和29kD的抗人ING4抗体特异性结合的条带；Ad-OSM单基因重组腺病毒感染组只产生24kD的与抗人OSM抗体特异性结合的条带，而相应位置未产生29kD的抗人ING4抗体特异性结合的条带；Ad-ING4单基因重组腺病毒感染组只产生29kD的抗人ING4抗体特异性结合的条带，而相应位置未产生与抗人OSM抗体特异性结合的条带；Ad-GFP空病毒感染组和细胞对照组在相应位置均未出现上述条带。Western blot鉴定结果进一步表明腺病毒介导的ING4、OSM单、双基因重组腺病毒均能介导外源性ING4和/或OSM基因在喉癌Hep-2细胞中成功表达。
[0123] 1.2.3结晶紫染色观察重组腺病毒对喉癌Hep-2细胞的细胞毒性
[0124] 将喉癌Hep-2细胞接种于24孔板，每孔约50000个细胞，加1ml含10%小牛血清的RPMI1640培养基培养过夜，然后换用2%培养基，分别用0、50、100、150、200、250MOI重组腺病毒（Ad-GFP、Ad-ING4、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM）感染细胞，37℃继续培养72h后吸净培养基，用PBS小心洗涤一次，每孔加0.5ml 10％甲醇溶液固定细胞数分钟，吸去甲醇溶液，每孔再加2%结晶紫染液0.5ml，室温中放置15min，轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤2次，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分，干燥拍照。
[0125] 从图11可以看出，24孔板中未加病毒的A1、B1、C1、D1和感染了空病毒的A2-A5孔颜色基本没有变化，空病毒组A6孔颜色略微变浅，而感染了Ad-ING4、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM基因重组腺病毒的喉癌Hep-2细胞颜色随病毒剂量的递增而递减，且感染Ad-ING4-OSM双基因组的颜色变化比Ad-ING4、Ad-OSM单基因组的颜色变化大，说明Ad-GFP空载体腺病毒在200 MOI以内对喉癌Hep-2喉癌细胞几乎无毒性作用，且在相同MOI的条件下，Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒对肿瘤细胞的毒性作用比Ad-ING4、Ad-OSM单基因重组腺病毒强。
[0126] 1.2.4 MTT法检测Ad-ING4和/或OSM单、双基因表达对喉癌Hep-2细胞生长的影响
[0127] 取对数生长期的喉癌Hep-2细胞, 消化计数为50000个/ml，然后按100μl /孔接种96孔板，37℃，5%CO2培养过夜后，共分5个实验组：细胞对照组只加含2%小牛血清的RPMI1640培养基，其它4组除此以外，空病毒阴性对照组加200 MOI Ad-GFP，基因组分别加200MOI Ad-ING4 、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM病毒液，每组各设5个复孔，37℃、5%CO2条件下孵育。随后分别于0d、1d、2d、3d、4d加MTT(5mg/ml) 10μl/孔，继续孵育4-6h后加入溶解剂[10%SDS+ 1%HCl(1mol/L)]100μl/孔，至次日待甲臢结晶完全溶解后，在酶联免疫检测仪上测A570值，绘制生长曲线，并按抑制率(%)＝（对照组A570值－实验组A570值）/ 对照组A570值来计算细胞生长抑制率。
[0128] 200MOI最佳感染剂量的Ad-GFP、Ad-ING4、Ad-OSM、Ad -ING4-OSM感染喉癌Hep-2细胞后，与细胞对照组一起在酶联免疫检测仪上分别测定其0～4天的OD570值，每组5个复孔，取平均值，然后绘制细胞生长曲线，如图12。由图可见，Ad-GFP空载体腺病毒组对喉癌Hep-2细胞生长影响不大，而Ad-ING4、Ad-OSM单基因重组腺病毒、Ad--ING4-OSM双基因重组腺病毒对喉癌Hep-2细胞均有不同程度的生长抑制作用，各组第四天生长抑制率分别为39%、46%和79%左右，与Ad-GFP空载体腺病毒组和细胞对照组比较有统计学意义（P＜0.05＝；而且Ad -ING4-OSM双基因重组腺病毒对喉癌Hep-2细胞的抑制作用明显优于Ad-ING4和Ad-OSM单基因重组腺病毒，差异有统计学意义（P＜0.05）。可见，Ad--ING4-OSM双基因重组腺病毒对喉癌Hep-2喉癌细胞的生长抑制作用明显强于Ad-ING4、Ad-OSM单基因重组腺病毒，有明显的生长抑制增效协同作用（Q=1.18）。
[0129] 1.2.5 Hochest33258核荧光染色
[0130] 取干净的盖玻片置于6孔板中，每孔铺入约50000个喉癌Hep-2细胞，培养24h使细胞爬片，然后分别加入200MOI Ad-GFP、Ad-ING4 、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM，37℃、5%CO2继续培养72h后，取出爬片细胞，用溶液A洗涤细胞爬片2遍，加Hochest33258工作液室温放置10min，PBS冲净晾干，以紫外光340nm波长激发，荧光显微镜下观察凋亡细胞。
[0131] 所得细胞凋亡的核形态变化如图13，由图可见，细胞对照组、Ad-GFP空载体腺病毒组的喉癌Hep-2细胞核形态正常，而Ad-ING4、Ad-OSM和 Ad-ING4-OSM作用于喉癌Hep-2细胞72h后,在荧光显微镜下观察可见细胞核出现深染、固缩，甚至断裂，呈现典型的细胞凋亡核形态学变化，且Ad-ING4-OSM双基因组变化较Ad-ING4/Ad-OSM单基因组组更加明显。
[0132] 1.2.6 PI染色的FCM检测细胞周期
[0133] 按1.2.1筛选的最佳感染剂量（200MOL）的腺病毒分别感染处于对数生长期的喉癌Hep-2细胞，于37℃，5%CO2条件下培养48h，实验分组：细胞对照组、Ad-GFP组、Ad-ING4组 、Ad-OSM组、Ad-ING4-OSM组。步骤如下：
[0134] 1．收集细胞，500～1000r/min离心5min，弃去培养液；
[0135] 2．加1ml Buffer A溶液洗涤2次；
[0136] 3．离心去Buffer A，加入预冷的70％的乙醇重悬固定12h以上；
[0137] 4．离心弃去固定液，0.5mlBuffer A重悬；
[0138] 5．加入0.1ml PI染液，4℃避光染色30min；
[0139] 7．流式细胞仪检测。
[0140] 用200MOI最佳感染剂量Ad-GFP、Ad-ING4、Ad-OSM以及Ad -ING4-OSM分别感染喉癌Hep-2细胞，48h后FCM PI单染检测细胞周期的结果如图16所示， Ad-ING4组喉癌Hep-2细胞在G2/M 期出现明显阻滞, 可达(19.32±3.14)%, 显著高于细胞对照组(PBS组)的G2/M 期(5.51±2.13)%和Ad-GFP阴性对照组的G2/M期(6.23±2.58)% (P <0.05)；Ad-OSM组喉癌Hep-2细胞尽管G2/M 期阻滞不明显，但在G1期出现明显阻滞, 可达(72.57±1.97)%,显著高于细胞对照组(PBS组)的G1期(50.15±1.54)%和Ad-GFP阴性对照组的G1期(52.38±2.37)% (P < 0.05)，且S期细胞比例下降（因此细胞生长受到显著抑制） ； Ad-ING4-OSM双基因重腺病毒组在G2/M 期（17.14±3.59%）和G1期（77.64±3.76%）均出现明显阻滞，并且S期细胞比例也下降，与细胞对照组(PBS组)和Ad-GFP阴性对照组相比，G2/M 期以及G1期均有显著差异(P < 0.05)。
[0141] 1.2.7 Annexin-V-PE/7-AAD双染的FCM检测细胞凋亡
[0142] 采用PE-AnnexinV/7-AAD双荧光标记，流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡的变化。在细胞凋亡早期，位于细胞膜脂质双层内侧的膜磷脂酰丝氨酸可迁移到细胞外层表面。抗凝剂Annexin-V可特异地结合磷脂酰丝氨酸(ps)残基，并且与ps具有很高的亲合力。因此，Annexin-V可作为探针识别细胞膜表面是否有ps，但凋亡细胞由于其细胞膜保持完好，故对7-AAD染料拒染。坏死细胞也可以在细胞膜表面出现ps，但细胞坏死在初始阶段其细胞膜的完整性就被破坏，可被7-AAD着染。因此，在双参数散点图上Annexin-V和7-AAD双阴性代表正常细胞；Annexin-V阳性7-AAD阴性代表凋亡早期细胞；凋亡晚期或坏死细胞则显示Annexin-V和7-AAD双阳性。具体方法如下：按用 200MOI腺病毒最佳感染剂量分别感染处于对数生长期的喉癌Hep-2细胞，分为5组：细胞对照组、Ad-GFP空载体腺病毒组、Ad-ING4单基因重组腺病毒组、Ad-OSM单基因重组腺病毒组、Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒组。37℃ 5% CO2培养72h后收集细胞，PBS清洗2次，用1×binding buffer调节细胞
6 7
至10 ～10 个/ml,取细胞100μl于流式管中，加10μl Annexin-V-PE冰上混匀，避光
15min，再加1×binding buffer 380μl,再加10μl7-AAD,进行流式细胞仪（FCM）检测 。
[0143] 分别用200MOI 最佳感染剂量Ad-GFP空载体腺病毒、Ad-ING4 、Ad-OSM单基因重组腺病毒和Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒感染喉癌Hep-2细胞72h,经Annexin-Ⅴ-PE/7-AAD双染色后FCM检测细胞凋亡率结果显示，如图17可见Ad-ING4、 Ad-OSM单基因重组腺病毒和Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒均能不同程度诱导喉癌Hep-2细胞凋亡，其中凋亡率分别可达(16.21±3.35)%、(19.75±2.61）%和(39.12±2.87）%，与Ad-GFP空载体腺病毒组的（3.59±2.09）%和细胞对照组的（2.48±2.30）%，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒组诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的作用明显强于单基因腺病毒Ad-ING4组和Ad-OSM组，差异有统计学意义（P＜0.05），同时还具有诱导细胞凋亡的协同增效功能（Q=1.18）。
[0144] 1.2.8 RT-PCR分析Bax、Bcl-2、Survivin细胞凋亡相关基因的表达[0145] 取对数生长期的喉癌Hep-2细胞，用 200MOI重组腺病毒分别感染后，换用含2%小牛血清的RPMI1640培养基培养48h，收集细胞，Trizol法分别提取各组细胞总RNA，每组取2μl模板样品，用表1-1中的引物，以GAPDH为内参照进行RT-PCR分别检测Bax、Bcl-2、P21、P27、P53和Survivin基因在喉癌Hep-2细胞中mRNA的转录水平。PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳，并用BandScan4.0软件进行分析。RT-PCR步骤同1.2.2.1。
[0146] 用200MOI最佳感染剂量Ad-GFP、Ad-ING4、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM感染喉癌Hep-2细胞72h后，与细胞对照PBS组相比(如图14)，Ad-GFP组各基因表达变化均不明显， Ad-ING4、Ad-OSM、 Ad-ING4-OSM组的P21、P27基因表达均明显上调， Survivin基因表达均明显下调，且双基因作用明显强于单基因；在P53基因表达上，Ad-ING4对其影响不大，Ad-OSM和Ad-ING4-OSM能显著促进其表达上调，且二者作用相近，可见促进P53表达上调主要是OSM的作用。从电泳条带半定量的灰度分析结果来看（如图15）亦符合上述规律（P<0.05）。
[0147] 1.2.9数据处理
[0148] （1）采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析，所有数据用±s表示，P＜0.05视为差异有统计学意义。
[0149] （2）Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒组的联合抑瘤增效作用是否优于单基因组，结[5]果判断用金正均法 ：Q值= E（A＋B)／（EA＋EB－EA•EB)，式中EA、EB分别为A、B单用之效应，分子E（A＋B)代表实测合并效应，分母是期望合并效应。当Q值=1±0.15时，两效应被认为有相加作用；Q值＞1.15时，两效应被认为有协同作用；Q＜0.85时,两效应被认为有拮抗作用。
[0150] 上述MTT和FCM结果显示， Ad-ING4-OSM双基因共表达在体外能抑制喉癌Hep-2细胞的生长，引起G2/M期阻滞，促进细胞凋亡，其作用不仅显著优于Ad-ING4、Ad-OSM单基因组（P<0.05），而且还呈现明显的抑瘤增效协同作用；RT-PCR半定量分析检测发现，ING4和OSM均能上调P21、P27的表达，ING4对P53作用不明显，OSM还能上调P53的表达，此外，ING4与OSM还能下调survivin的表达，上述作用中，Ad-ING4-OSM的作用均显著优于Ad-ING4、Ad-OSM单基因组（P<0.05）。可见Ad-ING4-OSM双基因共表达腺病毒载体体外对喉癌Hep-2细胞有更加明显的抑瘤增效作用。
[0151] 实施例三：Ad-ING4-OSM对裸鼠人喉癌移植瘤生长抑制效应的实验研究[0152] 试剂及实验动物：Ad-GFP、Ad-ING4、Ad-OSM和Ad-ING4-OSM腺病毒载体；RPMI-1640培养基购自GIBCO公司；小牛血清购自杭州四季青公司；腺病毒扩增细胞QBI-293A由复旦大学生命科学学院微生物学教研室钟江教授惠赠；人喉癌Hep-2细胞为本室保存；96孔细胞培养板购自CORNING公司；BALB / c裸鼠,雌性, 4-5周龄, 18～22 g购于上海斯莱克实验动物有限责任公司；ING4、OSM、P21、P27、Cox-2、Bcl-2、Survivin、Bax、Caspase-3、CD34抗体购自购自福州迈新生物技术公司；即用型免疫组织化学超敏UltraSensitiveTM SP试剂盒（鼠/兔）购自福州迈新生物技术公司；DAB购自Sigma公司；
盖玻片和载玻片购自上海生工生物技术服务有限公司；10%福尔马林购自上海化学试剂公司。
[0153] 1.2.1 人喉癌Hep-2细胞荷瘤裸鼠模型的建立
[0154] 将人喉癌Hep-2细胞于含10%的小牛血清的RPMI-1640培养基中，37℃，5%CO2细胞培养箱内培养，待细胞长至指数生长期，经胰酶消化，然后用PBS洗涤2次，1000r/min离7 6
心5min，重悬于PBS中，调整细胞浓度为1-2×l0/ml，取100μl(1-2×l0 个细胞/只)分别接种于25只裸鼠右前肢腋下, 无特定病原体SPF (specific-pathogen free,SPF)环境下饲养：无菌复合维生素B标准饲料饲养，隔日更换垫料、饮用水。垫料及其它与裸鼠接触的物品均经过高压或辐射灭菌处理。每日以自然昼夜光线照射，每日紫外线照射4h，室温稳定于23℃~28℃，相对湿度为40%~60%。每日定时观察移植瘤瘤体生长情况。
[0155] 裸鼠接种喉癌Hep-2细胞3-4天后皮下开始出现实性结节并逐渐增大，约15天左3
右瘤体可增大至80-100 mm，25只裸鼠全部成瘤，成瘤率100%，且裸鼠生长状况良好。将25只裸鼠随机分为5组： PBS组、Ad-GFP组、Ad-ING4组、Ad-OSM组和Ad-ING4-OSM组，每组
5只，然后给予腺病毒药物瘤体内多点注射干预用药，100μl/只，隔日一次，共注射5次，在此期间，Ad-ING4-OSM组有一只裸鼠被咬死，其余裸鼠皮肤干燥，无明显皮疹出现，粪便色泽和形态、食欲以及行为无明显变化，生长状况良好，处死后肉眼和镜下观察各脏器亦无明显病变。
[0156] 1.2.2实验分组及给药方法
[0157] 将25只裸鼠随机分成5个治疗组即PBS组、Ad-GFP空载体腺病毒组、Ad-ING4单基因重组腺病毒组、Ad-OSM单基因重组腺病毒组和Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒组，每3
组5只。约2周左右移植瘤可长至60-80 mm 左右，此时计为第0 d，开始进行病毒药物注射，各组腺病毒均使用瘤体内多点注射干预用药，100μl/只。四组病毒组每次给药剂量为
8
1×10pfu，隔日一次，共注射5次。
[0158] 每次治疗后测量肿瘤体积实物变化如图18A，体积变化趋势如图18B。由图18A和18B可见，PBS组与Ad-GFP 空载体腺病毒组对喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤没有明显的抑制作用，而Ad-ING4、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM单、双基因重组腺病毒对喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤均有不同程度的抑制作用，且与PBS组、Ad-GFP 空载体腺病毒组比较有统计学意义（P＜0.05）；Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒组对喉癌裸鼠移植瘤的体内抗肿瘤效应明显优于Ad-ING4、Ad-OSM单基因重组腺病毒组，差异有统计学意义（P＜0.05）。
[0159] 治疗结束后，裸鼠拉颈处死，完全剥离瘤体标本称重其重量和抑瘤率分别如图18C和18D，由图18C可见，Ad-ING4、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM单、双基因重组腺病毒治疗组瘤重（g）分别为（0.69±0.08）、（0.68±0.06）、（0.25±0.05），与PBS组的（1.18±0.10）和Ad-GFP组的（1.11±0.07）比较有统计学意义（P＜0.05）。由图18D可见，Ad-ING4、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM单、双基因重组腺病毒的抑瘤率分别为：26.3%、27.1%和63.6%，Ad-ING4-OSM明显优于Ad-ING4、Ad-OSM组，差异有统计学意义（P＜0.05），而且还呈现明显的抑瘤增效协同效应（Q=1.38）。
[0160] 1.2.3肿瘤体积、瘤重、抑瘤率及标本免疫组织化学的检测
[0161] 每次治疗时同步测量各组裸鼠移植瘤最大径(A) 及垂直径(B) ，并利用下列公3 2
式计算肿瘤体积大小(V ) ：V ( mm ) = A ×B / 2。结束治疗后第4d将裸鼠处死，摘取瘤体称重，计算抑瘤率。抑瘤率(%)=[1－实验组平均瘤重/对照组平均瘤重]×100%。
根据抑瘤率，并利用金正均法Q=E(A+B)/[EA+(1-EA)×EB]计算Q值判断两药的联合效应，其中E(A+B)为两药合用的抑制率，EA、EB为两药单用的抑制率，Q为0.85-1.15表示两药作用相加，Q＞1.15表示两药作用协同，Q＜0.85表示两药相互拮抗。
[0162] 肿瘤组织标本10%中性甲醛固定过夜，常规石蜡包埋，用于进行组织HE染色和免疫组织化学检测。
[0163] 五组瘤组织病理切片，常规HE染色后镜下观察发现：PBS对照组和Ad-GFP空载体腺病毒组喉癌细胞排列紧密，生长旺盛，结构完整，异型性明显。而Ad-ING4组、Ad-OSM组和Ad-ING4-OSM组瘤组织中可见较多凋亡细胞，表现为细胞核固缩或裂解、胞浆浓缩、胞膜不完整，组织间有较多空泡形成，可见到凋亡小体。
[0164] 对喉癌裸鼠移植瘤瘤组织进行病理切片检测ING4/OSM，结果表明，PBS组、Ad-GFP空载体腺病毒组未见ING4/OSM明显表达；Ad-ING4组、Ad-ING4-OSM组喉癌细胞中ING4均呈阳性表达，Ad-OSM组未见ING4明显表达；Ad-OSM组、Ad-ING4-OSM组喉癌细胞中OSM均呈阳性表达，Ad-ING4组未见OSM明显表达。将各组治疗组喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤瘤组织切片进行免疫组化检测研究裸鼠体内抗喉癌效应潜在的分子机制。免疫组化检测的指标包括细胞周期和细胞凋亡相关因子P21、P53、Bax、Bcl-2、Cox-2、Caspase-3以及CD34。结果为：与PBS组和Ad-GFP组相比，Ad-ING4组、Ad-OSM组、Ad-ING4-OSM组均能明显上调细胞周期和细胞凋亡相关因子P21、P53、Bax、Caspase-3的表达和下调Cox-2、Bcl-2以及CD34的表达，差异有统计学意义（P<0.05）；Ad-ING4-OSM组较Ad-ING4组、Ad-OSM组作用更加显著，差异有统计学意义（P<0.05）。
[0165] 1.2.4统计学处理
[0166] 采用SPSS17.0统计软件包进行单因素方差分析，所有数据用±s表示，P＜0.05视为差异有统计学意义。
[0167] 结果表明，Ad-ING4、Ad-OSM及Ad-ING4-OSM在裸鼠体内均可抑制Hep-2细胞喉癌移植瘤的生长，且ING4与OSM二者之间具有明显的协同抑瘤增效作用。
[0168] 实施例四：Ad-ING4-OSM双基因共表达对人喉癌放疗增敏的体内外实验研究[0169] 试剂及实验动物:Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒载体和Ad-GFP空载体腺病毒，喉癌Hep-2细胞株为本室保存，QBI-293A细胞为复旦大学钟江教授惠赠。MTT购自美国Sigma公司；新生小牛血清购自杭州赛乐生物科技公司；Trizol试剂盒购自invitrogen公司； MMLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶、dNTPmix、Oligo(dT)18、DNA marker购自TaKaRa；各基因 PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如表1-1；ING4、OSM抗体购自abcam公司，β-actin抗体购自碧云天生物技术研究所；碘化丙锭（PI）购自南京凯基生物科技发展有限公司； Annexin-v-PE/7-AAD凋亡试剂盒购于Southern Biotech公司；BALB / c裸鼠,雌性, 4-5周龄, 18～22g购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。
[0170] 照射条件:
[0171] 体外：由苏州大学辐照中心提供：国产60Coγ辐照灭菌装置，剂量率2Gy/min，源板距2.85m。
[0172] 体内：由苏州大学附属第一医院肿瘤放疗科提供：西门子KD-2型直线加速器5MeV 电子线，源瘤距100 cm，剂量率为2Gy/min。照射时选用3 mm 厚的铅板屏蔽实验动物瘤体以外部位。
[0173] 1.2.1 MTT法检测Ad-ING4-OSM联合放疗对喉癌Hep-2细胞生长的抑制作用[0174] 取对数生长期的喉癌Hep-2细胞, 消化计数，按0.5×104个/孔接种96孔板，37℃，5%CO2培养过夜后，分为以下5组：细胞对照组、Ad-GFP空载体腺病毒组、Ad-ING4-OSM 双基因重组腺病毒组、单纯放疗组、Ad-ING4-OSM 双基因重组腺病毒联合放疗组。单纯放疗组以8Gy γ-射线照射后继续培养，Ad-ING4-OSM 双基因重组腺病毒联合放疗组（联合组）即按100 MOI Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒最佳感染剂量感染后以8Gy γ-射线照射后继续培养48h，MTT检测以上各组0-4d的细胞生长活力，并绘制生长曲线。
[0175] MTT法检测各实验组对喉癌Hep-2细胞的细胞抑制率，结果如图19A和19B所示，至第四天，Ad-GFP对喉癌Hep-2细胞基本没有抑制作用，8Gyγ-射线对喉癌Hep-2细胞抑制率为29.0%，Ad-ING4-OSM对喉癌Hep-2细胞抑制率为55.1%，当Ad-ING4-OSM和8Gy γ-射线共同处理细胞后，对喉癌Hep-2细胞抑制率为82.6%，明显高于γ-射线和Ad-ING4-OSM单独应用的抑制率，且呈现放疗增敏的协同效应（Q=1.21）。
[0176] 1.2.2 RT-PCR分析P21、P27、P53、survivin细胞凋亡相关基因的表达[0177] 实验分为细胞对照组、Ad-GFP空载体腺病毒组、Ad-ING4-OSM 双基因重组腺病毒组、单纯放疗组、Ad-ING4-OSM 双基因重组腺病毒联合放疗组五组，细胞对照组加PBS作为对照，Ad-GFP空载体腺病毒组、Ad-ING4-OSM 双基因重组腺病毒组分别加入最佳感染剂量100MOL的病毒，单纯放疗组给予8Gy γ-射线照射，Ad-ING4-OSM 双基因重组腺病毒联合放疗组的细胞按100 MOI Ad-ING4-OSM最佳感染剂量感染后以8Gy γ-射线照射，如上处理后，37℃、5%CO2孵箱中培养48h后收集细胞，用Trizol法分别抽提总RNA进行RT-PCR检测腺病毒介导的外源性ING4、OSM基因在喉癌Hep-2细胞中的转录。
[0178] RT-PCR分析喉癌Hep-2细胞基因表达的变化如图20A，与细胞对照组相比，Ad-GFP对基因表达变化影响不大，而单纯放疗组、Ad-ING4-OSM组以及Ad-ING4-OSM联合放疗组的P21、P27、P53表达均明显上调，survivin表达则明显下调。与单纯放疗组、Ad-ING4-OSM组相比，Ad-ING4-OSM联合放疗组对基因表达变化的影响更加明显，图20B的灰度分析也不难看出，Ad-ING4-OSM联合放疗组对P21、P27、P53、survivin基因的表达变化的影响明显优于单纯放疗组和Ad-ING4-OSM组。
[0179] 1.2.3 PI染色的FCM检测Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒联合放疗对喉癌Hep-2细胞细胞周期的影响
[0180] 实验分组及处理方法同前，然后于37℃，5%CO2条件下培养48h，PI染色的FCM检测细胞周期。喉癌Hep-2细胞处理48h后FCM PI单染检测细胞周期结果如图21，由图可以看出，单纯放疗组能够使喉癌Hep-2细胞在G2/M 期出现明显阻滞，可达(21.31±1.87)%，显著高于细胞对照组(PBS组)的G2/M 期(5.51±2.13)%和Ad-GFP阴性对照组的G2/M期(6.23±2.58)% (P < 0.05)；Ad-ING4-OSM组、Ad-ING4-OSM联合放疗组能够使喉癌Hep-2细胞在G2/M 期和G1期均出现明显阻滞，G2/M 期阻滞分别为（17.14±3.59）%% 和(25.91±1.54)%，显著高于细胞对照组(PBS组)的G2/M 期(5.51±2.13)%和Ad-GFP阴性对照组的G2/M期(6.23±2.58)% (P < 0.05)；G1期阻滞分别为（77.64±3.76）%和（72.43±2.16）%，显著高于细胞对照组(PBS组)的G1期(50.15±1.54)%和Ad-GFP阴性对照组的G1期(52.38±2.37)% (P < 0.05)。
[0181] 1.2.4 Annexin-V-PE/7-AAD双染FCM检测AD-ING4-OSM双基因重组腺病毒联合放疗对喉癌Hep-2细胞凋亡的影响
[0182] 实验分组及处理方法同前，然后于37℃ 5% CO2培养72h后收集细胞，进行流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡。Annexin-Ⅴ-PE/7-AAD双染FCM检测细胞凋亡率结果如图22，由图可见，细胞对照组和Ad-GFP组细胞基本没有凋亡，二者凋亡率分别仅为(1.89±1.27)%和(3.58±1.35)%；放疗组、Ad-ING4-OSM组、Ad-ING4-OSM联合放疗组均能诱导喉癌Hep-2细胞凋亡，其凋亡率分别可达(25.27±2.58)%、(30.28±1.95)%和(56.83±2.06)%，与Ad-GFP组和细胞对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），而且Ad-ING4-OSM联合放疗组促细胞凋亡作用明显高于单纯放疗组及Ad-ING4-OSM组，差异有统计学意义（P＜0.05），且呈现诱导细胞凋亡的协同增效功能（Q=1.19）。
[0183] 1.2.5人喉癌Hep-2细胞荷瘤裸鼠模型的建立、分组及干预
[0184] 取对数生长期的喉癌Hep-2细胞经胰酶消化分散后，PBS洗涤2次，1000r/min离7 6
心5min，重悬于PBS中,调整细胞浓度为1-2×l0/ml，按100μl/只(2×l0 个细胞/只)
3
分别接种于25只裸鼠右侧腹股沟皮下，SPF环境下饲养。约2周后待移植瘤长至80-100 mm左右时，计为第0d。将其随机分成5组，即PBS组、Ad-GFP空载体腺病毒组、Ad -ING4-OSM双基因重组腺病毒组、单纯放疗组、Ad -ING4-OSM双基因重组腺病毒联合放疗组，每组5只，给药方式及剂量同第三部分。单纯放疗组于第0天、联合放疗组于病毒治疗48h后以200 mg/kg的剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，仰卧固定于自制解剖板上，充分暴露局部肿块， 射野充分包括肿瘤。定位后体表标记，精确摆位后开始放疗，肿瘤局部接受单次5MeV电子线8Gy照射，源瘤距100 cm，剂量率为2Gy /min。小鼠腹股沟局部照射时选用3 mm 厚的铅板屏蔽身体其他部位。
[0185] （1）PBS细胞对照组：第0天瘤体内注射PBS 100μl，隔日1次，连续治疗5次；
[0186] （2）Ad-GFP空载体腺病毒组：第0天瘤体内注射Ad-GFP（108pfu/次）100μl，隔日1次，连续治疗5次；
[0187] （3）Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒组：第0天瘤体内注射Ad-ING4-OSM（108pfu/次）100μl，隔日1次,连续治疗5次；
[0188] （4）单纯放疗组：第0天肿瘤局部接受单次5MeV电子线8Gy照射；
[0189] （5）Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒+放疗组：第0天瘤体内注射AD-ING4-OSM8
（10pfu/次）100μl，隔日1次,连续治疗5次，第一次病毒注射后肿瘤局部接受单次5MeV电子线8Gy照射；
[0190] 结果发现：裸鼠皮下接种喉癌Hep-2细胞3-4天后，皮下逐渐长出实性结节，约153
天左右瘤体可增大至80-100 mm，25只裸鼠全部成瘤，成瘤率100%。在治疗期间，裸鼠皮肤干燥，无明显皮疹出现，粪便色泽和形态、食欲以及行为无明显变化，生长状况良好，处死后肉眼和镜下观察各脏器亦无明显病变。
[0191] 1.2.6 肿瘤标本的处理
[0192] （1）测量肿瘤体积：每次治疗时用游标卡尺测量各组裸鼠移植瘤最大径(A) 及垂3 2
直径(B) ，并利用下列公式计算肿瘤体积大小(V ) ：V ( mm ) = A ×B / 2。 [0193] （2）测量瘤重，计算抑瘤率：结束治疗后第2d将裸鼠拉颈处死，完整剥离肿瘤后称重，按公式抑瘤率(%)=[1－实验组平均瘤重/对照组平均瘤重]×100%计算抑瘤率，然后[1]
利用金正均法 Q=E(A+B)/[EA+(1-EA)×EB]计算Q值判断两药的联合效应，其中E(A+B)为两药合用的抑制率，EA、EB为两药单用的抑制率，Q为0.85-1.15表示两药作用相加，Q＞
1.15表示两药作用协同，Q＜0.85表示两药相互拮抗。
[0194] （3）HE染色：肿瘤组织标本10%中性甲醛固定过夜，常规石蜡包埋，用于进行组织HE染色。
[0195] （4）免疫组化检测：石蜡切片利用免疫组化法检测ING4、OSM、P21、P53、Cox-2、Bcl-2、Bax、Caspase-3、CD34等因子的表达，初步研究潜在的分子机制。每张切片200倍光镜下观察，共记数10个视野进行统计分析。
[0196] 结果发现：观测PBS组、Ad-GFP组、单纯放疗组、Ad-ING4-OSM组、Ad-ING4-OSM联合放疗组裸鼠喉癌移植瘤的体积和重量变化情况（实物图23A，体积-时间变化曲线如图23B，重量变化如图23C，抑瘤率如图23D）。由图23A和23B可见， PBS组和Ad-GFP 空载体腺病毒组对喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤没有明显的抑制作用，单纯放疗组、Ad-ING4-OSM组、Ad-ING4-OSM联合放疗组对喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤与PBS组和Ad-GFP 空载体腺病毒组相比均有不同程度的抑制作用，比较有统计学意义（P＜0.05＝；Ad-ING4-OSM联合放疗组对喉癌裸鼠移植瘤的体内抗肿瘤效应明显优于单纯放疗组、Ad-ING4-OSM组，差异有统计学意义（P＜0.05＝。瘤体标本称重其重量和抑瘤率分别如图23C和23D，由图23C可见，单纯放疗组、Ad-ING4-OSM组、Ad-ING4-OSM联合放疗组瘤重（g）分别为（0.63±0.09）、（0.59±0.07）、（0.23±0.06），与PBS组的（1.39±0.08）和Ad-GFP组的（1.31±0.06）比较有统计学意义（P＜0.05＝。由图23D可见，单纯放疗组、Ad-ING4-OSM组、Ad-ING4-OSM联合放疗组的抑瘤率分别为：26.6%、29.5%和55.4%，Ad-ING4-OSM联合放疗组明显优于单纯放疗组、Ad -ING4-OSM组，差异有统计学意义（P＜0.05），而且还呈现明显的抑瘤增效协同效应（Q=1.17）。
[0197] 五组瘤组织病理切片，常规HE染色后镜下观察，结果发现：PBS对照组和Ad-GFP空载体腺病毒组肿瘤细胞排列紧密，生长旺盛，结构完整，异型性明显。而Ad-ING4-OSM组、单纯放疗组和Ad-ING4-OSM联合放疗组瘤组织中可见较多凋亡细胞，表现为细胞核固缩或裂解、胞浆浓缩、胞膜不完整，组织间有较多空泡形成，可见到凋亡小体。
[0198] 对喉癌裸鼠移植瘤瘤组织进行病理切片检测ING4/OSM，结果表明，PBS组、Ad-GFP空载体腺病毒组以及单纯放疗组未见ING4/OSM明显表达；Ad-ING4-OSM组 、Ad-ING4-OSM联合放疗组喉癌细胞中ING4和OSM均呈阳性表达(见图24 A) 。将各组治疗组喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤瘤组织切片进行免疫组化检测研究裸鼠体内抗喉癌效应潜在的分子机制(见图24B )。免疫组化检测的指标包括细胞周期和细胞凋亡相关因子P21、P53、Bax、Bcl-2、Cox-2、Caspase-3以及CD34。由图可见，与PBS组和Ad-GFP组相比，放疗组、Ad-ING4-OSM组、Ad-ING4-OSM+放疗组均能明显上调细胞周期和细胞凋亡相关因子P21、P53、Bax、Caspase-3的表达和下调Cox-2、Bcl-2以及CD34的表达，差异有统计学意义（P<0.05）；Ad-ING4-OSM+放疗组较放疗组、Ad-ING4-OSM组作用更加显著，差异有统计学意义（P<0.05）；Ad-ING4-OSM+放疗组可能通过参与上述分子机制来发挥阻滞肿瘤细胞周期进程、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生长的作用。
[0199] 1.2.7数据处理
[0200] （1）采用SPSS17.0统计软件包进行单因素方差分析，所有数据用±s表示，P＜0.05视为差异有统计学意义。
[0201] （2）Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒联合放疗组的放疗增敏效应结果判断用金正[10]均法 （计算Q值），Q值= E（A＋B）／（EA＋EB－EA•EB），式中EA、EB分别为A、B单用之效应，分子E（A＋B）代表实测合并效应，分母是期望合并效应。当Q值=1±0.15时，两药间被认为有相加作用，Q值＞1.15时，两药间被认为有协同作用，当Q＜0.85时，两药间有拮抗作用。
[0202] 上述免疫组化检测结果显示，Ad-ING4-OSM联合放疗组更能明显上调细胞周期和细胞凋亡相关因子P21、P53、Bax、Caspase-3的表达和下调Cox-2、Bcl-2和CD34的表达，具有放疗增敏作用。
[0203] 实施例五：Ad-ING4-OSM对SPC-A1肺腺癌细胞的作用
[0204] 1 重组腺病毒的扩增及其效价的测定
[0205] 将腺病毒感染QBI-293A细胞后，次日在倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光，48h后细胞变圆，呈葡萄状聚集，脱落，出现明显的细胞病理效应(CPE)，收集细胞，反复冻
8
融。重组病毒子经多轮感染后，检测效价均达到10 pfu/ml。反复冻融。重组病毒子经多
8
轮感染后，检测效价均达到10 pfu/ml。
[0206] 2 RT-PCR鉴定ING4和/或OSM基因在QBI-293A细胞中的转录
[0207] 提取四种病毒感染48h后的QBI-293A细胞总RNA进行RT-PCR，其产物琼脂糖凝胶电泳后显示，在750bp位置可检测到OSM特异性条带，750bp位置可检测到一条ING4特异性条带，结果表明Ad-ING4-polyA-promoter，Ad-polyA-promoter-OSM及Ad-ING4-polyA-promoter-hIL-24均在QBI-293A细胞中成功转录。
[0208] 3. ING4和/或OSM重组腺病毒感染SPC-A1肺腺癌细胞
[0209] ING4,OSM单、双基因重组腺病毒分别感染SPC-A1（50MOI）细胞72h后，能产生明显的由腺病毒介导的ING4和/或OSM单、双基因表达产物所引起的细胞毒性；Ad-GFP空载体腺病毒在相同剂量感染SPC-A1细胞均生长良好。
[0210] 4. RT-PCR检测Ad-ING4-OSM感染SPC-A1肺腺癌细胞目的基因的转录，结果参见图25，RT-PCR鉴定结果表明polyA-promoter介导的ING4、OSM单、双基因重组腺病毒均能介导外源性ING4和/或OSM基因在SPC-A1细胞中成功转录。
[0211] 5.Western blotting法鉴定Ad-ING4-hIL-24感染SPC-A1肺腺癌细胞后目的基因的表达，结果参见图26，结果表明Ad-ING4-hIL-24感染SPC-A1肺腺癌细胞后目的基因成功表达。
[0212] 6. Ad-ING4-hIL-24等对SPC-A1肺腺癌细胞的生长抑制作用
[0213] Ad-ING4、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM单、双基因重组腺病毒对SPC-A1细胞均有不同程度的抑制作用且呈时间依赖性，与Ad-GFP空载体腺病毒组和细胞对照组比较均呈显著性差异（P＜0.01），Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒对SPC-A1细胞的细胞毒作用明显优于Ad-ING4、Ad-OSM单基因重组腺病毒（P＜0.01），且优于放疗组。由图27可见腺病毒介导的ING4和/或OSM单、双基因表达均具有特异性抑制肺癌细胞生长的作用，Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒对SPC-A1细胞的细胞毒作用较Ad-ING4、Ad-OSM单基因重组腺病毒呈现明显的叠加抑癌增效作用（Q=0.93）。
[0214] 7. 流式细胞术PI染色法检测Ad-ING4-OSM等对SPC-A1肺癌细胞周期的影响，参见图28A、28B、28C的结果可知： Ad-ING4、Ad-OSM和Ad-ING4-OSM重组腺病毒感染SPC-A1细胞在G2/M期出现阻滞，分别为（13.95±1.36）%、（15.85±2.16）%及（20.33±1.01）%，显著高于阴性对照组的G2/M期（9.38±0.21）%和空白对照组的G2/M期（7.82±0.68）%（P＜0.05），结果显示双基因组G2/M 期细胞比例明显高于单基因组（P＜0.05），由图也可知Ad-ING4、Ad-OSM和Ad-ING4-OSM各实验组的G1期细胞比率减少，分别为（50.17±1.72）%、（52.21±2.95）%及（38.70±2.91）%，与阴性对照组及空白对照组的G1期细胞比率（68.75±1.86%、79.51±2.89%）比较均明显减少（P＜0.05）。
[0215] 8. Annexin-V-P/7-AAD双染法流式检测Ad-ING4-hIL-24等对SPC-A1肺腺癌细胞凋亡的影响，结果参见图29，由图可知：Ad-ING4-OSM及Ad-GFP作用后，SPC-A1细胞凋亡率分别为（30.6±2.02）％和（3.09±1.97）％，PBS组及放疗组的凋亡率分别为（1.89±0.55）％和（23.04±1.98）％，Ad-ING4-OSM组与Ad-GFP组及PBS组相比凋亡率明显升高（P＜0.01），Ad-ING4-OSM双基因组凋亡率明显高于Ad-ING4(16.38±1.63%)及Ad-OSM(19.23±1.71)%单基因组（P＜0.01），具有叠加抑癌增效作用。
[0216] 9. RT-PCR检测P27，P53和Survivin基因的转录情况，结果参见图30，由图可知：与PBS组和AdV组相比，Ad-ING4,Ad-OSM, Ad-ING4-OSM组SPC-A1细胞中的P27和P53基因转录明显上调，而Survivin基因转录明显下调；且Ad-ING4-OSM双基因重组腺病毒对SPC-A1肺癌细胞周期和凋亡相关基因转录的影响较Ad-ING4、Ad-OSM单基因重组腺病毒更为显著。
[0217] 10. Western blotting 检测 Caspase-3 的表达情况，结果参见图31，由图可知：AdV、PBS 、Ad-ING4、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM组的蛋白电泳凝胶中产生35kD 的Pro-caspase-3条带；而 Ad-ING4、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM组的蛋白电泳凝胶中产生19kD酶解条带, 并能与抗Cleaved Caspase-3 抗体结合后呈现特异性条带, 而Ad-GFP组和PBS 组则在相应位置均未出现上述条带。Western blotting 检测结果显示Ad-ING4、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM基因表达在SPC-A1细胞中激活 Caspase-3 并产生19 kD 的活化 Cleaved Caspase-3片段。结果表明Ad-ING4、Ad-OSM、Ad-ING4-OSM组可能是通过激活 Caspase-3诱导SPC-A1细胞凋亡的。