本发明提供一种制备D-酪氨酸的化学酶法。该方法以DL-酪氨酸为原料，在酸性介质中利用酰化剂衍生为DL-N-苯乙酰酪氨酸，以固定化青霉素酰化酶为生物催化剂，对映选择性水解为L-酪氨酸、苯乙酸和D-N-苯乙酰酪氨酸。D-N-苯乙酰酪氨酸酸解为苯乙酸和D-酪氨酸。D-酪氨酸收率为40%，对映体过量>99%。本发明提出的方法具有收率和光学纯度高，过程简单等特点，适合D-酪氨酸的规模化生产。
1.一种制备D-酪氨酸的化学-酶法，其特征是以DL-酪氨酸为原料，在酸性介质中采用酰化剂衍生得到DL-N-苯乙酰酪氨酸，以固定化酶为生物催化剂，在水介质中对映选择性催化DL-N-苯乙酰酪氨酸为D-N-苯乙酰酪氨酸、苯乙酸和L-酪氨酸,D-N-苯乙酰酪氨酸酸解为苯乙酸和D-酪氨酸,经浓缩、萃取、等电点调节、结晶、过滤、干燥得到D-酪氨酸；
1）DL-N-苯乙酰酪氨酸制备：在50～80℃和pH2～3条件下，以醋酸为反应介质，摩尔比为1：1～3的DL-酪氨酸与酰化剂搅拌反应10～20h；反应完成后用盐酸调pH1～2，析出DL-N-苯乙酰酪氨酸固体；
2）DL-N-苯乙酰酪氨酸酶催化水解：在20～40℃和pH8～10条件下，0.1～0.5mol/L DL-N-苯乙酰酪氨酸在固定化青霉素酰化酶催化下水解10～20h；固定化青霉素酰化酶与DL-N-苯乙酰酪氨酸的质量比为1：3～10，反应完成后，浓盐酸调pH1～2，析出苯乙酸和D-N-苯乙酰酪氨酸；
3）D-酪氨酸制备：D-N-苯乙酰酪氨酸在氮气保护下，在3～8mol/L盐酸水溶液中，温度90～115℃下酸解3～15h，酸解液浓缩至盐酸水溶液的1/5～1/10，用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取苯乙酸三次，水相调pH5.6，冷冻析出D-酪氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种制备D-酪氨酸的化学-酶法，其特征是步骤1）中DL-酪氨酸衍生为DL-N-苯乙酰酪氨酸的酰化剂为苯乙酸、苯乙酸甲酯、苯乙酰氯或苯乙酰溴。
3. 根据权利要求1所述的一种制备D-酪氨酸的化学-酶法，其特征是步骤3）中D-N-苯乙酰酪氨酸的酸解在氮气保护下，采用3～8mol/L浓盐酸，酸解温度90～115℃，时间3～15h。
4.根据权利要求1所述的一种制备D-酪氨酸的化学-酶法，其特征是步骤3）中酸解液用活性炭脱色，脱色液用乙酸乙酯萃取，水相用氨水或氢氧化钠调pH至等电点5.6，0～
5℃下,静置过夜，抽滤后滤饼用少量去离子水洗涤，烘干得到D-酪氨酸。
一种制备D-酪氨酸的化学-酶法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种制备D-酪氨酸的化学酶法，属于生物催化制备手性药物中间体技术领域。
背景技术
[0002] D-酪氨酸是一种非蛋白源手性氨基酸，在手性药物合成中具有广泛用途。例如，以D-酪氨酸为手性中间体合成的多肽药物阿托西班是一种保胎药，合成的脱乙酰茴香霉素具有抗原虫、抗变形虫、抗真菌、抗肿痛、防止植物真菌病的作用，合成的多肽药物用于恶性肿瘤的治疗具有特殊疗效，还可用于对肺部、中枢神经系统、关节、心内膜、眼、耳、皮肤、肠胃、泌尿系统炎症具有极好疗效的消炎药等。
[0003]
[0004] D-酪氨酸的制备方法主要有化学拆分法、生物拆分法、不对称转换法等。
[0005] 1）化学拆分法。文献（J.Bio.Chem.,1946,166(1),1.）报道了一种采用番木鳖碱拆分DL-N-乙酰酪氨酸制备D-酪氨酸的方法，收率31滤后滤饼用少量去离子水洗涤，烘干得到D-酪氨酸22.5g33%。何佺等（CN1569818）公开了一种采用L-酒石酸拆分DL-酪氨酸乙酯制备D-酪氨酸的方法，收率25%。化学拆分的主要缺点是存在L-酪氨酸的夹带现象，不仅拆分收率低，而且D-酪氨酸的光学纯度差，拆分工艺复杂。
[0006] 2）生物拆分法。专利（EP119275）公开了一种利用海因酶/氨甲酰水解酶制备D-酪氨酸的方法。海因酶选择性催化水解DL-5-羟苄海因为D-N-甲酰酪氨酸，同时实现L-5-羟苄海因消旋化。氨甲酰水解酶催化D-N-甲酰酪氨酸水解为D-酪氨酸。吕志贤等15
（CN101153300）公开了了一种利用L-氨基酰化酶催化DL- N-乙酰酪氨酸水解制备用于药
15
物代谢研究的示踪剂-D- N-酪氨酸的方法。马云峰等（CN1900298）公开了一种利用固定化D-氨基酰化酶催化DL-N-乙酰酪氨酸制备D-酪氨酸的方法。海因酶法需要化学合成DL-5-羟苄海因，成本较高。氨基酰化酶法采用游离形式的酶，不能循环使用，尤其是D-氨基酰化酶，价格非常高，不适合D-酪氨酸的规模化生产。
[0007] 3）不对称转化法。马云峰等（CN1876631）公开了一种制备D-酪氨酸的不对称转换法。在水杨醛存在下，DL-酪氨酸、L-酒石酸在丙酸中形成D-酪氨酸·L-酒石酸盐，然后解盐得到D-酪氨酸，总收率大于60%。不对称转换法制备D-酪氨酸的缺点是D-酪氨酸·L-酒石酸盐中容易夹带少量的L-酪氨酸·L-酒石酸盐，致使产品的光学纯度不高，此外，共存的L-酒石酸很难完全去除。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种新的制备D-酪氨酸的化学酶法。利用高对映选择性的固定化青霉素酰化酶拆分DL-N-苯乙酰酪氨酸，得到L-酪氨酸、苯乙酸和D-N-苯乙酰酪氨酸，D-N-苯乙酰酪氨酸酸解为苯乙酸和D-酪氨酸。技术路线如下：
[0009]
[0010] 本发明包括下列步骤：
[0011] 1）DL-N-苯乙酰酪氨酸制备：在50～80℃和pH2～3条件下，以醋酸为反应介质，摩尔比为1：1～3的DL-酪氨酸与酰化剂搅拌反应10～20h；反应完成后用盐酸调pH1～2，析出DL-N-苯乙酰酪氨酸固体；
[0012] 2）DL-N-苯乙酰酪氨酸酶催化水解：在20～40℃和pH8～10条件下，0.1～0.5mol/L DL-N-苯乙酰酪氨酸在固定化青霉素酰化酶催化下水解10～20h；固定化青霉素酰化酶与DL-N-苯乙酰酪氨酸的质量比为1：3～10，反应完成后，浓盐酸调pH1～2，析出苯乙酸和D-N-苯乙酰酪氨酸；
[0013] 3）D-酪氨酸制备：D-N-苯乙酰酪氨酸在氮气保护下，3～8mol/L盐酸水溶液中，温度90～115℃下酸解3～15h，酸解液浓缩至盐酸水溶液体积的1/5～1/10，用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取苯乙酸三次，水相调pH5.6，冷冻析出D-酪氨酸。
[0014] 本发明的有益效果
[0015] 与现有技术相比，本发明提出的方法具有以下优点：1）以酸性条件替代碱性条件制备DL-N-苯乙酰酪氨酸，避免了酪氨酸羟基苯乙酸酯的形成，简化了后续的酶催化反应；2）固定化青霉素酰化酶高度的对映选择性，保证D-酪氨酸的高光学活性； 3）无效对映体L-酪氨酸的循环拆分和固定化青霉素酰化酶的循环使用，大大降低了过程成本。
