红参皂苷Rg3组和Rh2组混合皂苷的制备方法

摘要

本发明公开一种红参皂苷Rg3组和Rh2组混合皂苷的制备方法，是用人参根中提取的不含皂苷、含有人参自身皂苷酶和其他水溶性物质的提取物，与原人参二醇类皂苷Rb1、Rb2、Rc或Rd单体或者混合物皂苷反应，制备由20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5红参皂苷组成的Rg3组皂苷；与人参皂苷F2反应，制备由20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3红参皂苷组成的Rh2组皂苷。Rg3组和Rh2组混合红参皂苷比Rg3和Rh2等单体皂苷对人体更安全，活性更高，可用于人参制品、保健品和化妆品和其他药物开发。

权利要求

1.一种红参皂苷Rg3组和Rh2组混合皂苷的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：a. 人参根（以干物计算）中加入6~10倍的65~80%乙醇，50~75℃提取皂苷，重复2~3次；

提取皂苷后的滤渣中再加入6~10倍水（以干物计算），60~80℃提取人参自身酶及水溶性物质，重复2~3次；将所提取的人参自身酶及水溶性物质在品温65℃以下减压浓缩、得到波美

58~62度的提取液，既为人参自身酶及水溶性物质的提取物；

b. 向所得人参自身酶及水溶性物质的提取物中加入原人参二醇类Rb1、Rb2、Rc或Rd单体或者其混合物、或者F2皂苷，加入量与人参自身酶及水溶性物质的提取物的重量比是

1：0.1~20，所述原人参二醇类Rb1、Rb2、Rc或Rd单体或者其混合物、或者F2皂苷的反应浓度为0.1~10%；反应后分离皂苷。

2.根据权利要求1所述红参皂苷Rg3组和Rh2组混合皂苷的制备方法，其特征在于所述b步骤的反应过程中还加有有机酸，有机酸的加入量为反应体积的0.01~50%。

说明书

红参皂苷Rg3组和Rh2组混合皂苷的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种活性高、毒性小，对人体更安全的由红参稀有皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5等四种组成的Rg3组混合皂苷、由红参稀有皂苷20(S)-Rh2、
20(R)-Rh2、Rk2和Rh3等四种组成的Rh2混合皂苷的制备方法。

背景技术

[0002] 人参皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5等四种，20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3等四种是红参中存在的红参稀有皂苷。红参加工过程中白参的原人参二醇类的Rb1、Rb2、Rc或Rd在人参自身酶与其他物质的作用下转化为20(S)-Rg3和20(R)-Rg3皂苷，进一步脱水20(S)-Rg3和20(R)-Rg3皂苷的20-碳上的羟基，形成顺反结构的Rg5和Rk1皂苷，形成Rg3组皂苷。同样，红参加工过程中白参的原人参二醇类的Rb1、Rb2、Rc和Rd在人参自身酶与其他物质的作用下转化为20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3皂苷，形成Rh2组皂苷（发明专利ZL 200510136799.8：高活性红参的制作方法）。

[0003] Rg3组和Rh2组混合皂苷比Rg3、Rg5、Rh2、Rh3单体皂苷对人体更安全，毒性少；Rg3组和Rh2组中四种结构相似的皂苷起协同作用，比单体皂苷生理活性更高，对人参制品、保键食品和化妆品以及药物开发意义很大。但是从红参中分离提取由20(S)-Rg3、
20(R)-Rg3、Rk1和Rg5等四种皂苷组成的Rg3组皂苷，分离提取由20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3等四种皂苷组成的Rh2组皂苷，难度很大，迄今为止没有相关报道。

发明内容

[0004] 本发明是从参根中提取含有人参自身皂苷酶和其他水溶性物质的提取物（不含皂苷、简称人参自身酶及水溶性物质的提取物），与原人参二醇类Rb1、Rb2、Rc或Rd单体或者其混合物、或者F2皂苷反应，制备活性高、毒性小，对人体更安全的由红参稀有皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5等四种组成的Rg3组混合皂苷、由红参稀有皂苷20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3等四种组成的Rh2混合皂苷。

[0005] 本发明的技术解决方案是：一种红参皂苷Rg3组和Rh2组混合皂苷的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：a. 人参根（以干物计算）中加入6~10倍的65~80%乙醇，50~75℃提取皂苷，重复2~3次；
提取皂苷后的滤渣中再加入6~10倍水（以干物计算），60~80℃提取人参自身酶及水溶性物质，重复2~3次；将所提取的人参自身酶及水溶性物质在品温65℃以下减压浓缩、得到波美
58~62度的提取液，既为人参自身酶及水溶性物质的提取物；
b. 向所得人参自身酶及水溶性物质的提取物中加入原人参二醇类Rb1、Rb2、Rc或Rd单体或者其混合物、或者F2皂苷，加入量与人参自身酶及水溶性物质的提取物的重量比是
1：0.1~20，所述原人参二醇类Rb1、Rb2、Rc或Rd单体或者其混合物、或者F2皂苷的反应浓度为0.1~10%；反应后分离皂苷。

[0006] 所述b步骤的反应过程中还加有有机酸，有机酸的加入量为反应体积的0.01~50%。

[0007] 本发明工艺方法简单，可从人参根中提取活性高、毒性小，对人体更安全的由红参稀有皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5等四种组成的Rg3组混合皂苷、由红参稀有皂苷20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3等四种组成的Rh2混合皂苷，可广泛应用于人参制品、保键食品和化妆品以及药物等开发。

附图说明

[0008] 图1是本发明实施例1Rg3组HPLC检测图谱。

[0009] 图2是本发明实施例1Rg3组进行UPLC-Q/TOF检测图谱。

[0010] 图3是本发明实施例1Rg3组进行UPLC-Q/TOF检测，ESI+正模式下总离子流图谱。

[0011] 图4是本发明实施例1Rg3组进行UPLC-Q/TOF检测，ESI-负模式下总离子流图谱。

[0012] 图5是本发明实施例1Rg3组中第一峰的离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析的质谱图。

[0013] 图6是本发明实施例1Rg3组中第二峰的离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析的质谱图。

[0014] 图7是本发明实施例1Rg3组中第三峰的离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析的质谱图。

[0015] 图8是本发明实施例1Rg3组中第四峰的离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析的质谱图。

[0016] 图9是本发明实施例1Rg3组中第一峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。

[0017] 图10是本发明实施例1Rg3组中第二峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。

[0018] 图11是本发明实施例1Rg3组中第三峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。

[0019] 图12是本发明实施例1Rg3组中第四峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。

[0020] 图13是本发明实施例2Rh2组HPLC检测图谱。

[0021] 图14是本发明实施例2Rh2组进行UPLC-Q/TOF检测图谱。

[0022] 图15是本发明实施例2Rh2组中第一峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。

[0023] 图16是本发明实施例2Rh2组中第二峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。

[0024] 图17是本发明实施例2Rh2组中第三峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。

[0025] 图18是本发明实施例2Rh2组中第四峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。

具体实施方式

[0026] 实施例1：参根中含有人参自身皂苷酶（C Zhang, H Yu, Y Bao, L An, F Jin（金凤燮）：Chem. Pharm. Bull., 2001， 49(7), 795-798.； Process BioChem.,2002, 37, 793-798.）。本发明从人参根中提取不含皂苷、含有人参自身皂苷酶和其他水溶性物质的提取物（人参自身酶及水溶性物质的提取物），与原人参二醇类的Rb1、Rb2、Rc或Rd单体或者其混合物反应，制备由20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5等四种皂苷组成的Rg3组皂苷；与人参皂苷F2反应，制备由20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3等四种皂苷组成的Rh2组皂苷。

[0027] 1、人参根的人参自身酶及水溶性物质的提取物的制备：新鲜人参3.5公斤（相当于1公斤干参）切成2毫米厚的片，加入8升的95%的乙醇，在
50-60℃提取人参皂苷6小时，分离提取液；其渣中再加入8升的70-75%的乙醇提取，共提取3次；合并乙醇提取液，用于制备人参皂苷。人参皂苷提取过的渣中加入8升水，在75℃以下提取6小时，同样方法共提取3次；合并提取液，品温在60℃以下减压浓缩至波美60度，离心除渣、得到200-300毫升人参自身酶及水溶性物质的提取物，用于Rg3组和Rh2组红参皂苷的制备。

[0028] 也可以用生晒干燥人参：切成2毫米厚片的1公斤生晒干燥人参中，加入8升的70-75%的乙醇，在50℃提取人参皂苷6小时；同样方法共提取3次；合并乙醇提取液，用于制备人参皂苷。人参皂苷提取过的渣中加入8升水，在75℃以下提取6小时，同样方法共提取3次；合并提取液，品温在60℃以下减压浓缩至波美60度，离心除渣、得到200-300毫升人参自身酶及水溶性物质的提取物，用于Rg3组和Rh2组红参皂苷的制备。

[0029] 几次试验，原料可以是人参、也可以是西洋参或者三七参的鲜参或者干参。人参根（以干物计算）中加入6-10倍的65-80%乙醇、在50-75℃提取皂苷，可重复3次；提取皂苷的渣中再加入干渣的6-10倍水在60-80℃提取，重复2-3次；所提取的水溶性物质，在品温65℃以下减压浓缩，均得到所需要的人参根的复合物酶及水溶性物质提取物。

[0030] 2、Rg3组红参混合皂苷的制备：50克的原人参二醇类的Rb1、Rb2、Rc和Rd混合皂苷加入于300毫升水中，研磨，再加入
100毫升的上述1的人参自身酶及水溶性物质的提取物和600毫升的水，在80℃反应6小时，110℃灭酶0.5-1小时，几乎所有的原人参二醇类的Rb1、Rb2、Rc和Rd混合皂苷转化为红参皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5混合皂苷。其反应液经1升的大孔树脂（HP-20大孔树脂，日本三菱公司产；或者AB-8大孔树脂，天津南开大学产）柱吸附皂苷，再用8升的水洗掉未吸附的糖和渣；再用6升的75-80%乙醇洗脱皂苷，其洗脱液减压浓缩、干燥得36克的20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5混合皂苷，即得Rg3组红参混合皂苷。

[0031] 几次上述反应中，使用原人参二醇类的Rb1、Rb2、Rc或Rd单体皂苷，其结果与使用Rb1、Rb2、Rc和Rd混合皂苷效果相同；制备中，人参皂苷的反应浓度0.1-10%，人参皂苷与人参自身酶及水溶性物质的提取物（人参根干品原料计算）的反应比例（重量）是1：0.1-20倍，反应温度70-120℃，均得到良好的效果。

[0032] 原人参二醇类Rb1、Rb2、Rc和Rd单体或者其混合皂苷可在市场上购买。

[0033] 实施例1所得Rg3组红参皂苷，用高效液相色谱法（HPLC）和超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-Q/TOF）确认。

[0034] 1）Rg3组红参混合皂苷的确认：Rg3组红参皂苷测定的高效液相色谱仪，美国waters 2695仪器；检测器，Photodiode Array Detector Waters 2996；Knauer C18色谱柱（250mm×3mm）；流动相，乙腈（A）-水（B）；0~35min，19%A等度；35~55min，19%A~29%A线性梯度；55~65min，29%A~40%A线性梯度；
65~95min，40%A~100%A线性梯度；进样量，10μL；柱温，35℃；体积流速，0.6mL/min；检测波长，203nm。

[0035] 取上述Rg3组混合皂苷2毫克，溶解于1毫升的甲醇中，经0.45μm滤膜过滤，高效液相色谱（HPLC）检测结果，与标准品20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5皂苷比较，如图1所示。

[0036] 从图1中可以看到，与标准品皂苷相比较，Rg3组含有20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5四种皂苷，总含量90%以上；各皂苷含量比（峰面积比）为 20(S)-Rg3：20(R)-Rg3：Rk1：Rg5 = 29：26：21：24。

[0037] 2）超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-Q/TOF）核对Rg3组的四种皂苷：TM
超高效液相色谱-质谱联用分析仪：UPLC-Q/TOF Premier Micromass (Waters) 仪器；色谱柱：BEH shield RP18 (2.1×100mm，1.7μm，Waters)。超高效液相色谱-四级杆串联质谱联用检测在UPLC-Q/TOF PremierTM Micromass (Waters) 仪器完成。ESI源，正、负离子模式下，“V”模式下进行检测。

[0038] 超高效液相色谱（UPLC）检测条件：流动相为（A）0.1%甲酸-乙腈——（B）0.1%甲酸-水；梯度洗脱：0~5min，5%A~95%A线性梯度，5~10min，95%A等度。进样量，10μL；流速，0.5 mL/min；柱温，30℃；检测波长，203nm。

[0039] 四级时间飞行串联质谱（Q/TOF）检测条件：毛细管电压，2.5kv；样品孔电压，35v；离子源温度，100℃；脱溶剂气温度，350℃；锥孔气流速，50L/hr；脱溶剂气流速，1000L/hr；
质量扫描范围，100-1000Da。

[0040] Rg3组中20(S)-Rg3和20(R)-Rg3皂苷分子式为C42H72O13；分子量为784；Rg5和Rk1分子式，C42H70O12；分子量，766。

[0041] 上述的Rg3组样品进行UPLC-Q/TOF检测，得到的图谱如图2、3、4所示。

[0042] 从图2、3、4中可以看出，Rg3组样品的UPLC图谱有四个明显的紫外吸收峰，和图1的HPLC检测的20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5的紫外吸收峰一致，其保留时间依次为
3.77、3.83、4.43、4.49（min）。在正、负离子模式下，通过串联质谱（Q/TOF）检测、得到Rg3组样品的总离子流图，也有四个峰，其和UPLC图谱有四个明显的紫外吸收峰一致，保留时间分别为3.81、3.87、4.46、4.51（min）。

[0043] 由此，可以进行总离子流各峰的一级质谱分析，确定Rg3样品中各物质的分子量。

[0044] （1）Rg3组人参稀有皂苷在ESI+正模式下的一级质谱分析首先对Rg3组第一、第二的离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析，得到的一级质谱如图5、6所示。

[0045] 20(S)-Rg3和20(R)-Rg3的分子量为784；从图5、6中可以看出，在ESI+正模式+下，使第一、第二峰物质分子上加了一个H，形成了m/z为785的准分子离子峰，即[M+H]。
m/z767离子是为m/z785离子峰失去一分子H2O产生的碎片；m/z 605离子为m/z785离子峰失去末端的葡萄糖基，再失去一分子H2O产生的碎片；m/z461离子为m/z785离子峰失去两个葡萄糖基所产生的碎片；m/z443、m/z425、m/z407离子为m/z461碎片再依次失去一分子H2O产生的碎片； 因此第一、第二峰物质的分子量为784；可确定为第一峰为20(S)-Rg3；
第二峰为20(R)-Rg3。

[0046] 再对Rg3组的第三、第四离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析，得到的一级质谱如图7、8所示。

[0047] Rk1和Rg5的分子量为766；从图7、8中可以看出，在ESI+正模式下，使第三、第四+峰的物质的分子加上了一个H，形成了m/z为767的准分子离子峰，即[M+H]。m/z785离子+
峰归属于ESI+模式下形成的[M+H2O]。m/z749离子是m/z767离子峰失去一分子H2O所产生的碎片；m/z 605离子为m/z767离子峰失去末端的葡萄糖所产生的碎片；m/z587离子是m/z605离子峰再失去一分子H2O所产生的碎片；m/z443离子是m/z767离子峰失去两个葡萄糖基所产生的碎片；m/z425和m/z407离子是m/z443碎片再依次失去一分子H2O所产生的碎片。由此得到第三、第四峰物质的分子量为766；可确定为Rk1和Rg5皂苷。

[0048] （2）Rg3组人参稀有皂苷在ESI-负模式下进行一级质谱分析首先对Rg3组的第一、第二离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析，得到的一级质谱如图9、10所示。

[0049] 20(S)-Rg3、20(R)-Rg3分子量为784；从图9、10中可以看出，在ESI-负模式下形—成 [第一、第二峰物质+HCOOH] 离子峰，而负离子模式下又减少一个H，所以通过Q/TOF得到的离子峰m/z 829；其物质丢失一甲基后生成核离子碎片m/z 783。故可判断，样品中含有20(S)-Rg3和20(R)-Rg3，其分子量为784。

[0050] 再对Rg3组的第三、第四离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析，得到的一级质谱如图11、12所示。

[0051] Rk1和Rg5的分子量为766；从图11、12中可以看出，在ESI-负模式下，形成[第—三、第四峰物质+HCOOH] 离子峰，而负离子模式下又减少一个H，所以第三、第四峰得到离子峰m/z 811，其丢失一甲基后生成核离子碎片m/z765。故可判断，样品中含有Rk1和Rg5，其分子量为766。

[0052] 由此重新证明，所制备的Rg3组中含有20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5等四种红参稀有皂苷；结构式分别为：经过几次试验，所制备的Rg3组中20(S)-Rg3和20(R)-Rg3在Rg3组总皂苷中的含量比例的范围20-80%。

[0053] 实施例2：Rh2组红参皂苷的制备：用实施例1的人参自身酶及水溶性物质的提取物与人参皂苷F2反应，制备Rh2组混合皂苷。

[0054] 制备Rh2组皂苷所需的原料人参皂苷F2，以专利和文献（欧洲专利EP1354944、美国专利US7,759,101B2、文献H Yu… F Jin: Chem Pharm. Bull., 2007, 55, 231-235.）中方法制备的，即用人参皂苷酶I型酶，转化原人参二醇类的Rb1、Rb2、Rc和Rd混合物制备的。100克的原人参二醇类皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd混合皂苷溶解于1000毫升的0.02M、pH5的醋酸缓冲液中，与（按上述专利、文献方法曲霉菌发酵得到的）人参皂苷酶I型酶液1000毫升混合，在40℃搅拌反应20-24小时，加入预先处理过的2升的大孔树脂（树脂HP-20，日本三菱产品）、轻轻搅拌一小时、使皂苷吸附于大孔树脂中，用去离子水洗掉酶蛋白和糖等杂质，装到3000毫升的柱中，再用10升水洗柱中的杂质，再用12升的75%的乙醇洗脱皂苷；其洗脱液用1%活性碳脱色，过滤，减压浓缩、干燥，得到含量为75%的80克的F2皂苷粗品；
再经硅胶柱分离得到含量为90%以上的50克F2皂苷，用于Rh2组红参皂苷的制备。

[0055] 25克的人参皂苷F2加入于150毫升水中，研磨，再加入实施例1的100毫升人参自身酶及水溶性物质的提取物和300毫升的水，在80℃搅拌反应8小时，在110℃灭酶1小时，几乎所有的人参皂苷F2转化为由红参皂苷20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3组成的Rh2组皂苷。其反应液经0.5升的大孔树脂（HP-20大孔树脂，日本三菱公司产；或者AB-8大孔树脂，天津南开大学产）柱吸附皂苷，用4升的水洗掉未吸附的糖和渣；再用6升的80-84%乙醇洗脱皂苷，其洗脱液减压浓缩、干燥得17克的20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3混合皂苷，即Rh2组混合皂苷。

[0056] 上述反应中，人参皂苷F2的反应浓度0.1-10%，人参皂苷F2与人参自身酶及水溶性物质的提取物（人参根干品原料计算）的反应比例（重量）是1：0.1-20倍，温度70-120℃，均得到良好的效果。

[0057] 1、Rh2组红参皂苷组成的确认：Rh2组红参皂苷测定的高效液相色谱仪，美国waters 2695仪器；检测器， Photodiode Array Detector Waters 2996；Knauer C18色谱柱（250mm×3mm）；流动相，乙腈（A）-水（B）；0~35min，19%A等度；35~55min，19%A~29%A线性梯度；55~65min，29%A~40%A线性梯度；
65~95min，40%A~100%A线性梯度；进样量，10μL；柱温，35℃；体积流速，0.6mL/min；检测波长，203nm。

[0058] 取上述Rh2组红参皂苷2毫克溶解于1毫升的甲醇中，经0.45μm滤膜过滤，高效液相色谱（HPLC）检测，与标准品20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3皂苷比较，如图13所示。

[0059] 从图13中可以看到，反应得到Rh2组皂苷含有20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3等四种红参稀有皂苷，其含量比例（峰面积比例）依次为29：24：21：26。

[0060] 2、超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-Q/TOF）核对Rh2组的四种皂苷：TM
超高效液相色谱-质谱联用分析仪：UPLC-Q/TOF Premier Micromass (Waters) 仪器；色谱柱：BEH shield RP18 (2.1×100mm，1.7μm，Waters)。超高效液相色谱-四级杆串联质谱联用检测在UPLC-Q/TOF PremierTM Micromass (Waters) 仪器完成。ESI源，正、负离子模式下，“V”模式下进行检测。

[0061] 超高效液相色谱（UPLC）检测条件：流动相为（A）0.1%甲酸-乙腈——（B）0.1%甲酸-水；梯度洗脱：0~5min，5%A~95%A线性梯度，5~10min，95%A等度。进样量，10μL；流速，0.5 mL/min；柱温，30℃；检测波长，203nm。

[0062] 四级时间飞行串联质谱（Q/TOF）检测条件：毛细管电压，2.5kv；样品孔电压，35v；离子源温度，100℃；脱溶剂气温度，350℃；锥孔气流速，50L/hr；脱溶剂气流速，1000L/hr；
质量扫描范围，100-1000Da。

[0063] 红参稀有皂苷20(S)-Rh2和20(R)-Rh2的分子式为C36H62O8，分子量为622；Rk2和Rh3的分子式C36H60O7，分子量为604：1）液-质联用法（UPLC-Q/TOF）检测Rh2组红参稀有皂苷如图14所示。

[0064] 从图14中可以看出，Rh2组在UPLC检测图谱中有四个明显的紫外吸收峰，和Rh2组HPLC 的20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3的紫外吸收峰检测图谱一致，其保留时间依次为4.62、4.66、5.33、5.38（min）；然后在正负离子模式下，通过串联质谱（Q/TOF）检测得到的总离子流图（省略图）中有四个明显的峰，其保留时间依次为4.62、4.71、5.36、5.41（min），与UPLC图谱一致，可进行总离子流峰进行一级质谱分析，确定Rh2组样品中各物质。

[0065] 2）对Rh2组皂苷中第一、第二离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析，如图15、16所示。

[0066] 20(S)-Rh2、20(R)-Rh2分子量为622；从图15、16中可以看出，Rh2组皂苷第一、—第二峰在ESI-负模式下形成[第一、第二峰物质分子+HCOOH] 离子峰，而负离子模式下又减少一个H，所以样品Rh2通过Q/TOF得到的离子峰m/z 667。故可判断，样品中含有
20(S)-Rh2和20(R)-Rh2，其分子量为622。

[0067] 再对Rh2组人参稀有皂苷中第三、第四离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析，如图17、18所示。

[0068] Rk2和Rh3的分子量为604；从图17、18中可以看出，在ESI-负模式下形成[第—三、第四峰物质分子+HCOOH] 离子峰，而负离子模式下又减少一个H，所以Rk2和Rh3得到的离子峰m/z 649。故可判断，样品中含有Rk2和Rh3，其分子量为604。结构式分别为：
由此重新证明，所制备的Rh2组中含有20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh2等四种红参稀有皂苷；经过几次试验，所制备的Rh2组中20(S)-Rh2和20(R)-Rh2在Rh2组总皂苷中的含量比例的范围20-80%。

[0069] 实施例3：人参自身酶及水溶性物质的提取物中加入有机酸，可提高转化原人参二醇类Rb1、Rb2、Rc或Rd单体或者其混合，制备由20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5组成的Rg3组混合红参稀有皂苷的效果。

[0070] 5克人参皂苷Rb1加入于22毫升水，研磨，再加入3毫升实施例1的人参自身酶及水溶性物质的提取物，加入25毫升水和10克柠檬酸，在70℃反应2小时，用300毫升水稀释，经100毫升的大孔树脂柱上反复吸附皂苷，用水洗渣，再用400毫升的70%乙醇洗脱，减压浓缩、干燥得到2.7克的由20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5组成的Rg3组混合皂苷。

[0071] 几次试验证明，上述反应中，原料人参皂苷可用Rb1、Rb2、Rc、Rd单体皂苷，也可用其混合皂苷；人参皂苷反应浓度0.1-10%，人参皂苷与人参自身酶及水溶性物质的提取物（人参根干品原料计算）的反应比例（重量）是1：0.1-20倍；所用的有机酸是乳酸、醋酸或柠檬酸，有机酸的加量为反应体积的0.01-50%；反应温度60-90℃条件下，均得到良好的效果。

[0072] 上述Rg3组混合皂苷经HPLC检测，其20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5皂苷组成与实施例1的Rg3组混合皂苷组成相似。

[0073] 实施例4：人参自身酶及水溶性物质的提取物中加入有机酸，可提高转化F2制备Rh2组皂苷效果。

[0074] 5克人参皂苷F2加入于25毫升水，研磨，再加入5毫升实施例1的人参自身酶及水溶性物质的提取物，加入15毫升乳酸，在80℃反应3小时；然后用300毫升水稀释，经100毫升的大孔树脂柱上反复吸附皂苷，用水洗渣，再用400毫升的84%乙醇洗脱，减压浓缩、干燥得到2.9克的由20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3组成的Rh2组混合皂苷。

[0075] 几次试验证明，上述反应中，人参皂苷F2反应浓度0.1-10%，人参皂苷F2与人参自身酶及水溶性物质的提取物（人参根干品原料计算）的反应比例（重量）是1：0.1-20倍；所用的有机酸是乳酸、醋酸或柠檬酸，有机酸的加量为反应体积的0.01-50%；反应温度60-90℃条件下，均得到良好的效果。

[0076] 上述Rh2组混合皂苷经HPLC检测，其20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3红参皂苷组成与实施例2的Rh2组混合皂苷组成相似。