通过PEPC酶活性测定判断凤眼莲单株干重的方法及其应用转让专利
申请号 : CN201110160189.7
文献号 : CN102353635A
文献日 : 2012-02-15
发明人 : 李霞 , 丛伟
申请人 : 江苏省农业科学院
摘要 :
本发明涉及一种通过PEPC酶活性测定判断凤眼莲单株干重的方法及其应用，其特征在于，通过测定凤眼莲旺盛生长期内功能叶片的PEPC酶活性来判断其单株干重；所述的凤眼莲旺盛生长期是指每年的7～9月期间；所述的凤眼莲功能叶片材料是指：除去凤眼莲的心叶和最后一片衰老叶片后的其他叶片。在凤眼莲旺盛生长内，通过对凤眼莲的功能叶片的PEPC酶活性的测定获得的单株干重，确定凤眼莲规模化人工种养期收获的鉴定指标。
权利要求 :
1.一种通过PEPC酶活性测定判断凤眼莲单株干重的方法，其特征在于，通过测定凤眼莲旺盛生长期内功能叶片的PEPC酶活性来判断其单株干重；所述的凤眼莲旺盛生长期是指每年的7～9月期间；所述的凤眼莲功能叶片材料是指：除去凤眼莲的心叶和最后一片衰老叶片后的其他叶片。
2.根据权利要求1所述的通过PEPC酶活性测定判断凤眼莲单株干重的方法，其特征在于：对旺盛生长期内凤眼莲的功能叶片的PEPC酶活性测定包括：a)称取0.2g待测凤眼莲的功能叶片材料放入预冷的研钵，加入pH7.8的粗酶提取缓冲液：50mM/L Tris-HCl，5mM/L二硫苏糖醇，1mM/L氯化镁，2％聚乙烯吡咯烷酮，研磨，经4层纱布过滤，过滤的研磨液收集离心管，在4℃，12000rpm下，离心20min，取上清液，即为粗酶液；
b)叶绿素含量测定：粗酶液取40ul加到960ul无水乙醇中，分别在649nm、663nm和
665nm下测定光吸收值，
总叶绿素含量Chl＝叶绿素a含量+叶绿素b含量；
叶绿素a＝12.7×A665-2.59×A649；
叶绿素b＝22.9×A649-4.67×A663；
式中：A665是指OD值在665nm测定的吸光值，A649是指OD值在649nm下测定的吸光值，A663是指OD值在663nm下测定的吸光值；
c)NADH吸光度变化：反应体系中加入pH8.0的50mmol Hepes-KHO，以及10mmol碳酸氢钠，5mmol氯化镁，0.2mmol NADH-Na2，50ul粗酶液，1.5u苹果酸脱氢酶，用蒸馏水定容到
1ml，混匀后加入5mmolPEP，在紫外分光光度计上记录90s内每15s记录1次340nm的光密度的下降数值，3
d)PEPC酶的活性＝ΔOD340×10/[6.3×Chl×(反应体系量/粗酶液体量)×反应时间)]。
3.根据权利要求2所述的通过PEPC酶活性测定判断凤眼莲单株干重的方法，其特征在于：待测凤眼莲的功能叶片材料源于取样点，取样点分布在被测种养区域中的取样区域内，2
取样区域不小于6m。
4.根据权利要求1或2或3所述的通过PEPC酶活性测定判断凤眼莲单株干重的方法，2
其特征在于：单株干重与功能叶片的PEPC酶活性呈正相关，它们之间的决定系数为r ＝2
0.8894**，r ＝0.036，相关系数为r＝0.943***，r＝0.190。
5.一种如权利要求4所述方法的应用，其特征在于：在凤眼莲旺盛生长内，通过对凤眼莲的功能叶片的PEPC酶活性的测定获得的单株干重，确定凤眼莲规模化人工种养期收获的鉴定指标。
说明书 :
通过PEPC酶活性测定判断凤眼莲单株干重的方法及其应
用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种对旺盛生长期内凤眼莲的单株干重检测新方法及其应用，尤其是引入PEPC酶活性测定技术判断凤眼莲单株干重，用于对人工种养凤眼莲的生长期进行管理。
背景技术
[0002] 凤眼莲(Eichhornia crassipes)属维管束水生植物，俗称水葫芦，具有发达的根系、旺盛的生长繁殖及超强的吸收能力。凤眼莲引入中国最早是用于饲料。但是，凤眼莲原产地巴西、阿根廷和秘鲁等国，一般分布于南纬32.3度和北纬32度之间的世界大部分地区，在25～35℃下生长速度惊人，通常在8个月内就能从10棵增至60万棵，是公认的生长最快的植物之一。计算发现，只要条件允许，单株凤眼莲一年内可以产生1.4亿棵分株，可2
以铺满140hm 的水面，鲜重可达28000t，可见其种群恢复和扩散能力极强，为其利用的生态安全带来了很高的风险。目前，我国南部17个省市都存在严重的凤眼莲泛滥问题，凤眼莲也成为世界十大害草之一。近年来也用于食用菌的培养基质及沼气发酵等，特别是在富营养化水体治理工程中被广泛应用【胡长伟，孙占东，李建龙，等.凤眼莲在城市重污染河道修复中的应用[J].环境工程学报，2007，1(12)：P.51-56；齐玉梅，高伟生.凤眼莲净化水质及其后处理工艺探讨[J].环境科学进展，1999，7(2)：P.136-140】，使其成为现代高效生态农业的一种重要利用资源【周文兵，谭良峰，刘大会，等.凤眼莲及其资源化利用研究进展[J]，华中农业大学学报，2005，24(4)：P.423-428；盛婧，陈留根，朱普平，等.高养分富集植物凤眼莲的农田利用研究[J].中国生态农业学报，2010，18(1)：P.46-49】，也为人们有效控制该物种提供了新出路。随着凤眼莲人工种养地点的增加，栽培工作者发现不同地点种养的凤眼莲形态有差异，诸如叶片数目、株高和根长等。虽然凤眼莲的生长速度很快，但是生长的方向则有不同，当植株较小，并有开阔的空旷的水面时，其呈匍匐形水平生长，等充满了整个水面之后，则改为植株纵向生长。当凤眼莲生长受到生长环境限制时，植株则会脱落老的植株来优先保证新生植株的营养供应，如果不及时收获而任由衰老的植株脱落在水里，则可能造成水体的两次污染，因此，准确地判定凤眼莲的最佳生长状态，及时的采收，则是凤眼莲在富营养化水域高效利用的最关键的问题。如何判定凤眼莲在不同地区的生长状况，确定适宜的收获时期，也成为凤眼莲资源化高效利用技术在中国广大富营养化水域地区推广的关键问题。
以铺满140hm 的水面，鲜重可达28000t，可见其种群恢复和扩散能力极强，为其利用的生态安全带来了很高的风险。目前，我国南部17个省市都存在严重的凤眼莲泛滥问题，凤眼莲也成为世界十大害草之一。近年来也用于食用菌的培养基质及沼气发酵等，特别是在富营养化水体治理工程中被广泛应用【胡长伟，孙占东，李建龙，等.凤眼莲在城市重污染河道修复中的应用[J].环境工程学报，2007，1(12)：P.51-56；齐玉梅，高伟生.凤眼莲净化水质及其后处理工艺探讨[J].环境科学进展，1999，7(2)：P.136-140】，使其成为现代高效生态农业的一种重要利用资源【周文兵，谭良峰，刘大会，等.凤眼莲及其资源化利用研究进展[J]，华中农业大学学报，2005，24(4)：P.423-428；盛婧，陈留根，朱普平，等.高养分富集植物凤眼莲的农田利用研究[J].中国生态农业学报，2010，18(1)：P.46-49】，也为人们有效控制该物种提供了新出路。随着凤眼莲人工种养地点的增加，栽培工作者发现不同地点种养的凤眼莲形态有差异，诸如叶片数目、株高和根长等。虽然凤眼莲的生长速度很快，但是生长的方向则有不同，当植株较小，并有开阔的空旷的水面时，其呈匍匐形水平生长，等充满了整个水面之后，则改为植株纵向生长。当凤眼莲生长受到生长环境限制时，植株则会脱落老的植株来优先保证新生植株的营养供应，如果不及时收获而任由衰老的植株脱落在水里，则可能造成水体的两次污染，因此，准确地判定凤眼莲的最佳生长状态，及时的采收，则是凤眼莲在富营养化水域高效利用的最关键的问题。如何判定凤眼莲在不同地区的生长状况，确定适宜的收获时期，也成为凤眼莲资源化高效利用技术在中国广大富营养化水域地区推广的关键问题。
[0003] 世界上凤眼莲属有8种植物，但根据细胞学和分子遗传学的研究结果，目前分布在我国的仅有来自南美州巴西的1种【汪光熙，王徽勤.凤眼莲的核型研究[J].武汉大学学报(自然科学版)，1989，4：P.131-132；REN M X，ZHANG Q G & ZHANG D Y.Random amplified polymorphic DNA markers reveal low genetic variation and a single dominant genotype in Eichhornia crassipes populations throughout China[J].Weed Research，2005，45：P.236-244】，这表明凤眼莲属植物在中国的分布与我国的生态条件有关。王桂荣和张春新研究了某些环境条件对凤眼莲生物生产力影响【李学宝，何光源，吴振斌，等.凤眼莲、水花生若干光合作用参数与酶类的研究[J].水生生物学报，1995，19(4)：P.333-336】，并发现凤眼莲对低温的适应性比水花生(Alternanthera philoxeroides)差【李学宝，何光源，吴振斌，等.凤眼莲、水花生若干光合作用参数与酶类的研究[J].水生生物学报，1995，19(4)：P.333-336】。朱慧等从凤眼莲的入侵性和光合能力的角度表明，广东地区的凤眼莲具有较高的光能利用力与较强的光合响应机制，这是它比大薸具有更强入侵力的生理基础【朱慧，马瑞君，2种水生入侵植物光合特征的比较[J]，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2010，38(5)：P.193-198】。已有研究表明，南京地区8月凤眼莲叶片的光合能力显著高于水稻，并与玉米接近【李霞，任承钢，王满，等。江苏地区凤眼莲叶片光合作用对光强与温度响应[J]，江苏农业学报，2010，26(5)：P.943-947】，这些研究都是凤眼莲对当地光温资源利用的表现，而且凤眼莲在高光强和高温条件下具有高光效特性。王强等研究表明，两优培九较高的光能和CO2利用效率、较强的抗光抑制能力、以及较高的C4途径酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)的表达水平是其超高产的重要原因【王强，卢从明，张其德，等.超高产杂交稻两优培九的光合作用、光抑制和C4途径酶特性[J].中国科学[C辑]，2002，32(6)：P.482-487】。PEPC在C4植物中起浓缩CO2以提高光合效率的作用，尤其在C4型pepc光合基因导入C3植物水稻，并高表达后，PEPC酶就成为一个重要的水稻高光效的筛选指标，而备受植物生理学家和作物育种学家广泛关注，已成为作物育种学家研究的热点问题【Ku MSB，Sakae A，Mika N，et al.High-level expression of maize phosphoenolpyruate carboxylase in transgenic rice plants[J].Nature Biotechnology，1999，17：P.76～78；李霞等，PEPC酶活性作为水稻高光效育种筛选指标的研究，江苏农业学报，2008，24(5)：P.559-564】。
[0004] 我们的研究表明，凤眼莲是适合高光强和高温条件的高光效的水生挺水植物。凤眼莲人工栽培工作者检测其生长状况通常是参照水生植物干物质累积的测定方法，定期测定植株的鲜重，通过烘箱烘干至恒重，测定植株的干重，最后确定其适宜的采收时期，该方法在实验室内小范围的研究是适合的。但随着凤眼莲的规模化养殖的范围的不断扩大，而且由于凤眼莲的高生物量，水分含量很高，特别生长旺盛的时期植株的叶体积很大，干重通常只占鲜重的十分之一，因此，由于凤眼莲的独特生物学组成，势必需要增加烘干称重匹配的大体积烘箱等仪器设备以及较长时间的烘干时间，再加上由于凤眼莲形态生长的变化很大，客观判定一个较大种养地区的生物量的累积也需要增加不同的取样地点，因此检测样品的数量也大大增加，极大地增大了凤眼莲栽培工作者定量检测凤眼莲生长状况的工作量。
[0005] 长期以来，人们期盼能够有一种更为方便简洁的检测方法替代繁琐复杂的定期测定植株的鲜重，通过烘箱烘干至恒重，测定单株干重的方法，用于凤眼莲的管理，确定最佳收割期。
[0006] 最近也有人将现代遥感技术用于对凤眼莲规模化种养的检测中，但是遥感技术通常是通过植株叶片发射的光谱，比如绿色叶片来判定生长的状况，但是这种方法也只对凤眼莲的水平匍匐状的生长状况的判定相对有利，而对凤眼莲在水面充满后的纵向生长则无法判定，而且这种方法还需要大型的仪器设备，而且借助卫星等的相关资料，不仅成本高，而且需要专门的人员操作，应用起来有一定困难。
[0007] 鉴于目前使用的凤眼莲生长检测的技术和手段的不足，在一定程度上限制了凤眼莲在中国广大富营养化水域资源化利用。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于：针对目前对凤眼莲检测的技术和手段存在的耗时长和工作量大等不足，给，提供凤眼莲生长期管理带来的不便，提供一种通过PEPC酶活性测定判断凤眼莲单株干重的方法及其在凤眼莲生长期管理中的应用。
[0009] 我们的研究表明，水稻生育后期是决定水稻产量的关键时期，开花后光合作用的70％都用于形成产量，其中剑叶的光合作用占整个叶片光合作用的50％以上，与水稻植株的地上和地下部分的生理表现有着密不可分的关系。研究进一步看出，水稻叶片的PEPC酶活性与净光合速率有很好的相关性，特别在产量形成的关键时期-孕穗期早期(开花后
5-10天之间)上午10:00-12:00之间，外源PEPC基因水稻高水平表达与净光合速率的高值出现期表现一致，而且相对稳定，确定剑叶PEPC活性可作为水稻高光合速率的可靠分子育种指标。我们在研究不同地区凤眼莲的光合特性的研究发现，在不同生态地区生长的凤眼莲的高生物量的生理基础在于其具有高光合特性特性，而且单株干重的累积与叶片的PEPC酶活性的表现有一致关系，据此确定了本发明利用在同一生态地区自然光温条件下，重点在凤眼莲关键的生长时期，分别对其不同生长时期的功能叶片PEPC酶活性进行定期监测，同时对功能叶片的最大净光合速率和单株干重等进行平行测定的技术提供了理论基础，通过在同一生态环境下，不同时期形态和生理指标的测定和数据分析，研究PEPC酶活性与高光合速率以及干物质累积的关系，以确定PEPC酶活性作为凤眼莲高生长指标的测定条件，这对于筛选和检测凤眼莲等高生物量的生长状况具有重要意义，并将对建立高通量高效凤眼莲高生物量高光效种质的筛选技术体系都有重要作用。
5-10天之间)上午10:00-12:00之间，外源PEPC基因水稻高水平表达与净光合速率的高值出现期表现一致，而且相对稳定，确定剑叶PEPC活性可作为水稻高光合速率的可靠分子育种指标。我们在研究不同地区凤眼莲的光合特性的研究发现，在不同生态地区生长的凤眼莲的高生物量的生理基础在于其具有高光合特性特性，而且单株干重的累积与叶片的PEPC酶活性的表现有一致关系，据此确定了本发明利用在同一生态地区自然光温条件下，重点在凤眼莲关键的生长时期，分别对其不同生长时期的功能叶片PEPC酶活性进行定期监测，同时对功能叶片的最大净光合速率和单株干重等进行平行测定的技术提供了理论基础，通过在同一生态环境下，不同时期形态和生理指标的测定和数据分析，研究PEPC酶活性与高光合速率以及干物质累积的关系，以确定PEPC酶活性作为凤眼莲高生长指标的测定条件，这对于筛选和检测凤眼莲等高生物量的生长状况具有重要意义，并将对建立高通量高效凤眼莲高生物量高光效种质的筛选技术体系都有重要作用。
[0010] 本发明的目的是这样实现的：一种通过PEPC酶活性测定判断凤眼莲单株干重的方法，其特征在于，通过测定种养期内凤眼莲功能叶片的PEPC酶活性来判断其单株干重；所述的凤眼莲功能叶片材料是指：除去凤眼莲的心叶和最后一片衰老叶片后的其他叶片。
[0011] 在本发明中：对种养期内凤眼莲的功能叶片的PEPC酶活性测定包括：
[0012] a)称取0.2g待测凤眼莲的功能叶片材料放入预冷的研钵，加入pH7.8的粗酶提取缓冲液：50mM/L Tris-HCl，5mM/L二硫苏糖醇，1mM/L氯化镁，2％聚乙烯吡咯烷酮，研磨，经4层纱布过滤，过滤的研磨液收集离心管，在4℃，12000rpm下，离心20min，取上清液，即为粗酶液；
[0013] b)叶绿素含量测定：取40ul粗酶液加到960μl无水乙醇中，分别在649nm、663nm和665nm下测定光吸收值，
[0014] 总叶绿素含量Chl＝叶绿素a含量+叶绿素b含量；
[0015] 叶绿素a(mg/L)＝12.7×A665-2.59×A649；
[0016] 叶绿素b(mg/L)＝22.9×A649-4.67×A663；
[0017] 式中：A665是指OD值在665nm测定的吸光值，A649是指OD值在649nm下测定的吸光值，A663是指OD值在663nm下测定的吸光值；
[0018] c)NADH吸光度变化：反应体系中加入pH8.0的50mmol Hepes-KHO，以及10mmol碳酸氢钠，5mmol氯化镁，0.2mmol NADH-Na2，50μl粗酶液，1.5u苹果酸脱氢酶，用蒸馏水定容到1ml，混匀后加入5mmolPEP，在紫外分光光度计上记录90s内每15s记录1次340nm的光密度的下降数值，
[0019] d)PEPC酶的活性(μmol/mg.chl.h)＝ΔOD340×103/[6.3×Chl×(反应体系量/粗酶液体量)×反应时间)]。
[0020] 在本发明中：待测凤眼莲的功能叶片材料源于取样点，取样点分布在被测种养区2
域中的取样区域内，取样区域不小于6m。
域中的取样区域内，取样区域不小于6m。
[0021] 在本发明中：单株干重与功能叶片的PEPC酶活性呈正相关，它们之间的决定系数2 2
为r ＝0.8894**，r ＝0.036，相关系数为r＝0.943***，r＝0.190。
为r ＝0.8894**，r ＝0.036，相关系数为r＝0.943***，r＝0.190。
[0022] 一种上述方法的应用，其特征在于：通过对旺盛生长期凤眼莲的功能叶片的PEPC酶活性的测定获得的单株干重，确定凤眼莲规模化人工种养期收获的鉴定指标。
[0023] 本发明的优点在于，在判断旺盛生长期凤眼莲的单株干重时，利用成熟的PEPC酶活性检测技术，相对于传统的凤眼莲单株干重检测方法，不仅取样少，而且耗时短，大大减少了检测的工作量。将PEPC酶的活性检测技术用于规模化人工种养旺盛期的凤眼莲进行管理，可以大大提高工作效率。
附图说明
[0024] 图1是2009年南京地区种养的凤眼莲功能叶片生长期内的Pmax的变化；
[0025] 图2是2009年南京地区种养的凤眼莲功能叶片生长期内的PEPC酶活性的变化；
[0026] 图3是2009年南京地区种养的凤眼莲生长期内单株干重的变化；
[0027] 图4是2009凤眼莲材料单株干重与PEPC酶的活性的相关性；
[0028] 图5是2009凤眼莲材料单株干重与最大净光合速率Pmax的相关性；
[0029] 图6是2009凤眼莲材料PEPC酶的活性与最大净光合速率Pmax的相关性；
[0030] 图7是2010年南京地区7月～9月种养的凤眼莲生长期内单株干重、叶片PEPC酶活性和最大净光合速率的变化
具体实施方式
[0031] 实施例1
[0032] 凤眼莲材料的种养
[0033] 凤眼莲(Eichhornia crassipes)，属雨久花科凤眼莲属，是一种浮生于水面的水生植物。在自然条件下，大部分不结实，主要靠分株繁殖，叶腋有腋芽，能抽出匍匐枝，其顶-1端长出茎，叶和根系，成为新株。本试验江苏南京(试验区水体总氮为3.82mg·L ，总磷为-1
0.09mg·L ，水温为26-30℃)的凤眼莲人工种养实验地进行。凤眼莲在2009年5月1日
2
的初始放养量为每平方米2kg。采用毛竹围栏小区试验，小区面积为6m。生长2个月后，于
7月，选取单枝、叶片数为9±3个，白色须根10个的绿色健壮植株，在不同生长期中进行植株形态和光合生理生态指标的测定。
0.09mg·L ，水温为26-30℃)的凤眼莲人工种养实验地进行。凤眼莲在2009年5月1日
2
的初始放养量为每平方米2kg。采用毛竹围栏小区试验，小区面积为6m。生长2个月后，于
7月，选取单枝、叶片数为9±3个，白色须根10个的绿色健壮植株，在不同生长期中进行植株形态和光合生理生态指标的测定。
[0034] 实施例2
[0035] 凤眼莲叶片测定时间的选择
[0036] 凤眼莲的不同生长期中每隔30天分别取凤眼莲功能叶片(去除心叶和最后一个衰老叶片)，并上午10:00-12:00取凤眼莲叶片，每测定点取10个样品，每个样品测定3次，分别进行各项指标的测定。
[0037] 实施例3
[0038] 凤眼莲叶片最大净光合速率(Pmax)测定的变化
[0039] 采用美国LI-COR公司生产的LI-6400便携式光合测定仪，为开放系统，使用红蓝2
光源测定，光量子通量密度(PPFD)为1600μmol/m.s，流速设为500μmol/s，室外5月～
11月自然条件测定条件为晴天上午10:00～12:00的自然平均气温为(23～35℃)℃，相
2
对湿度为67％～79％，光强为1800±50μmol/m·s，CO2浓度为390.0±10.5μmol/mol，分别测定了不同叶位叶片的Pmax。从图1可以看出，从开始放养的5月份到最后收获的11月份凤眼莲Pmax的变化呈现单峰变化趋势，其中7月～9月是Pmax最大的三个月。
光源测定，光量子通量密度(PPFD)为1600μmol/m.s，流速设为500μmol/s，室外5月～
11月自然条件测定条件为晴天上午10:00～12:00的自然平均气温为(23～35℃)℃，相
2
对湿度为67％～79％，光强为1800±50μmol/m·s，CO2浓度为390.0±10.5μmol/mol，分别测定了不同叶位叶片的Pmax。从图1可以看出，从开始放养的5月份到最后收获的11月份凤眼莲Pmax的变化呈现单峰变化趋势，其中7月～9月是Pmax最大的三个月。
[0040] 实施例4
[0041] 凤眼莲叶片PEPC酶活性测定的年变化
[0042] 根据Gonzalez等人(1984)的方法。主要步骤如下，取将称取0.2g不同生长月份的待测凤眼莲的功能叶片材料放入预冷的研钵，加入粗酶提取缓冲液：50mM/L Tris-HCl(pH7.8)，5mM/L二硫苏糖醇，1mM/L氯化镁，2％聚乙烯吡咯烷酮，研磨，经4层纱布过滤，过滤的研磨液收集离心管，在4℃，12000rpm下，离心20min，取上清液，即为粗酶液。
[0043] 叶绿素含量测定：取40μl粗酶液加到960μl无水乙醇中，分别在649nm、663nm和665nm下测定光吸收值，
[0044] 总叶绿素含量(Chl)＝叶绿素a含量+叶绿素b含量
[0045] 叶绿素a(mg/L)＝12.7×A665-2.59×A649
[0046] 叶绿素b(mg/L)＝22.9×A649-4.67×A663
[0047] 式中：A665是指OD值在665nm测定的吸光值；A649是指OD值在649nm下测定的吸光值；A663是指OD值在663nm下测定的吸光值。
[0048] NADH吸光度变化：反应体系中加入50mmol Hepes-KHO(pH8.0)，10mmol碳酸氢钠，5mmol氯化镁，0.2mmol NADH-Na2(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐)，50μl粗酶液，1.5u苹果酸脱氢酶，用蒸馏水定容到1ml，混匀后加入5mmolPEP(磷酸烯醇式丙酮酸)，在紫外分光光度计上记录90s内340nm下光密度的下降(每15s记录1次数值)
[0049] PEPC酶的活性(μmol/mg.chl.h)＝ΔOD340×103/[6.3×Chl×(反应体系量/粗酶液体量)×反应时间)]。
[0050] 从图2可以看出，从开始放养的5月份到最后收获的11月份凤眼莲功能叶片PEPC酶活性的变化也呈现单峰变化趋势，其中8月-10月是酶活性最大的三个月。
[0051] 实施例5
[0052] 凤眼莲单位面积干重生物量测定的年变化
[0053] 参照李卫国和王建波[14]的方法[李卫国，王建波，光照和氮素对外来植物凤眼莲生长和生理特性的影响.武汉大学学报(理学版)，2007，53(4)：457-462]，植株培养的不同天数，每隔30天后收获，从每一地点取出10个植物个体；水洗后，用滤纸吸干水分，于85℃下烘箱中烘干24h至恒重后，用感量为0.0001g的电子天平称量干重，取平均值。
[0054] 从图3可以看出，从开始放养的5月份到最后收获的11月份凤眼莲单株干重的变化也呈现单峰变化趋势，其中9月-11月是酶活性最大的三个月。
[0055] 实施例6
[0056] 2009年凤眼莲生长测定结果的分析
[0057] 结合上述的研究结果，进一步将不同月份凤眼莲功能叶片的PEPC酶活性、功能叶片的最大净光合速率以及不同种养取样点单位面积内单株干重进行相关分析，从见图4，5，6看出，单株干重分别与功能叶片的PEPC酶活性以及最大净光合速率呈正相关，决定系数
2 2
分别为r ＝0.8894**，r ＝0.036，相关系数为r＝0.943***，r＝0.190，PEPC酶活性与
2
最大净光合速率也呈正相关，决定系数分别为r ＝0.1677，相关系数为r＝0.410，其中放养时期单株干重分别与功能叶片的PEPC酶活性呈极显著正相关，进一步分析，种养的旺盛的7月-9月的光合参数的相关性，单株干重分别与功能叶片的PEPC酶活性以及最大净
2 2
光合速率呈极显著正相关，决定系数分别为r ＝0.935**，r ＝0.786**，相关系数为r＝
0.967***，r＝0.887**，PEPC酶活性与最大净光合速率也呈极显著正相关，决定系数分别
2
为r ＝0.1677，相关系数为r＝0.0.744**，可见，测定凤眼莲旺盛生长期7月-9月功能叶片的PEPC活性，可替代不同时期单株干重的测定，作为凤眼莲生物量累积的可靠生理指标。
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分别为r ＝0.8894**，r ＝0.036，相关系数为r＝0.943***，r＝0.190，PEPC酶活性与
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最大净光合速率也呈正相关，决定系数分别为r ＝0.1677，相关系数为r＝0.410，其中放养时期单株干重分别与功能叶片的PEPC酶活性呈极显著正相关，进一步分析，种养的旺盛的7月-9月的光合参数的相关性，单株干重分别与功能叶片的PEPC酶活性以及最大净
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光合速率呈极显著正相关，决定系数分别为r ＝0.935**，r ＝0.786**，相关系数为r＝
0.967***，r＝0.887**，PEPC酶活性与最大净光合速率也呈极显著正相关，决定系数分别
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为r ＝0.1677，相关系数为r＝0.0.744**，可见，测定凤眼莲旺盛生长期7月-9月功能叶片的PEPC活性，可替代不同时期单株干重的测定，作为凤眼莲生物量累积的可靠生理指标。
[0058] 实施例7
[0059] 通过PEPC酶活性测定判断凤眼莲单株干重的方法的应用
[0060] 在2009年获得试验数据的基础上，于2010年在江苏南京的凤眼莲人工种养实验地进行实际应用的试验。在2010年6月1日，凤眼莲的初始放养量为每平方米2kg，采用毛2
竹围栏小区试验，小区面积为6m。分别于7月、8月和9月，选取单枝、叶片数为9±3个，白色须根10个的绿色健壮植株，进行植株单株干重和最大净光合速率的测定，并选取叶片倒2叶，测定叶片的PEPC酶活性，从图7可见，在9月时，凤眼莲叶片的PEPC酶活性最高，其植株的单株干重也最大，最大的净光合速率也最高，而且，在水体养分的初始浓度为TN -1 -1 -1
5.17mg·L 、TP 0.36mg·L 、K 10.67mg·L 条件下，凤眼莲植株在种养60d，含N、P、K量分-2
别达4.5％、0.7％、8.0％，60d水葫芦N、P、K吸收总量分别达57.57、8.95和111.14g·m ，并根据凤眼莲叶片的PEPC酶活性的变化判断其干重，确定凤眼莲的最佳收获的时间，使试验区域内水体的N、P、K的清除率分别为75％、71％和86％，可见，即使在凤眼莲生长的最旺盛时期，也对水体具有很好的清除效果。
竹围栏小区试验，小区面积为6m。分别于7月、8月和9月，选取单枝、叶片数为9±3个，白色须根10个的绿色健壮植株，进行植株单株干重和最大净光合速率的测定，并选取叶片倒2叶，测定叶片的PEPC酶活性，从图7可见，在9月时，凤眼莲叶片的PEPC酶活性最高，其植株的单株干重也最大，最大的净光合速率也最高，而且，在水体养分的初始浓度为TN -1 -1 -1
5.17mg·L 、TP 0.36mg·L 、K 10.67mg·L 条件下，凤眼莲植株在种养60d，含N、P、K量分-2
别达4.5％、0.7％、8.0％，60d水葫芦N、P、K吸收总量分别达57.57、8.95和111.14g·m ，并根据凤眼莲叶片的PEPC酶活性的变化判断其干重，确定凤眼莲的最佳收获的时间，使试验区域内水体的N、P、K的清除率分别为75％、71％和86％，可见，即使在凤眼莲生长的最旺盛时期，也对水体具有很好的清除效果。