胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒

摘要

本发明公开一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成。本发明具有灵敏度高、特异性好、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。

权利要求

1.一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成。

2.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中的R1与R2的容积比为5∶1。

3.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述的聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0.01～1.5μm。

5.根据权利要求4所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述的聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0.05～0.5μm。

6.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

7.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒中，还包括胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品。

8.根据权利要求7所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品中胱氨酸蛋白酶抑制剂C的含量为0～8mg/L。

9.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成，该试剂R2的制备步骤包括：(1)胶乳颗粒的激活：在带有羧基的胶乳颗粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，混合反应后加入己二酸二酰肼，继续混合反应，得到激活的胶乳颗粒；

(2)抗体的氧化：用高碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羧基氧化成醛基；

(3)抗体与胶乳颗粒的偶联：将步骤(1)激活的胶乳颗粒和步骤(2)氧化的抗体混合反应，待反应结束后，再加入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球。

10.根据权利要求9所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：步骤(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺∶胶乳＝0.5～5∶100(重量比)；己二酸二酰肼∶胶乳＝50～250∶100(重量比)；步骤(2)中高碘酸钠∶胶乳＝0.5～3∶100(重量比)；步骤(3)中抗体∶激活的胶乳颗粒＝2～22∶100(重量比)，葡萄糖∶激活的胶乳颗粒＝(25～50)∶100。

说明书

胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂，进一步地，本发明涉及一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒。

背景技术

[0002] 肌酐，到目前为止被广泛作为肾小球滤过滤(GFR)的标志物，它是一种由肌肉产生的小分子物质，因此肌酐形成和分泌的速率和机体内肌肉含量密切相关。众所周知，在一个种群中，个体的肌肉含量是相对不同的，老年人比青壮年的肌肉含量要低，许多病人在他们疾病的进程存在肌肉含量的损失，孩子的肌肉含量也与成人不同，男人的肌肉平均含量要比女人高。当血清肌酐浓度作为肾小球滤过率标志物时，检测到的血清肌酐值要比实际低50％。而且饮食能够显著影响血清肌酐水平，特别是富含蛋白质的饮食。因此，血清肌酐浓度作为肾小球滤过率标志物时，受影响的因素很多，不易检测准确。目前，检测肌酐的方法中，有“金标法”和“静脉内注射放射性物质的方法”两种，但是“金标法”一般存在检测的可靠性差的不足；而采用在静脉内注射放射性物质的方法目前虽然受到普遍欢迎，但是，该方法昂贵、耗时，并且必须要进行注射、给患者带来痛苦。

[0003] 有文献报道，胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cys-c，分子量为13kD)，能够滤过正常的肾小球，是一种反映肾小球滤过率变化的理想的内源性标志物，采用简单的透射比浊法检测血清中胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量可以代替目前复杂的肾小球滤过率测定方法。应用最多的就是胶乳增强免疫透射比浊法，其基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。

[0004] 而胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体包被到胶乳上，一般可以采用物理吸附法和化学偶联法，采用物理吸附法得到的致敏胶乳颗粒稳定性较化学偶联法要差，抗体容易从胶乳颗粒上脱落下来；而且用物理吸附法得到的胶乳，有可能受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，IgM、IgG型RF可以与包被在胶乳上的抗体的Fc段直接结合，从而导致检测结果假阳性或假性升高。嗜异性抗体可与啮齿类动物IgG的Fc段结合，这样嗜异性抗体可与包被在胶乳上的抗体结合，造成检测结果假阳性或假性升高。目前采用的化学偶联法多为随机偶联法，因随机偶联的抗体随机偶联到抗体不同部位，将导致抗体损失结合力；所以，完全随机偶联会损失抗体大部分结合力，增加了抗体用量和生产成本。同时，若将上述方法得到的致敏胶乳颗粒用于检测试剂盒中，会造成特异性差、准确性低、抗干扰能力弱或生产成本高的缺陷。

发明内容

[0005] 本发明针对现有技术的上述不足，提供一种灵敏度高、特异性好、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成。

[0007] 本发明上述试剂盒中R1与R2的容积比为5∶1。

[0008] 本发明所述的缓冲液包括但不限于PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液、氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液中的一种或几种。

[0009] 本发明上述试剂盒中R1所用的缓冲液与配置R2所用的缓冲液只要为上面的缓冲液中的一种任意搭配均可。

[0010] 本发明上面所述的聚苯乙烯胶乳颗粒(该聚苯乙烯胶乳颗粒为市售常规产品)，其平均粒径在0.01～1.5μm之间，粒径小于0.01μm时，胶乳颗粒聚集产生的光密度变化太小，结果很难达到试验敏感度要求，在制备试剂的时候，需要花费过多的离心时间，延长了试剂生产的时间，增加了试剂成本且不利于重复性。而粒径大于1.5μm的胶乳颗粒在测量高浓度检测物时，其聚集产生的光密度变化超过了检测限，结果很难获得对应于分析物浓度的光密度变化，而且颗粒太大会加速自聚集，导致分散性降低。胶乳颗粒粒径随着试验方法和设备的改变而改变。所选择的颗粒粒径最好是介于0.05～0.5μm之间。

[0011] 本发明上面所述的抗体包括但不限于多克隆抗体(人、羊、兔、鸡)及单克隆抗体。

[0012] 在本发明所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒中，还包括胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品；进一步的，所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品中胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量为0～8mg/L。

[0013] 本发明所述的试剂R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成，该试剂R2制备步骤包括：

[0014] (1)胶乳颗粒的激活：在带有羧基的胶乳颗粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDAC)，混合反应后加入己二酸二酰肼，继续混合反应，得到激活的胶乳颗粒；

[0015] (2)抗体的氧化：用高碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羧基氧化成醛基；

[0016] (3)抗体与胶乳颗粒的偶联：将步骤(1)激活的胶乳颗粒和步骤(2)氧化的抗体混合反应，待反应结束后，再加入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球。

[0017] 本发明上述制备方法各个步骤中物料配比为：

[0018] 步骤(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺∶胶乳(带有羧基的胶乳颗粒原料)＝0.5～5∶100(重量比)；己二酸二酰肼∶胶乳(带有羧基的胶乳颗粒原料)＝50～250∶100(重量比)；

[0019] 步骤(2)中高碘酸钠∶胶乳(带有羧基的胶乳颗粒原料)＝0.5～3∶100(重量比)；

[0020] 步骤(3)中抗体∶激活的胶乳颗粒＝2～22∶100(重量比)，葡萄糖∶激活的胶乳颗粒＝(25～50)∶100。加入的是原料胶乳，可以改成抗体：胶乳。都是重量比[0021] 本发明所述胶乳增强免疫透射比浊法，其原理是包被了抗原或抗体的胶乳微粒，与标本中相应抗体或抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物形成所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。在本发明中，血清中的胱氨酸蛋白酶抑制剂C与结合在胶乳颗粒表面的抗人胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体结合，产生抗原抗体反应，使胶乳颗粒形成聚集；在546nm，700nm波长处测定吸光度，对照标准曲线可求出胱氨酸蛋白酶抑制剂C的含量。

[0022] 本发明的优点和有益效果：

[0023] 1.本发明的试剂盒是一种灵敏度高、特异性好、准确性高、抗干扰能力强及生产成本低的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒。

[0024] 2.本发明试剂盒中的试剂R2制备是一种抗原抗体反应试验方法，特别之处在于，本发明采用定向偶联法将胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体包被到胶乳颗粒上；本发明将抗体的非结合活性区域的Fc端定向偶联到胶乳颗粒上，不会发生类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰所导致的检测结果假阳性或假性升高，该方法定向偶联的抗体偶联到胶乳颗粒上后，其抗原结合位点指向流动相，抗体偶联部位为Fc片段，因此不会发生抗体结合力损失的情况，保持了抗体的活力，大大减少了抗体的用量，降低了生产成本。

[0025] 3.本发明试剂盒中的R2制备采用定向化学偶联法，得到的致敏胶乳颗粒稳定性较好，抗体不会从胶乳颗粒上脱落，而且由于化学偶联过程中，Fc段发生了结构上的改变，因此不会受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，大大提升了检测结果的准确性和可信性。

具体实施方式

[0026] 下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。

[0027] 实施例1 胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒的制备

[0028] 本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下：

[0029] 1.胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体：采用间接ELISA法测定效价为1∶100000。

[0030] 2.胶乳：本发明仅示例性的采用直径为100～200nm带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒进行实验。

[0031] 本实施例的主要试剂的配制如下：

[0032] 试剂R1：含1.5％PEG6000(聚乙二醇6000)，0.8％NaCl的氯化铵缓冲液。该试剂为无色透明溶液。

[0033] 试剂R2：用抗人胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏胶乳颗粒。该试剂为乳白色溶液。具体步骤如下：

[0034] 1.取1ml(100mg/ml)胶乳，用0.1M(mol/L)，pH5.0的MES溶液(2-吗啉乙磺酸缓冲液)洗涤3次，超声分散；

[0035] 2.加入0.2ml用0.1M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的EDAC(10mg/ml)混合完全，室温混和15min；

[0036] 3.加入0.8ml用0.1M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的己二酸二酰肼(83mg/ml)，4℃反应过夜；

[0037] 4.用0.1M，pH5.0的MES溶液洗涤2次，0.1M，pH7.5的磷酸盐溶液洗涤1次，超声分散备用；

[0038] 5.取1.5ml抗体(3.9mg/ml)溶液，加入0.2ml用0.1M，pH7.5的磷酸盐溶液配制的高碘酸钠溶液(10mg/ml)，室温混合15min，

[0039] 6.将步骤5中氧化好的抗体加入到步骤4中已激活的胶乳溶液中，4℃反应过夜；

[0040] 7.加入0.32ml 10％BSA(小牛血清白蛋白)溶液，4℃混合4h；

[0041] 8.加入0.4ml 10％葡萄糖溶液，4℃混合过夜；

[0042] 9.用0.1M，pH7.5Tris溶液洗涤3次，加入0.1M，pH7.5Tris溶液(含1％BSA，0.2％NaN3的Tris缓冲液)至胶乳终浓度为0.25％。

[0043] 胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品：在缓冲溶液中加入不同含量的胱氨酸蛋白酶抑制剂C蛋白，除菌过滤，所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品中胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量控制在0～8mg/L之间，这些校准品均为无色透明液体。

[0044] 实施例2 胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测定

[0045] 检测工具：日立7060型自动分析仪。

[0046] 分析方法：两点终点法；主波长：546nm，副波长：700nm：样品量：3.0ul；R1：250ul；R2：50ul；校准方式：样条函数Spline；反应方向：上升；测定温度：37℃；样品与R1混匀后，于第30秒读取吸光度A1；于5分钟时加入R2，于5分钟时读取吸光度A2。反应吸光度的计算为A2与A1的校准差值。

[0047] 计算方法：多点定标，以样条函数作为计算模式，根据吸光度与参考血清的值作剂量/响应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。

[0048] 参考范围：0.55～1.05mg/L

[0049] 实施例3 胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒各项性能指标测试

[0050] 1.灵敏度试验

[0051] 测定6种不同胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量的样品，每个样品测10次，通过计算均值和SD值(标准差值)，从表1可见，本发明检测试剂盒的灵敏度为0.08mg/L。

[0052] 表1

[0053]CYS-C(mg/L) 测定次数 均值 2.6SD M+2.6SD M-2.6SD
0 10 0.02 0.031 0.05 -0.02
0.04 10 0.05 0.044 0.10 0.01
0.08 10 0.10 0.031 0.13 0.07
0.12 10 0.15 0.058 0.21 0.10
0.16 10 0.19 0.044 0.23 0.14
0.20 10 0.22 0.032 0.25 0.19

[0054]

[0055] 2.高值线性测定

[0056] 测定10个不同胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量的样品，每个样品测2次，从表2可见，2
本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到8mg/L，判定依据r ≥0.990。

[0057] 表2

[0058]CYS-C理论值(mg/L) CYS-C实际值(mg/L)
1 0 0
2 1.5 1.51
3 2.5 2.55
4 3.5 3.52
5 4.5 4.58
6 5.5 5.57
7 6.5 6.54
8 7.5 7.43
9 8.5 8.02
10 9.5 8.22

[0059] 3.精密度试验

[0060] 使用2个不同胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量的人血清样品，测定本发明检测试剂盒的批内精密度。使用3个批号试剂盒分别测定1个人血清样品20次，计算本发明检测试剂盒的批间相对极差。结果表明，本发明检测试剂盒的批内精密度为1.36％和1.62％(见表3)，而批间相对极差为4.03％(见表4)。

[0061] 表3

[0062]样品1 样品2
测定次数 20 20
平均值(mg/L) 0.715 5.659
最小值(mg/L) 0.700 5.42
最大值(mg/L) 0.730 5.78
标准差(SD) 0.0097 0.0920
变异系数(CV％) 1.36 1.62

[0063] 表4

[0064]

[0065] 4.干扰试验

[0066] 在同一份人血清样品中分别加入不同含量的干扰物质后进行测定。加入干扰物质后的测定值除以加入干扰物质前的测定值即为影响率，试验结果表明游离胆红素，结合胆红素，血红蛋白以及乳糜微粒的浓度分别在200mg/dl，200mg/dl，5000mg/dl以及21000FTU以下时，它们对测定结果的干扰均在2％以下(见表5)。

[0067] 表5

[0068]