免疫调节作用增强的乳酸菌的制造方法

摘要

本发明涉及免疫调节作用增强的乳酸菌的制造方法。通过在高于所用乳酸菌的推荐培养温度的温度下培养，细胞壁量和细胞壁厚度增加，得到因该细胞壁量和细胞壁厚度的增加而使免疫调节作用提高了的乳酸菌。本发明的方法无需特殊的培养基或特殊的工序，通过提高乳酸菌的免疫调节功能，即可提供对人具有优异的免疫调节作用的乳酸菌、或者含有该乳酸菌的饮食品、药品或化妆品等。

权利要求

1.一种免疫调节作用增强的乳酸菌的制造方法，其特征在于，包含将乳酸菌在该菌的推荐培养温度的1℃以上、且得到推荐培养温度下培养所得的菌浓度的25～95％的菌浓度的温度下培养的工序，从而得到免疫调节作用增强的乳酸菌。

2.一种免疫调节作用增强的乳酸菌的制造方法，其特征在于，包含将乳酸菌在与该菌的推荐培养温度下培养时相比、细胞壁中的二氨基庚二酸量为1.35倍以上或细胞壁的厚度为106％以上的培养温度下培养的工序，从而得到免疫调节作用增强的乳酸菌。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，乳酸菌的推荐培养温度是30℃或

37℃。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，乳酸菌的推荐培养温度是

30℃，培养温度是31℃～41℃。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，乳酸菌的推荐培养温度是

37℃，培养温度为41℃～44℃。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，乳酸菌是乳杆菌属菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，乳酸菌是戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、发酵乳杆菌、或干酪乳杆菌。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，培养基的渗透压为500～

1000mOsm。

9.一种乳酸菌，其特征在于，用权利要求1～8中任一项所述的方法得到。

10.一种饮食品、药品或化妆品，其特征在于，含有权利要求9中所述的乳酸菌。

说明书

免疫调节作用增强的乳酸菌的制造方法

技术领域

[0001] 本发明涉及免疫调节作用增强的乳酸菌的制造方法。更具体而言，涉及通过增加乳酸菌的细胞壁、即免疫调节成分，使免疫赋活作用和抗过敏作用等免疫调节作用得到了增强的乳酸菌的制造方法。

背景技术

[0002] 近年来，因年龄增加导致免疫下降所引起的传染病增多。众所周知，忙碌的现代社会以及压力环境下的生活也会导致免疫下降，其对策非常令人期待。另外，最近，禽流感等新发传染病、结核等再发传染病猖獗，增强抵御外敌来保护身体的免疫力对于担心免疫力下降的现代人而言很重要。在这样的情况下，当务之急是开发长期发挥免疫调节作用、能维持压力环境下的人们的健康的安全食品。

[0003] 作为具有免疫调节作用的食品材料，已有多种乳酸菌、或含有乳酸菌的乳制品在市场上出售。作为乳酸菌，可以列举乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、片球菌属、肠球菌属等，已知这些乳酸菌具有免疫赋活或抗过敏作用(专利文献1～4)。但是，这些专利文献中公开的免疫赋活作用是试管内或动物实验的结果，关于实际在人身上的免疫调节作用的见解尚未公开。

[0004] 另外，作为增强乳酸菌的免疫调节作用的方法，有在培养时使用玉米浆培养基的方法(专利文献5)、使用含有5～15％盐的培养基的方法(专利文献6)、使用含有0.1～1％表面活性剂和0.01％～0.1％碳酸盐的培养基并在80～120℃下进行5～30分钟热处理的方法(专利文献7)等，但存在原材料增加、工序增加等成本方面的问题。

[0005] 专利文献1：特开2004-18469号公报

[0006] 专利文献2：特开平6-80575号公报

[0007] 专利文献3：特许第3174611号公报

[0008] 专利文献4：特开2000-95697号公报

[0009] 专利文献5：特许第4115181号公报

[0010] 专利文献6：特开2006-28047号公报

[0011] 专利文献7：特开2007-131610号公报

发明内容

[0012] 如上所述，当务之急是开发长期发挥免疫调节作用、能维持压力环境下的人们的健康的安全食品。

[0013] 鉴于上述问题，本发明的目的在于，无需特殊的培养基或特殊的工序，通过提高乳酸菌的免疫调节功能，来提供对人具有优异的免疫调节作用的乳酸菌、或者含有该乳酸菌的饮食品、药品或化妆品等。

[0014] 本发明者发现：将乳酸菌在不同的温度下培养时乳酸菌的生长会发生变化；伴随着该生长变化，细胞壁合成酶基因、细胞壁成分量以及细胞壁的厚度会发生变化。

[0015] 进一步反复研究的结果，令人惊奇地发现：通过在高于所用乳酸菌的推荐培养温度的温度下培养，细胞壁量和细胞壁厚度增加，该细胞壁量和细胞壁厚度的增加使免疫调节作用提高。本发明基于这些发现而完成。

[0016] 即，本发明为下述[1]～[10]。

[0017] [1]一种免疫调节作用增强的乳酸菌的制造方法，其特征在于，包含将乳酸菌在该菌的推荐培养温度的1℃以上、且得到推荐培养温度下培养所得的菌浓度的25～95％的菌浓度的温度下培养的工序，从而得到免疫调节作用增强的乳酸菌。

[0018] [2]一种免疫调节作用增强的乳酸菌的制造方法，其特征在于，包含将乳酸菌在与该菌的推荐培养温度下培养时相比、细胞壁中的二氨基庚二酸量为1.35倍以上或细胞壁的厚度为106％以上的培养温度下培养的工序，从而得到免疫调节作用增强的乳酸菌。

[0019] [3]根据[1]或[2]所述的方法，其特征在于，乳酸菌的推荐培养温度是30℃或37℃。

[0020] [4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其特征在于，乳酸菌的推荐培养温度是30℃，培养温度是31℃～41℃。

[0021] [5]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其特征在于，乳酸菌的推荐培养温度是37℃，培养温度是41℃～44℃。

[0022] [6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其特征在于，乳酸菌是乳杆菌属菌。

[0023] [7]根据[6]所述的方法，其特征在于，乳酸菌是戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、发酵乳杆菌、或干酪乳杆菌。

[0024] [8]根据[1]～[7]中任一项所述的方法，其特征在于，培养基的渗透压为500～1000mOsm。

[0025] [9]一种乳酸菌，其特征在于，用[1]～[8]中任一项所述的方法得到。

[0026] [10]一种饮食品、药品或化妆品，其特征在于，含有[9]中所述的乳酸菌。

[0027] 本发明的乳酸菌或含有该乳酸菌的组合物由于用食品材料制造，因此安全性高，可短期或长期、日常或间隔适当天数持续摄取。因此，当作为饮食品或健康食品摄取时，能通过长期调节免疫功能，从而防止因各种原因引起的免疫功能下降。此外，还能通过调节免疫功能的平衡，防止对生物体有不良影响的免疫功能过度亢进。

[0028] 本发明的乳酸菌还可以用作药品，能缓和或治愈因免疫功能下降或免疫功能过度亢进引起的各种症状，且药效温和。

附图说明

[0029] 图1所示为培养结束时的戊糖乳杆菌S-PT84(FERM BP-10028)的菌浓度。

[0030] 图2所示为培养结束时的戊糖乳杆菌JCM1558T的菌浓度。

[0031] 图3所示为细胞壁构成氨基酸二氨基庚二酸(DAP)测定结果。

[0032] 图4所示为培养温度的不同引起的IL-12诱导能力变化(戊糖乳杆菌S-PT84)。

[0033] 图5所示为培养温度的不同引起的IL-12诱导能力变化(戊糖乳杆菌JCM1558T)。

[0034] 图6所示为培养结束时的植物乳杆菌JCM1149T的菌浓度。

[0035] 图7所示为培养温度的不同引起的IL-12诱导能力变化(植物乳杆菌JCM1149T)。

[0036] 图8所示为培养结束时的干酪乳杆菌JCM1134T的菌浓度。

[0037] 图9所示为培养温度的不同引起的IL-12诱导能力变化(干酪乳杆菌JCM1134T)。

[0038] 图10所示为培养温度变化引起的细胞壁合成酶基因表达量的变化。

[0039] 图11所示为渗透压变化引起的细胞壁合成酶基因表达量的变化(30℃)。

[0040] 图12所示为渗透压变化引起的细胞壁合成酶基因表达量的变化(37℃)。

[0041] 图13所示为细胞壁厚度的测定结果。

[0042] 图14所示为细胞壁厚度不同的乳酸菌的IL-12诱导能力的测定结果(使用图13的菌体)。

[0043] 图15所示为在实际生产规模(1000L)下培养得到的乳酸菌的细胞壁成分量和IL-12诱导能力。

[0044] 图16所示为对人的免疫赋活效果的试验结果(以摄取前的NK活性为100时的NK活性变化量)。

[0045] 图17所示为对人的免疫赋活效果的试验结果(从摄取前开始的IFN-α产生变化量)。

[0046] 图18所示为对人的免疫赋活效果的试验结果(从摄取前开始的Th1/Th2比变化量)。

[0047] 图19所示为各种乳酸菌的细胞壁厚度和IL-12诱导能力。

具体实施方式

[0048] 以下，详细地说明本发明的实施方式。

[0049] <免疫调节作用增强的乳酸菌的制造方法>

[0050] 乳酸菌

[0051] 作为本发明中使用的乳酸菌，可以使用所有的属、种。作为例子，可以列举乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、片球菌属、肠球菌属菌。作为乳杆菌属菌，例如可以列举戊糖乳杆菌。

[0052] 乳酸菌还可以混合使用多种菌。

[0053] 培养温度

[0054] 本发明的方法包含将乳酸菌在该菌的推荐培养温度的1℃以上、且得到推荐培养温度下培养所得的菌浓度的25～95％的菌浓度的温度下培养的工序。优选在得到推荐培养温度下培养所得的菌浓度的30～95％的菌浓度的温度下培养，更优选在得到35～95％、40～95％、45～95％、50～95％的菌浓度的温度下培养。通过进行这样的培养，得到免疫调节作用增强的乳酸菌。

[0055] 推荐培养温度是指各乳酸菌的推荐的培养温度。乳酸菌可分为植物源乳酸菌和动物源乳酸菌，通常植物源乳酸菌的推荐培养温度是30℃，动物源乳酸菌的推荐培养温度是T37℃。例如，植物源乳酸菌戊糖乳杆菌S-PT84(FERMBP-10028)和戊糖乳杆菌JCM1558 的推荐培养温度是30℃。

[0056] “得到推荐培养温度下培养所得的菌浓度的25～95％的菌浓度的温度”是指，相对于推荐培养温度(例如30℃或37℃)下培养时到达的最高菌体浓度，得到到达的最高菌体浓度为25～95％的菌浓度的培养温度。这里，要到达最高菌体浓度，通常需要18小时～36小时左右，可以通过比较例如培养24小时后的菌浓度，来决定上述温度。

[0057] 优选的培养温度因各菌体而不同，但对于推荐培养温度为30℃的菌，若兼顾免疫赋活作用和得到的菌浓度，优选能确保足够的菌数、并能制备免疫赋活作用高的菌体的31～41℃，更优选32℃～40℃的范围。对于推荐培养温度为37℃的菌，若兼顾免疫赋活作用和得到的菌浓度，优选能确保足够的菌数、并能制备免疫赋活作用高的菌体的41～
44℃。

[0058] “与推荐培养温度下培养时相比，细胞壁中的二氨基庚二酸量为1.35倍以上或细胞壁的厚度为106％以上的培养温度”是指，相对于推荐培养温度(例如30℃或37℃)下培养时细胞壁中的二氨基庚二酸量，二氨基庚二酸量为1.35倍以上的温度，或相对于推荐培养温度(例如30℃或37℃)下培养时细胞壁的厚度，细胞壁的厚度为106％以上的温度。这里，细胞壁中的二氨基庚二酸量，可以采用本领域技术人员所知的方法，对将细胞壁的糖链交联的肽构成氨基酸即二氨基庚二酸进行定量来获得。细胞壁的厚度可以通过乳酸菌的电子显微镜观察来求得，例如可以由式“(乳酸菌全长(短径)-细胞质长(内膜外侧～相反侧的内膜外侧)÷2)”来算出。另外，培养温度进一步优选“与推荐培养温度下培养时相比，细胞壁中的二氨基庚二酸量为1.5倍以上或细胞壁的厚度为110％以上的培养温度”，最优选“与推荐培养温度下培养时相比，细胞壁中的二氨基庚二酸量为1.65倍以上或细胞壁的厚度为115％以上的培养温度”。

[0059] 培养所用的培养基，只要是乳酸菌能生长的培养基即可，可以使用奶、MRS培养基、BL培养基、Broth培养基、合成培养基等。

[0060] 渗透压

[0061] 本发明的免疫调节作用增强的乳酸菌的制造方法，通过将培养基的渗透压提高到某一范围，使免疫调节作用进一步得到增强。具体而言，通过使渗透压为500～1000mOsm，在所需的培养温度下培养，使免疫调节作用增强。

[0062] 提高渗透压的方法可以是任何方法，例如可以通过在培养基中添加山梨糖醇等成分来提高。

[0063] 免疫调节作用

[0064] 由本发明得到的乳酸菌具有明显且较强的免疫调节作用。具有较强的免疫调节作用是指，具有1)免疫赋活作用、2)免疫抑制作用、3)免疫平衡的最佳化作用以及4)肠道免疫赋活作用中的至少任一种作用，优选这些作用全部具有，但不限于这些。另外，这些作用并非完全独立，有时相互关联，这对本领域技术人员而言很容易理解。

[0065] 1)免疫赋活作用是指，当免疫功能处于稳定状态或下降状态时使其活化的作用。免疫功能下降的状态是指，例如因高龄、压力、疲劳、睡眠不足等而导致免疫功能下降的情况。本发明的乳酸菌所具有的免疫赋活作用，可以通过添加了本发明的乳酸菌的动物巨噬细胞活化、让人摄取一定时间后末梢血PBMC的NK活性增强且显示抗病毒作用的IFN-α的产生增加等来确认。具体而言，作为巨噬细胞活化引起的免疫赋活作用的评价，可以列举白细胞介素-12(IL-12)产生的测定，本评价至少采用4～5个乳酸菌样品。具体而言，从最
6
终浓度为0.75、2.25、7.5、22.5或75×10 个/mL这5个水平中选择2～3个水平的乳酸菌样品，添加到巨噬细胞中。测定培养24小时后培养上清中IL-12浓度，将IL-12产生被强烈诱导的2～3个样品中显示最高值的水平的结果作为评价对象。

[0066] 2)免疫抑制作用是指，当免疫功能过度亢进时(例如过敏、特应性等)抑制其亢进使其处于合适的免疫状态的作用。例如，可以列举抑制因花粉、螨等抗原引起的过敏反应的作用等。

[0067] 3)免疫平衡的最佳化作用是指，使细胞免疫和体液免疫的平衡最佳化的作用。例如，可以列举细胞因子产生的促进或抑制作用、淋巴细胞活化作用、NK(自然杀伤性细胞)活性增强作用、Th1/Th2平衡改善作用等。

[0068] 4)肠道免疫是指，为排除从鼻子和喉咙或与饮食物等一起侵入肠道的病原因子而存在于肠道粘膜面的防御体系。具体而言，可以列举粘液中产生的IgA产生增强作用、存在于派尔集合淋巴结、肠系膜淋巴结等中的免疫细胞的细胞因子产生增强作用等。

[0069] <乳酸菌>

[0070] 使用本发明的制造方法，能得到免疫调节作用增强的乳酸菌。

[0071] 关于乳酸菌，由本发明的培养方法得到的乳酸菌可以根据需要作进一步处理。例如，将培养结束后的培养基用离心分离、过滤等方法收集菌体而得到的乳酸菌(活菌)、将其冷冻干燥后得到的乳酸菌、或加热处理后得到的乳酸菌等，也可以作为具有免疫调节作用的乳酸菌使用。

[0072] 乳酸菌给予方法，优选经口摄取。关于给予量，例如人的情况下，作为一次给予量，按菌数计可以为1000万～1兆个，进一步优选为1亿个～1000亿个，可以一天1次或分数次给予。摄取的时间没有特殊限制。

[0073] <含有乳酸菌的饮食品、药品或化妆品>

[0074] 本发明涉及的乳酸菌可以用作饮食品、药品或化妆品等。在饮食品中使用时，优选用作具有免疫调节作用的健康食品。此时，可以与公知的基质、助剂、甜味剂、酸味剂、维生素等各种成分混合，制成符合摄取者嗜好的产品。例如，可以以片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、糖果、硬糖、含片、口香糖、果汁粉、功能饮料、调味剂、加工食品、甜点类或点心类等形态提供。若是饮食品的状态，则可以日常摄取本发明的组合物，使其发挥免疫调节功能，维持健康。

[0075] 作为药品时，可以列举免疫赋活剂、抗过敏剂。另外，还可以在主药中使用赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味矫臭剂、助溶剂、悬浮剂、包衣剂等在医药制剂技术领域中常用的公知辅助剂来制成制剂。作为剂形，可以列举丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂、栓剂、注射剂等，没有特殊限制。作为本药品的给予路径，例如可以列举经口给予、直肠给予、经肠给予等，没有特殊限制。

[0076] 本发明的含有乳酸菌的饮食品或药品，作为一次给予量，按菌数计含有1000万～1兆个，进一步优选含有1亿个～1000亿个，但由于本发明的乳酸菌安全性高，因此不存在实质上的上限。

[0077] 以下，通过实施例来详细地说明本发明，但本发明不限于这些。

[0078] 实施例1

[0079] (因培养温度的不同而改变的乳酸菌浓度、细胞壁成分量、白细胞介素-12诱导作用)

[0080] 乳酸菌培养·菌体制备

[0081] 将戊糖乳杆菌S-PT84(FERM BP-10028)和戊糖乳杆菌JCM1558T在MRS培养基中于各温度(25℃～43℃)下培养24小时。

[0082] 培养结束后，8000rpm离心10分钟，收集菌体，用生理盐水洗涤，再离心。然后，用生理盐水洗涤1次，用离子交换水洗涤1次后，用适量的离子交换水重新悬浮，制备乳酸菌悬浮液，测定最终菌浓度(个/mL)。然后，于95℃下杀菌1分钟，进行冷冻干燥。干燥后，测定总重量，算出单位重量的菌数。另外，戊糖乳杆菌S-PT84(FERM BP-10028)和戊糖乳杆T菌JCM1558 的推荐培养温度是30℃。

[0083] 二氨基庚二酸测定法

[0084] 在冷冻干燥菌体中添加6N HCl，于100℃下水解20小时后，用离心式浓缩机(Thermo SCIENTIFIC公司制)蒸发干燥。添加0.05N HCl使其为1mg drycells/mL，用孔径0.2μm的HPLC前处理用盘式过滤器过滤后，供于L-8800型日立高速氨基酸分析仪。作为细胞壁成分的指标，使用将细胞壁的糖链交联的肽构成氨基酸即二氨基庚二酸(以下称为“DAP”)。

[0085] 白细胞介素-12(IL-12)诱导作用的测定

[0086] 向BALB/c小鼠(8周龄·雌)腹腔内给予4.05％巯基乙醇酸盐2mL，4天后用PBS6
回收腹腔内巨噬细胞，使用含有10％FBS的RPMI1640培养基制成2×10cells/mL后，在
6
48孔板上分别以0.5mL播种。向各孔中添加7.5×10 个/mL各培养温度下培养得到的菌体，测定培养24小时后培养上清中的IL-12浓度。由于IL-12的活性形式是p35和p40的亚单位结合而成的p70，因此测定IL-12(p70)。另外，在测定IL-12时，使用OptEIA mouse IL-12测定试剂盒(BD Pharmingen公司制)。

[0087] 培养结束时的戊糖乳杆菌S-PT84(FERM BP-10028)的菌浓度结果如图1所示，戊T T糖乳杆菌JCM1558 的菌浓度结果如图2所示。发现S-PT84(FERMBP-10028)、JCM1558 均在
42℃时下降了25℃下的菌浓度的30％以上、30℃下的菌浓度的75％以上。

[0088] 细胞壁构成氨基酸DAP测定结果如图3所示。S-PT84(FERM BP-10028)，与25℃培T养时相比，30℃培养时几乎倍增，虽有些许增减但随着培养温度的上升而增加。JCM1558 在
31℃以上时，与25℃培养时相比DAP浓度增加，在42℃时最大。另外，与30℃培养时的DAPT
浓度相比，S-PT84(FERM BP-10028)增至3.04倍，JCM1558 增至3.61倍。

[0089] 作为免疫赋活作用的指标，在体外探讨IL-12诱导能力。结果如图4、图5所示。S-PT84(FERM BP-10028)在30℃以上时DAP量随着培养温度的上升而增加，随着DAP量的T
增加，IL-12诱导能力也增加直至41℃为止。JCM1558 在31℃以上时DAP量随着培养温度的上升而增加，与S-PT84(FERMBP-10028)同样，到41℃为止IL-12诱导能力增加。任一菌体的IL-12诱导活性在42、43℃均高于25℃，但与40℃相比活性下降。若只考虑活性，则在
31～43℃具有足够高的免疫赋活作用，但若兼顾菌浓度，为了能确保足够的菌数并制备免疫赋活作用高的菌体，优选31～41℃。

[0090] 实施例2

[0091] (因培养温度的不同而改变的乳酸菌浓度、白细胞介素-12诱导作用)[0092] 乳酸菌培养·菌体制备

[0093] 将植物乳杆菌JCM1149T在各温度(30℃～38℃)下、将干酪乳杆菌JCM1134T在各温度(25℃～44℃)下，在MRS培养基中培养24小时。

[0094] 培养结束后，8000rpm离心10分钟，收集菌体，用生理盐水洗涤，再离心。然后，用生理盐水洗涤1次，用离子交换水洗涤1次后，用适量的离子交换水重新悬浮，制备乳酸菌悬浮液，测定最终菌浓度(个/mL)。然后，于95℃下杀菌1分钟，进行冷冻干燥。干燥后，测定总重量，算出单位重量的菌数。

[0095] 另外，植物乳杆菌JCM1149T的推荐培养温度是30℃，干酪乳杆菌JCM1134T的推荐培养温度是37℃。

[0096] 培养结束后，8000rpm离心10分钟，收集菌体，用生理盐水洗涤，再离心。然后，用生理盐水洗涤1次，用离子交换水洗涤1次后，用适量的离子交换水重新悬浮，制备乳酸菌悬浮液，测定最终菌浓度(个/mL)。然后，于95℃下杀菌1分钟，进行冷冻干燥。干燥后，测定总重量，算出单位重量的菌数。

[0097] 白细胞介素-12(IL-12)诱导作用的测定

[0098] 向BALB/c小鼠(8周龄·雌)腹腔内给予4.05％巯基乙醇酸盐2mL，4天后用PBS6
回收腹腔内巨噬细胞，使用含有10％FBS的RPMI1640培养基制成2×10cells/mL后，在
6
48孔板上分别以0.5mL播种。向各孔中添加7.5×10 个/mL各培养温度下培养得到的菌体，测定培养24小时后培养上清中的IL-12浓度。由于IL-12的活性形式是p35和p40的亚单位结合形成的p70，因此测定IL-12(p70)。另外，在测定IL-12时，使用OptEIA mouse IL-12测定试剂盒(BD Pharmingen公司制)。

[0099] 培养结束时的植物乳杆菌JCM1149T的菌浓度结果如图6所示。发现在38℃时下降了30℃时的菌浓度的44.3％。

[0100] 作为免疫赋活作用的指标，在体外探讨IL-12诱导能力。植物乳杆菌JCM1149T的结果如图7所示。与30℃相比，在31℃～38℃时IL-12诱导能力显示高值，峰值在33℃。若兼顾菌浓度、免疫赋活作用，为了能确保足够的菌数并制备免疫赋活作用高的菌体，优选
31～38℃。

[0101] 培养结束时的干酪乳杆菌JCM1134T的菌浓度结果如图8所示。发现在44℃时下降了37℃时的菌浓度的53.4％。

[0102] 作为免疫赋活作用的指标，在体外探讨IL-12诱导能力。干酪乳杆菌JCM1134T的结果如图9所示。与37℃相比，在39℃～44℃时IL-12诱导能力显示高值，峰值在42℃。若兼顾菌浓度、免疫赋活作用，为了能确保足够的菌数并制备免疫赋活作用高的菌体，优选为41～44℃。

[0103] 实施例3

[0104] (因培养温度的不同而改变的细胞壁合成酶基因表达分析和细胞壁成分量)[0105] 细胞壁合成相关酶表达分析引物

[0106] 根据基因组信息已公开的乳杆菌属的基因信息，制作phospho-N-acetylmuramoyl-pentapeptide转移酶(mraY)和青霉素结合蛋白1A(pbp1A)、青霉素结合蛋白2A(pbp2A)的Q-RT-PCR用引物。关于引物，作为mraY用引物，使用mraY116：aggaaggtcctaagtggca/mraY895actcgctccaacccttcat，作 为 pbp 1A用 引 物，使 用pbp1A304：gccgtcgtctcaatcgaaga/pbp1A1724：gtaccagtcttaccagcttg，作为pbp2A用引物，使用pbp2A592：gcgatgtatttgaataacgc/pbp2A1688：agcatcatactggtcatttc。另外，所有的表达分析均以16S rRNA基因表达为对照，基于戊糖乳杆菌S-PT84(FERM BP-10028)的16S rRNA基因信息制作引物(S-PT84-16S-f：accgacttcgggtgttacaa/S-PT84-16S-r：
cgcctacatgaagtcggaat)。

[0107] 表达诱导条件

[0108] 温度的不同：将乳酸菌在MRS培养基中于30℃下培养16小时后，将2mL培养液接种到100mL MRS培养基中，于30℃、37℃下培养4小时。

[0109] RNA提取和Q-RT-PCR条件

[0110] 使用RNeasy(注册商标)Mini Kit(QIAGEN公司制)，按照试剂盒的操作指南进行RNA提取。为了防止在得到的RNA提取液中混入DNA，在RNA提取液中添加RNase-Free DNase Set(QIAGEN公司制)，于常温下孵育15分钟，将混入DNA分解。以得到的DNase处理RNA溶液为模板。16S rRNA则以DNase处理RNA溶液的100倍稀释液为模板。在含有10μM各引物的反应溶液18μl中加入2μl模板，进行Q-RT-PCR。Q-RT-PCR使用One Step SYBR(注册商标)Prime Script(注册商标)RT-PCR KitⅡ(TaKaRa公司制)，按照试剂盒的操作指南来进行。另外，Q-RT-PCR装置使用Applied Biosystems7300/7500Real-Time PCR System。

[0111] 细胞壁成分量

[0112] 温度：将乳酸菌在MRS培养基中于30℃下培养16小时后，将2mL培养液接种到100mL MRS培养基中，于30℃或37℃下培养24小时。

[0113] 渗透压：将乳酸菌在MRS培养基中于30℃下培养16小时后，将2mL培养液接种到100mL的含有1、3、5、10％(渗透压为490、614、742、1079mOsm)山梨糖醇的MRS培养基(MRS培养基为对照)中，于30℃或37℃下培养24小时。另外，测定OD660。

[0114] 洗涤和冷冻干燥：8000rpm离心10分钟，收集菌体，用生理盐水洗涤，再离心。然后，用生理盐水洗涤1次，用离子交换水洗涤1次后，用适量的离子交换水重新悬浮，制备乳酸菌悬浮液，用血细胞计数器测定最终菌浓度(个/mL)。然后，将乳酸菌溶液在-80℃下冷冻16小时，冷冻干燥3天。用乳钵将冷冻干燥菌体均匀地研碎，制成氨基酸分析用样品。

[0115] 在温度变化实验中，以30℃为对照的相对定量的结果为，37℃下表达量的增加为mraY：2.28倍，pbp1A：4.03倍，pbp2A：4.00倍(图10)。

[0116] 这里，将作为细胞壁成分量指标的二氨基庚二酸表述为DAP。

[0117] 在30℃培养时，相对于对照(未添加山梨糖醇的MRS培养基、24小时)：6
0.138nmol DAP/10cell(OD660：11.2)，仅为含有10％山梨糖醇的MRS培养时，为0.175nmol
6
DAP/10cell(OD660：11.0)，DAP增加1.27倍(图11)。

[0118] 与此相对，在37℃培养时，相对于对照(未添加山梨糖醇的MRS培养基、24小6 6
时)：0.192nmol DAP/10cell，1％时 为0.208nmol DAP/10cell，3 ％时为 0.252nmol
6 6 6
DAP/10cell，5％时为0.263nmol DAP/10cell，10％时为0.233nmolDAP/10cell，DAP的增加分别为1.08倍、1.31倍、1.37倍和1.21倍(图12)。

[0119] 实施例4

[0120] (因培养温度的不同而改变的细胞壁厚度的测定)

[0121] 乳酸菌培养·固定

[0122] S-PT84(FERM BP-10028)在MRS培养基中于25、30和37℃下培养24小时。JCM1558T在MRS培养基中于25和37℃下培养24小时。培养结束后，8000rpm离心10分钟，收集菌体，用生理盐水洗涤，再离心。然后，用生理盐水洗涤1次，用离子交换水洗涤1次后，在球状菌落(pellet)上添加含有2％戊二醛/2％多聚甲醛的PBS，固定。

[0123] 电子显微镜摄影

[0124] 通过离心来制作球状菌落，用蒸馏水洗涤后，用1％高锰酸钾水溶液进行后固定(4℃、1小时)。再次用蒸馏水洗涤，用丙酮脱水后，用Quetol 651(环氧树脂)进行热聚合(60℃、24小时)。用超薄切片机制作超薄切片，用乙酸双氧铀/铅染色液进行双重染色后，用JOEL JEM1200EX进行TEM摄影。

[0125] 细胞壁厚度测定

[0126] 乳酸菌的细胞壁如下来定义。即“选择乳酸菌短径的最长部分，将内膜外侧～细胞外可视界限作为细胞壁”，根据该定义，细胞壁的厚度由下式算出。细胞壁厚度：(乳酸菌全长(短径)-细胞质长度(内膜外侧～相反侧的内膜外侧))÷2

[0127] S-PT84(FERM BP-10028)在25、30、37℃下分别为64.1、66.4和83.5nm，JCM1558T在25℃、37℃下分别为45.2和65.4nm，细胞壁厚度均随温度升高而增加(图13)。另外，用上述方法探讨IL-12诱导能力的结果为，S-PT84(FERMBP-10028)在25、30、37℃下分别为T2.3、2.8、5.2ng/mL，JCM1558 在25℃、37℃下分别为1.5、3.7ng/mL，细胞壁厚度增加使免疫赋活作用增强(图14)。

[0128] 实施例5

[0129] (实际生产规模下的探讨)

[0130] 在实施例1中使用了MRS培养基，但在实际生产规模(1000L培养)下是否也能得到同样的现象，对此进行了探讨。将S-PT84(FERM BP-10028)在由葡萄糖、酵母膏(Aromild、SK酵母膏Hi-K)和离子交换水混合而成的培养基中于25℃(24～26℃)、30℃(29～31℃)以及37℃(36～38℃)下培养24小时(20～28小时)。在各培养温度下分别制作3批，探讨细胞壁成分量、IL-12诱导能力。其结果为，在25、30、37℃下分别
6
为0.033、0.106和0.112nmolDAP/10cell，细胞壁量随着培养温度的升高而增加。另外，IL-12诱导能力分别为38.4、98.4和359.0pg/mL，诱导能力也随着培养温度的升高而增强(图15)。由此显示：即使培养基不同，也会产生同样的现象。

[0131] 实施例6

[0132] (对人的免疫赋活效果)

[0133] 试验方法

[0134] 使用在目前为止的实施例中所证实的那样、细胞壁成分量增加、细胞壁厚度增加的培养温度(37℃)下生产的S-PT84(FERM BP-10028)，探讨对人的免疫赋活效果。

[0135] S-PT84(FERM BP-10028)以被糊精稀释10倍后的稀释物为原料，适当添加赋形剂，制作含有菌数为5、15亿个或45亿个的片剂。通过事先的筛选选出末梢血PBMC的NK活性不足30％的受试者，平均值无差异地分组。在乳酸菌摄取前、开始摄取2周后、开始摄取4周后进行采血，将末梢血PBMC分离，对免疫功能(NK活性、HVJ刺激24小时后的IFN-α产生能力以及PHA刺激24小时后的IFN-γ/IL-4产生比)进行评价。

[0136] NK活性

[0137] 在开始摄取第二周，发现通过摄取15亿个S-PT84(FERM BP-10028)，与开始摄取前相比，NK活性显著增强。另外，在开始摄取第4周，发现S-PT84(FERM BP-10028)用量依存性增加，还发现通过摄取45亿个，与开始摄取前相比，NK活性显著增强(图16)。

[0138] IFN-α产生能力

[0139] 安慰剂摄取组在开始试验2周或4周后的IFN-α产生下降，而S-PT84(FERM BP-10028)摄取组中的任一组的IFN-α产生能力均得以维持或增强，特别是15亿个摄取组，IFN-α产生增加(图17)。

[0140] IFN-γ、IL-4产生能力

[0141] 生物体内存在的辅助性T细胞中存在1型辅助性T细胞(Th1)和2型辅助性T细胞(Th2)。已知从该Th1细胞和Th2细胞分别产生IFN-γ、IL-4，由IFN-γ/IL-4比算出Th1/Th2细胞的平衡。在第二周，安慰剂摄取组偏向Th2，而S-PT84(FERM BP-10028)15亿个摄取组则偏向Th1侧，在第四周S-PT84(FERM BP-10028)用量依存性地偏向Th1(图18)。

[0142] 实施例7

[0143] (其他种乳酸菌的评价)

[0144] 在实施例1、实施例3～实施例5中，对2株戊糖乳杆菌进行了评价，但其他种是否T T也会产生同样的现象，对此进行了探讨。将植物乳杆菌JCM1149、短乳杆菌JCM1059、发酵T
乳杆菌IFO3656、干酪乳杆菌JCM1134 分别在MRS培养基中于各温度(推荐培养温度30℃的乳酸菌为25、30或37℃，推荐培养温度37℃的乳酸菌为30℃或42℃)下培养24小时。
将这些菌体用上述方法进行电子显微镜的TEM摄影，测定细胞壁厚度的同时，探讨IL-12诱导作用。

[0145] 推荐培养温度为30℃的植物乳杆菌JCM1149T和短乳杆菌JCM1059T，随着培养温度的上升，细胞壁的厚度和IL-12诱导作用增加，出现了与戊糖乳杆菌同样的现象(图19)。T
令人惊讶的是，推荐培养温度为37℃的发酵乳杆菌IFO3656和干酪乳杆菌JCM1134 也出现了完全相同的现象(图19)。这些结果显示，因培养温度的上升引起的细胞壁厚度的增加和免疫调节作用的增强是在其他种乳酸菌也会产生的现象。

[0146] 工业上利用的可能性

[0147] 通过在高于所用乳酸菌的推荐培养温度的温度下培养，使细胞壁量和细胞壁厚度增加，得到因该细胞壁量和细胞壁厚度的增加而使免疫调节作用提高了的乳酸菌。本发明的方法无需特殊的培养基或特殊的工序，通过提高乳酸菌的免疫调节功能，即可提供对人具有优异的免疫调节作用的乳酸菌、或者含有该乳酸菌的饮食品、药品或化妆品等。