用于治疗神经退行性疾病或与细胞周期未预期激活相关疾病的包含编码CDK4/CDK6抑制子的诱导型基因的载体

摘要

本发明涉及用于治疗神经退行性疾病的包含(a)在诱导型启动子控制下编码(i)CDK4/CDK6抑制剂，优选p16INK4a，或(ii)干扰CDK4和/或CDK6表达和/或活性的RNA的基因和(b)编码所述启动子的反式激活子蛋白质的基因的载体。这些载体可以转移到细胞中，在细胞中它们发挥保护性功能以(i)防止细胞死亡或(ii)减慢细胞死亡进程。这些载体能用于治疗性应用以预防神经退行性疾病或以治疗效果减慢其进程。

权利要求

1.载体或至少两个载体的混合物，包含

(a)在诱导型启动子控制下，编码(i)干扰细胞周期素依赖性激酶CDK4和/或CDK6生物活性的蛋白质，或编码(ii)干扰CDK4和/或CDK6表达和/或活性的RNA的核酸分子；

和

(b)编码能够结合于和激活(a)的诱导型启动子的反式激活子蛋白质的核酸分子。

2.根据权利要求1所述的载体，其中(a)的核酸分子编码的蛋白质降低或抑制CDK4和/或CDK6的生物活性。

3.根据权利要求1或2所述的载体，其中干扰CDK4和/或CDK6表达的RNA是siRNA、shRNA、microRNA、非编码RNA、核酶或脱氧核酶。

4.根据权利要求1至3任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

5.根据权利要求4所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒或AAV。

6.根据权利要求5所述的载体，其中所述慢病毒是整合缺陷慢病毒。

7.根据权利要求1，2或3所述的载体，其中所述载体是非病毒载体。

8.根据权利要求1至7任一项所述的载体，其中所述载体还包含编码用于细胞特异性定位的肽或多肽的核酸序列和/或包含能够实现细胞特异性表达的核酸。

9.根据权利要求8所述的载体，其中所述用于细胞特异性定位的多肽是识别细胞类型特异性表位的抗体。

10.根据权利要求9所述的载体，其中所述用于细胞特异性定位的肽是识别细胞类型特异性表面结构的肽。

11.根据权利要求1所述的载体，其中所述诱导型启动子是神经元特异性启动子。

12.根据权利要求11所述的载体，其中所述启动子是CamKII启动子。

13.根据权利要求1至12任一项所述的载体，其中反式激活子蛋白质是反向的四环素控制的反式激活子(rtTA)。

14.根据权利要求1至13任一项所述的载体，其中所述干扰细胞周期素依赖性激酶CDK4和/或CDK6生物活性的蛋白质是INK4家族成员。

INK4a INK4B INK4C

15.根据权利要求14所述的载体，其中所述INK4家族成员是p16 、p15 、p18INK4D或p19 。

16.根据权利要求1至13任一项所述的载体，其中所述化合物是Cip/Kip家族成员。

Cip Kip1

17.根据权利要求16所述的载体，其中所述Cip/Kip家族成员是p21 、p27 或Kip2p57 。

18.权利要求1至17任一项所述的载体用于预防或治疗(a)神经退行性疾病或(b)和细胞周期未预期激活相关的疾病的方法。

19.权利要求1至17任一项所述的载体在制备用于预防或治疗(a)神经退行性疾病或(b)和细胞周期未预期激活相关的疾病的药物组合物中的用途。

20.根据权利要求18所述的载体或权利要求19所述的用途，其中所述神经退行性疾病是阿尔兹海默症(AD)。

21.根据权利要求18所述的载体或权利要求19所述的用途，其中所述载体通过增强对流输注应用于神经系统。

说明书

用于治疗神经退行性疾病或与细胞周期未预期激活相关疾

病的包含编码CDK4/CDK6抑制子的诱导型基因的载体

[0001] 本发明提供了包含(a)诱导型启动子控制下，编码(i)CDK4/CDK6抑制子或(ii)干扰CDK4和/或CDK6表达和/或活性的RNA的基因和(b)编码所述启动子反式激活子蛋白质的基因的载体。此载体可被转移到细胞内，在其中它发挥其保护性功能以(i)防止细胞死亡或(ii)减缓细胞死亡进程。此质粒构建体可用于治疗应用如防治神经退行性疾病或以治疗功效减缓其进程。或者，载体构建体可用在发生细胞周期未预期激活的失调症中作为改善疾病策略。因而，在优选实施方案中，本发明是基于影响标的细胞的细胞周期调控的基因治疗方法。此外，经由用于安全基因转移的(i)病毒或(ii)非病毒载体、(iii)细胞类型特异性识别系统、(iv)细胞类型特异性表达系统和(v)经由增强对流输注的可控传输、优选(i)到(v)的组合，还会遇到中枢神经系统造成的基因治疗的现行风险和由于基因治疗的特殊挑战。

[0002] 阿尔兹海默症(AD)是高龄人年龄相关的不可治愈的神经退行性疾病，它对于老龄化社会造成了巨大的社会经济负担。在少于20年(2025)内，欧洲的大约三分之一人口将老于65岁，并且大约四分之一将在80岁以上，并且因而有患痴呆症的风险。欧洲痴呆患者的数目现在估计有大约八百万，到2050年将升高至一千四百万。世界范围内，痴呆患者将以每20年加倍的速度从现在的两千四百三十万增加到2020年的四千二百万，到2040年的八千一百万。2001和2040年间在发达国家的增长速度预测是100％，但在印度、中国及其亚洲邻国为大于300％(Ferri等，2005)。今天在欧洲每年一千六百亿欧元以上的花费已经使AD成为世界上第三昂贵的疾病。到2025年在欧洲用于AD的医疗保险费用将升至两千四百亿欧元。65和100岁之间患AD的终生风险对于男人是33％，而对于女人是45％(van der Flier和Scheltens，2005)。

[0003] AD的特征在于进行性神经退化，是最终导致神经死亡的进行性结构裂变过程。神经元的这个缺失和典型的、然而非特异性的神经病理标志相关，即细胞内神经原纤维缠结和细胞外神经炎斑形式的异常分子聚集物沉积。神经原纤维缠结由高度磷酸化形式的微管相关蛋白tau构成的“成对螺旋纤维”组成。神经炎斑由聚集的Aβ-肽组成，Aβ-肽来自从大得多的淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解切割。神经原纤维缠结和神经炎斑的致病作用还不清楚。然而，迄今为止，缺少在细胞死亡过程中这些分子沉积物的致病作用的证据，看起来它们代表了神经退行的结果而非原因。因此，它们作为用于预防和/或治疗AD的分子靶标的适宜程度可能非常有限。

[0004] AD中的神经退行与异常结构性神经元可塑性相关，特征在于神经元萌发和细胞骨架蛋白的重组(Arendt等，1995A，B，C；1997)。这些过程在细胞内经由Ras-MAP激酶通路异常激活介导(图1)。此通路在疾病极早期被激活并早于任何神经原纤维病理或Aβ积累( 等，1999)。此外，在AD过程中遍及不同脑部区域的神经退行的分布和发展过程符合神经元可塑性模式(即，高度可塑性的脑部区域更早地被涉及到，而低度可塑性的区域只在最高级阶段受到影响)(Arendt等，1998)，显示了神经退行和介导结构可塑性涉及的分子机制间的联系。

[0005] Ras-MAP激酶通路的异常激活，是介导结构可塑性涉及的有丝分裂信号机制(Heumann等，2000；Arendt等，2004)，明显引发了与成熟大脑中神经元的终端分化阶段不一致的多种下游效应，包括细胞周期的再激活。如细胞周期相特异性标记蛋白质的再表达(Arendt等，1996；Arendt 2000，2001，2003)所显示，神经元离开G0期并进行至S期和S期之后。用三种独立方法能得到AD中神经退行进程期间神经元内DNA复制的清晰证据(图2，Mosch等，2007)。在少有神经退行的区域内不发生DNA复制。因为没有进行至M期和M期后的迹象，很可能神经元在G2-M转换时死亡(图1)。

[0006] 目前该疾病的明显原因还未知，并且既没有对危险因子的有效预防也没有对疾病的治疗。AD是残疾的首要原因之一，并且代表了未满足医学需求的最快增长领域。找到能使AD延迟发作五年的治疗将在50年后使患AD的个体数目减半。因此，预防或甚至只是减缓神经退行进程将相当程度上改善老龄人群的生活质量和最优化医疗服务的利用和护理成本效率。

[0007] 因此，本发明潜在的技术问题是提供适用于治疗或预防如AD的神经退行性疾病和此外的与细胞周期未预期激活相关的疾病的方法。

[0008] 通过提供权利要求书中描述的实施方案来完成所述技术问题的解决。在大脑发育和神经退行期间的神经元细胞死亡伴随着以细胞周期调控因子再表达和DNA的部分或甚至全部复制为证据的细胞周期的再激活。观察到此细胞周期再激活过程与这样不同条件下的细胞死亡(如发育性细胞死亡和不同起源的神经退行，例如AD、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病、局部缺血或其他)相关，显示了细胞周期激活和神经元细胞死亡之间的重要联系。支持此假设的进一步证据可以通过多种体外急性细胞死亡范例中细胞周期阻断的神经保护性作用加以提供。

[0009] 在AD中，遍及脑部的神经退行并非均质性分布。其更显示出空间和时间上系统性分布的独特模式。AD中神经元的细胞周期再激活发生于那些更容易发生细胞死亡的神经元，即，为细胞周期再激活所影响的神经元的模式基本与神经退行模式一样。这显示出细胞周期再激活是最终导致细胞死亡的致病链条中的早期事件。因此，在神经元中细胞周期激活的重要分子开关代表了适用于预防和/或治疗神经退行疾病的分子靶标。在产生本发明的实验期间发现经由阻断神经元的细胞周期再进入(优选通过使用允许长期、安全、神经元特异性和调控性转基因表达的新基因治疗工具)能预防进行性的神经退行。

附图说明

[0010] 图1：AD中形态失调引起的细胞内信号事件的示意图

[0011] 这些事件包括p21ras/MAP激酶信号的异常激活、分化调控的缺失、其后的细胞周期再进入和部分完成和最终导致细胞死亡。

[0012] 图2：通过3种独立方法评测的AD中神经元DNA复制

[0013] A：PI染色AD中的神经元后通过激光扫描细胞仪获得明显的4n峰。

[0014] B：以染色体17探针进行显色原位杂交显示AD中的四倍体神经元(右图)和二倍体神经元(左图)。

[0015] C：单个神经元的激光捕获显微切割后PCR扩增alu重复显示AD中额外的4n DNA峰。

[0016] 图3：本发明的治疗概念

[0017] 通过体外(A-D)和体内(E/F)异常表达p16INK4a针对退化进行保护

[0018] A/B：小鼠脑部(ED17)微外植体；B：转染p16INK4a后冈田酸(10nM)诱导的凋亡率降低(TUNEL)。

[0019] C/D：用GFP或pEGFP-N-p16INK4a转染的肝细胞。D：p16INK4a防止星形孢菌素诱导的细胞死亡。

[0020] E/F：具有诱导型神经元特异性表达p16INK4a(CamKII启动子，tet系统)的转基因小鼠的海马体。

[0021] F：诱导p16INK4a表达防止NMDA诱导的神经元死亡(退化神经元的Fluorojade染色：箭头)

[0022] 图4：于转基因小鼠脑皮质中的诱导型神经元特异性表达p16INK4aCamKII启动子控INK4a制的tTA表达使调控tetO/CMVmin启动子连接的p16 表达依赖于强力霉素添加。(左，INK4a
加强力霉素，关闭态；右，无强力霉素，开启态；免疫细胞化学检测p16 )。

[0023] 因此，本发明涉及载体或至少两个载体的混合物，包括

[0024] 在诱导型启动子控制下，

[0025] (a)编码(i)干扰细胞周期素依赖性激酶CDK4和/或CDK6生物活性的蛋白质或(ii)干扰CDK4和/或CDK6表达和/或活性的RNA的核酸分子；和

[0026] (b)优选在诱导剂作用下，编码能够结合于并激活(a)的诱导型启动子的反式激活因子蛋白的(可表达的)核酸分子。

[0027] 核酸分子(a)和(b)可以存在于一个载体中或作为单独实体存在于两个载体中。

[0028] 本领域技术人员知道许多类型的干扰CDK4和/或CDK6表达和/或活性的RNA，例如，RNAi或基于RNA-RNA和/或RNA-蛋白质相互作用的其他机制的具抑制性效果的RNAs。

[0029] 在优选实施方案中，(a)的核酸分子编码的蛋白质降低或抑制CDK4和/或CDK6的生物活性。

[0030] 因此，本发明提供了通过阻断神经元的细胞周期再进入以预防进行性神经退化的新治疗概念。本发明，及其他事物，涉及以高治疗效果和最小化或无副作用地减缓或甚至预防神经退化的基因治疗概念。本发明使用基因治疗方法，将靶标重要分子调控开关CDK4和CDK6来减缓或完全关闭分化神经元中的细胞周期，其将导致细胞获救。所述概念基于抑制细胞周期再进入，神经元中细胞死亡的重要触发物，和通过下调CDK4和/或CDK6来完成，INK4a例如通过(i)它的生理抑制剂p16 或其他抑制剂的异常表达和(ii)干扰CDK4和/或CDK6表达和/或活性的RNA的使用。

[0031] 本发明所基于的概念的原则性效果已在体外和体内条件下被证实。通过在暴露于INK4a神经元凋亡强诱导剂如冈田酸的脑切片培养物中异常表达p16 (CDK4和CDK6的分子抑制剂)能证明高效神经元保护作用(图3)。

[0032] 此外，在CamKII启动子和tet表达系统控制下、允许时间依赖性可调控和专一神INK4a经元特异性表达p16 的转基因小鼠模型中，能够证实对于NMDA诱导的凋亡和缺血性细胞死亡的神经保护效应(图3)和降低的凋亡相关胶质反应。这强有力地显示，例如，通过INK4a
异常表达p16 下调CDK4(G0-G1转换的主要分子开关)复原分化神经元表型和从多种实验性退化条件下的细胞死亡中拯救神经元及其他细胞类型。

[0033] 优选的能调控(细胞周期活化的重要分子开关)CDK4和CDK6活性的CDK抑制剂INK4a INK4B INK4C INK4D属于INK4家族(特别优选p16 、p15 、p18 和p19 )或Cip/Kip家族(特别优选
Cip Kip1 Kip2
p21 、p27 和p57 )。关于抑制CDK4/CDK6，单独的INK4和Cip/Kip抑制剂具有组织和细胞特异性质。

[0034] 本领域技术人员熟悉另外的可用于降低或抑制编码CDK4和/或CDK6的基因的表达和/或CDK4和/或CDK6的活性的方法。例如，近年来出现了小干扰RNAs(siRNA)、小发夹RNAs(shRNA)、microRNA、非编码RNA形式的基于RNA干扰(RNAi)的基因沉默，作为用于研究细胞培养物及体内基因表达的有价值的工具(Bantounas等，2004；Zhou等，2006)。靶标mRNA识别和其下调的策略基于所谓的“小干扰核酸”的反义作用，其中包括了反义寡核苷酸、催化型核酸—核酶和脱氧核酶及小干扰RNAs(RNAis)。所有这些核酸经由序列特异性的Watson-Crick碱基配对识别标的分子(如编码CDK4或CDK6的基因)和导致与信使RNA形成互补性复合物。这些抑制性核酸的作用机制不同。反义寡核苷酸当结合于标的分子时形成DNA-mRNA二聚体并通过“杂交阻滞”阻止翻译或激活核糖核酸酶并导致RNA降解(Stein和Cheng，1993)。核酶和脱氧核酶经催化机制促进了RNA磷酸二酯键裂解(Emilsson等，2003)。反义、核酶和脱氧核酶策略被广泛用于设计治疗应用的核酸(Christoffersen和Marr，1995；Lewin和Hauswirth，2001；Opalinska和Gewirtz，2002)。
近年里不同的反义寡核苷酸和核酶已成为许多临床前和临床试验的主题(Kurreck，2003)，包括体外治疗HIV-1感染患者(Sullenger和Gilboa，2002)。此外，第一个反义寡核苷酸Fomivirsen(Vitravene)已被成功引入治疗细胞巨化病毒感染的艾滋患者(Highleyman，
1998)。核酸技术也被认为是用于治疗中枢神经系统(CNS)紊乱的可能的治疗方法。
Trülzsch和Wood(2004)以及Gonzales-Alegre和Paulson(2007)总结了鉴定CNS标的基因的最新成果和抑制方法的使用。

[0035] 本领域技术人员还知道用于上述基于RNA的干扰CDK4和/或CDK6表达的优选标的的CDK4和CDK6的区域。用于基因沉默方法的优选区域的例子是：

[0036] (a)cdk4或cdk6 mRNA的3’UTR区域；

[0037] (b)cdk4或cdk6 mRNA的5’UTR区域；

[0038] (c)cdk4或cdk6 mRNA的编码区域(CDR)；

[0039] (d)基因组内含子或外显子(例如，单独外显子1或与一个或多个另外外显子的组合)；和

[0040] (e)启动子区域。

[0041] 靶标上述区域(a)到(d)任何一个的优选RNA是：microRNAs(例如mir124a、mir34、mir16)、nc(非编码)RNAs、核酶、siRNAs或shRNAs。

[0042] 直接转染(例如通过简单的基于脂质方法)沉默试剂有某些缺点，包括外源运送RNAis的低沉默活性、基因沉默的瞬时效应和诱导所谓“脱靶”效应(诱导非靶标基因的沉默)。在治疗中应用RNA干扰的最关键局限之一是运输RNAi分子到标的细胞中的低效率。它们被细胞内的核酸酶快速降解使得长期研究(和潜在的治疗应用)实质上不可能进行。
此外，某些细胞类型(例如原代神经元)传统上非常不容易被裸露核酸所转染。为增加敲低的长效性，RNAi序列被改编成包括一段介导形成发夹结构(shRNA)的间隔，以使有义和反义序列形成碱基对。这样发展出用于表达shRNA的基于载体的系统，由此在polIII(例如U6、H1)启动子控制下表达沉默核酸。更近一些，microRNA穿梭被用于运输shRNAs，并且这个方法的重要特征在于可以在病毒载体中使用polIII启动子(例如CMV或突触蛋白)。
在病毒载体中包括任何这些表达元件从而使得有效运输和编码CDK4或CDK6的基因的长期沉默。

[0043] 这样，在优选的实施方案中，本发明提供载体，其中用于基于RNAi的CDK4和/或CDK6表达的沉默的RNA是siRNA、shRNA、microRNA、非编码RNA、核酶或脱氧核酶。

[0044] 通过使用用于安全基因转移的(i)病毒和(ii)非病毒载体、(iii)细胞类型特异性识别系统、(iv)细胞类型特异性表达系统、(v)可调控的转基因表达系统和优选(i)到(v)一个或多个的组合，会遇到关于运输试剂用于基因调控的现行风险和中枢神经系统造成的特异挑战(例如缺少长期基因表达、在非神经元细胞中未受控制和不想要的转基因表达和不可控的转基因表达强度)。通过细胞类型特异性识别和表达系统和(vi)增强对流输注(CED)相结合将实现广泛的、然而细胞类型特异性靶向分布的表达。

[0045] 基因治疗性工具的模式特征使得在可选的规范内改变上述概念用于治疗广泛的多种其他神经系统疾病(其中细胞的未预期细胞周期再进入非常重要)，例如帕金森氏病、中风、肌萎缩性脊髓侧索硬化症或增生性玻璃体视网膜病变。此外，它适用于广泛的非神经系统疾病(其中非神经元细胞的未预期细胞周期再进入非常重要)，例如癌症、免疫增生性疾病、心脏肥大、动脉粥样硬化，肾小球肾炎，牛皮癣，艾滋病及其他(表1；Arendt，2008)。除AD之外，恶性肿瘤和心血管疾病(三者一起是卫生保健系统的三个主要负担)也在这个新策略的直接焦点内。

[0046] 表1

[0047] 包含可作为细胞周期抑制剂治疗的潜在靶标的细胞周期调控子的疾病[0048]

[0049] 对于控制编码干扰CDK4和/或CDK6生物活性的蛋白质的核酸分子的表达，已经有不同的、建立好的开/关调控系统来调控基因表达。基本上，它们由两个不同表达单位组成：(A)携带为诱导型启动子(特征(a))所控制的相关基因的单位；(B)携带反式激活蛋白(优选其组成型表达并能够结合介导诱导型启动子活性的激活或抑制的特异性底物(特征(b))的另一单位。对于(B)，已经发展了至少以下六个系统用于人类或啮齿动物并且其可用于本发明：(i)Tet开/关(Gossen和Bujard，1992；Gossen等，1995；Baron和Bujard，2000)；(ii)Pip(原始霉素诱导蛋白)开/关(Fussenegger等，2000)；(iii)大环内酯类响应性E.REX技术(Weber等，2002)；(v)抗孕酮依赖性(Wang等，1997)；(v)蜕皮激素依赖性(Christopherson等，1992；No等，1996)和(vi)里帕霉素依赖性系统(Rivera等，1996；
Liberles等，1997)。

[0050] 优选Tet开/关系统因为其最适合应用于患者，因为：

[0051] (i)人类很好地耐受诱导剂强力霉素(Dox)；

[0052] (ii)和强力霉素已被广泛用作抗生素；

[0053] (iii)强力霉素为脂溶性并具有相当的(包括脑部的)组织渗透性(Ueberham等，2005)，这是个用tet系统发展CNS基因治疗的前提；

[0054] (iv)口服强力霉素使得体内快速和剂量依赖性的基因诱导/抑制转换(Aurisicchio等，2001)；

[0055] (v)Tet系统已经被用于产生调控基因表达的病毒和非病毒载体；和

[0056] (vi)使得分级转录响应，因为在个别细胞中基因表达的水平直接与诱导剂剂量相关。

[0057] 在Tet开(Tet-on)系统中，四环素操纵子(rtetR)的反向抑制子被融合于单纯孢疹病毒VP16转录因子来建立反向的四环素-调控反式激活因子(rtTA)。在四环素或其类似物强力霉素存在时，这个结合于诱导型启动子和激活相关基因转录。诱导型启动子由融合于细胞巨化病毒最小启动子(CMVmin)的Tet操纵子tetO组成。

[0058] 可以以下列策略进一步降低这些系统中潜在的高基础表达：

[0059] ●使用由修饰的TRE元件和改变的最小化CMV启动子组成的严谨TRE构建体将降低相关基因的基础表达。

[0060] ●用融合于tetO序列的弱的神经元特异性启动子(CamKII或突触蛋白)替换CMV启动子也会在进一步增加神经元特异性的同时降低基础活性。类似的策略已被成功用于改编白蛋白启动子(Zabala等，2004)。

[0061] ●有两种不同的杂合抑制子，其与TRE响应性启动子相互作用并在缺少强力霉素时积极沉默基础表达：[a]融合于人类Kox-1蛋白抑制子结构域(KRAB)的细菌tetR蛋白和[b]融合于人类Mad-1结构域的tetR蛋白，Mad-1涉及招募mSin3-组蛋白乙酰基转移酶复合物。对于本发明，优选KRAB抑制子蛋白和使用tetR-Mad-1的策略。

[0062] ●第四个方法是如前所述(Saqr等，2006)在CamKII启动子和反式激活序列之间克隆tTS沉默子序列(四环素控制的转录沉默子，它特异性结合于TRE并在缺少强力霉素时进一步抑制转录)。

[0063] ●可选地，携带反式激活子和TRE的构建体的变化比例或延迟作用会改善tet系统严谨性。可选地，可以使用携带相反方向的两个tet元件来降低基础背景的单个可调控脑特异性载体。如有必要而且表达水平太低，可考虑在3’末端引入土拨鼠(woodchuck)转录后调控元件(WPRE)。

[0064] ●在基于非整合游离体的载体(启动子和抑制子/反式激活子元件克隆于单独的载体)中引入可调控表达系统将使得根据治疗需要调整表达，并且这样会进一步增强治疗安全性。这样有可能通过改变病毒比例来控制相对表达水平并因此避免与单个载体系统和整合事件相关的问题。而且，非整合载体不形成也会改变表达谱的复杂的游离体多联体(见于必须以高滴度使用的AAV载体)。

[0065] 本领域技术人员知道多种可用于本发明的病毒载体。例如，慢病毒载体是用于运输基因到中枢神经系统中的可选工具。它们具有相对大的转基因容量(8-10kb)，可以生成至高滴度，具有低免疫原性，并且不像逆转录载体，能够有效转化有丝分裂期后的神经元以生成稳定和长期的转基因表达(参见Wong等，2006)。在进入标的细胞后，慢病毒载体稳定整合于宿主基因组。通过使用非整合型病毒载体如腺相关载体(AAV)能避免涉及插入突变的安全问题。AAV载体能有效转化神经元细胞类型并具有低免疫原性(参见Tenenbaum等，2004)，然而它们为转基因容量(4-5kb)所限制并且也曾显示整合于小鼠的活性基因(Nakai等，2003)。更有前途的是，最初被描述成不能胜任转化分裂细胞(Case等，1999；Naldini等，1996)的整合缺陷的慢病毒载体最近显示在体外(Lu等，2004；Saenz等，2004；
Vargas Jr.等，2004)和体内(Yanez-Munoz等，2006；Nightingale等，2006)维持转基因表达。这些载体通过整合酶基因编码序列中的突变致其整合缺陷，并且在核内以不具有任何复制信号的环状存在。在成年CNS中，在啮齿动物视觉和脑部组织观察到源自这样的整合缺陷慢病毒载体的有效持久转基因表达。此外使用这些载体运输治疗性基因介导了拯救视网膜退化的啮齿动物模型(Yanez-Munoz等，2006)。因此，特别优选整合缺陷的慢病毒载体。

[0066] 此外，本领域技术人员知道能用于本发明的多种非病毒载体。除病毒载体介导的运输以外，并且作为病毒载体介导的运输的可选替代，非病毒载体介导的基因转移已被成功用于包括CNS的不同器官。最近综述了导致肿瘤抑制的不同临床有效方法(Ohlfest等，2005b)。非病毒载体可能有几个优势。它们(i)容易生成；(ii)它们构建简单和(iii)潜在地比病毒载体更安全。还有(iv)没有不可控复制的风险和(v)相较于病毒载体它们的合成比较便宜(部分因为它们可在无哺乳动物细胞系统中容易地生产)。与病毒载体相反，(vi)人类没有已存的针对非病毒载体的免疫能干扰转染效率和产生潜在副作用(Bessis等，2004)。

[0067] 例如，分支和线性聚乙烯亚胺(PEIs)显示出有效和万能的基因运输。PEIs是带正电并且缩合带负电的DNA到200纳米以下的尺寸，有利于进入细胞和导致内含体破裂。分支程度影响转染效率(Kichler，2004)。PEIs可能特别有希望用于靶标CNS，具有几个优势：(i)当施用于CNS时DNA/PEIs能被很好地耐受(Lemkine等，2002；Ohlfest等，2005a；
Oh等，2007)；(ii)脑部是吸引PEI的靶点，在那里PEIs被发现甚至在全身给药后高度富集(Johansson等，2004)。为增强细胞特异性(iii)可以偶联PEIs于具有标的细胞表面受体高度亲和性的不同配体。

[0068] 在更优选的实施方案中，本发明的载体或载体混合物还包括编码用于细胞特异性定位的肽或多肽的核酸序列。例如通过偶联非病毒载体于针对细胞特异性表面受体的肽和多肽(优选抗体)可以实现细胞类型特异性定位。

[0069] 选择细胞表面上的合适分子靶标结构对于细胞类型特异性基因运输很关键(Kircheis，2001)，并且需要考虑以下方面：抗体应该具有(i)对于神经元的强特异性，它们应该是(ii)无毒的和(iii)在体内不导致或只导致降低的免疫细胞激活。此外，(iv)它们不应干扰关键的生理功能。在此使用的术语“抗体”描述了天然或部分或全部合成生产的免疫球蛋白。此术语也包括了具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的任意蛋白质。这些蛋白质能源白天然来源，或者部分或全部合成生产。抗体的例子是同型免疫球1
蛋白和Fab、F(ab)2、scFv、Fv、dAb和Fd片段。

[0070] 适当的靶标以酪氨酸激酶(Trk)A受体为代表，其特异性定位于AD中最早也最严重受影响的类胆碱神经元上(Arendt等，1983)。在结合TrkA受体之后，完整的Ab-TrkA受体复合物被内摄(LeSauteur等，1996)。当其与生理配体NGF一起出现时，这使得偶联PEIs恰好内摄。可选地，可以使用抗NGF抗体。在结合NGF后，抗体-NGF复合物也结合于TrkA受体，然后与单独NGF相比加速了内摄(Saragovi等，1998)。在另一实施方案中，将特异性靶标类胆碱神经元的可选细胞表面分子，如p75神经营养蛋白受体(p75NTR)、神经元细胞粘附分子(NCAM)和烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)。

[0071] 在另一实施方案中，最近用于穿梭裸露RNAi到神经元的改性狂犬病毒糖蛋白(rvg)(Kumar等，2007)将偶联于PEIs，其有利于转运RNAi的稳定。众所周知，p75NTR、NCAM和nAChR在细胞表面结合狂犬蛋白质并促进内摄。在此实施方案中，肽的内生趋向神经性被用于特异性靶标AD中选择性影响到的类胆碱神经元。此外，这使得易于通过血脑屏障，其反过来使这个工具外周施用。

[0072] 为了只在待治疗的标的组织或器官如脑中实现表达，本发明载体的核酸分子可以连接于组织特异性启动子并用于基因治疗。因此，在另一优选实施方案中，通过表达的细胞特异性控制(如通过神经元特异性启动子)能实现细胞类型特异性表达。已经描述了并在体内用多种穿梭/表达系统测试了很多偏好神经元的启动子(Hioki等，2007)。CamKII和突触蛋白(SYN)启动子具有很多优势，因为它们专有表达于神经元中(Kugler等，2003)。其他启动子如CMV和U1 snRNA主要介导神经胶质细胞中的基因表达。NSE启动子对于神经元只有相对特异性，并还在神经胶质细胞中表达。SYN启动子显示出最高的神经元表达特异性(＞96％)(Hioki等，2007)，并且已经成功应用于产生具有神经元特异性表达p21ras的转基因小鼠((Heumann等，2000；Arendt等，2004；Gartner等，2005；Seeger等，2005；Alpar等，2006)。最近论证了CamKII启动子的高度神经元特异性(Ueberham等，2005；2006)。

[0073] 还可以通过(a)按照Hioki等(2007)通过用融合CMV增强子生成杂合启动子来增强启动子活性或(b)在3’非翻译区引入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)进一步改善相关基因的表达水平(Paterna等，2000)。

[0074] 本发明还提供如上所述载体用于预防或治疗(a)神经退行性疾病或(b)与细胞周期未预期激活相关的疾病的方法。

[0075] 本发明还涉及使用如上定义的(a)载体在制备用于预防或治疗(a)神经退行性疾病或(b)与细胞周期未预期激活相关的疾病的药用组合物中的用途。在优选的实施方案中，所述神经退行性疾病是阿尔兹海默症(AD)。

[0076] 优选地，药用组合物还包含药物可接受的载体。合适的药物载体等的例子为本领域所熟知，且包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂、例如油/水乳剂、多种类型润湿剂、消毒溶液等。这样的载体可以传统方法配制并以适当剂量施用于受试者。适当组合物的施用可以通过不同方式生效，如通过静脉内、腹腔内、皮下、肌肉内、局部或皮内施用。当然，施用路线取决于疾病如AD的本质、其定位和药物组合物中包含的化合物的种类。给药方案将由主治医师和其他临床因素决定。如医学领域众所周知，用于任意一名患者的剂量取决于很多因素，包括患者的身量、体表面积、年龄、性别、施用的特殊化合物、施用的时间和方式、疾病(如AD)的种类和阶段、一般健康状况和其他同时施用的药物。

[0077] 可以通过(例如)直接应用到靶标位点(如脑部)或通过(例如)鞘内、脑脊髓内、鼻内、腹腔内或口服施用来实现本发明载体的运输。

[0078] 血脑屏障对于运送治疗剂(如病毒载体介导的基因治疗或PEIs)到脑部代表着相当大的障碍。发展技术来有效越过这个屏障将改革神经系统疾病的处理。可以通过在施药前动脉内注射浓缩甘露醇溶液来实现渗透压破坏血脑屏障。尽管这个方法可能瞬时打开内皮细胞紧密连接，但药物会累积在下层基底膜而限制组织渗透(Muldoon等，1999)。

[0079] 相反地，传送增强式运输(CED)使用直接植入脑部或脊髓的极细的颅内导管(小于0.4毫米外径)。沿这些导管以精确控制的低灌输速度(0.5到10微升/分钟)灌输药物导致药物分布于脑部细胞外空间中(Krauze等，2005)。因此，通过准确地定位导管顶端和使用不能穿过血脑屏障的治疗剂，有可能分散药物到分离的神经解剖学结构中，限制全身毒性的风险。这在运输基因治疗中明显提供巨大优势。

[0080] CED超越直接颅内药物运输的其他方法(如软组织内、脑心室内和鞘内注射，还有胶囊化细胞和生物可降解的聚合体)的基本优势在于CED不依赖于扩散来实现足够的药物分布。CED沿导管顶端和脑部细胞外空间之间产生的压力梯度来分配治疗剂。因此，对比依赖于扩散的技术(其导致不均匀、短距离、沿浓度梯度的药物分布)，CED使得药物在长距离(达到距导管顶端5厘米)上不管其分子大小有可控的均匀分布(Gill等，2003；Gillies等，2005)。这个在用于使用少量灌输导管治疗临床上大体积脑部的载体运输上明显提供巨大的优势。

[0081] 以下实施例阐明了本发明。

[0082] 实施例1

[0083] 以3种不同方法评估AD中神经元DNA复制的研究

[0084] (A)基于载片的细胞计数(SBC)

[0085] 使用激光扫描细胞仪(LSC，CompuCyte Corporation，Cambridge，MA，USA)和合适的软件WinCyte，3.4版来完成SBC。如前面所述优化用于本发明的SBC的条件(Lenz等，2004；Mosch等，2006)。记录关于每个荧光事物的大小、周长、在目标载片上的x-y位置和最大值(最大像素)及总的整体荧光强度。对于每个样本扫描海马旁回的80,000到120,000个分析细胞。通过整体PI荧光值确定细胞的相对DNA含量，并且进一步用细胞周期软件ModfitLT，2.0版(Verity Software House Inc.，Topsham，ME，USA)分析这些数据。用这种方法能够清楚区分包含2n、2n到4n或4n的DNA量的细胞群体(图2A)。当绝大多数细胞表现为2n峰，对于AD脑部可明显获得额外的4n峰(箭头)，这在年龄相仿的健康对照脑部是没有的。

[0086] (B)显色原位杂交(CISH)

[0087] 用靶标染色体17着丝粒的α-卫星序列的ZytoDotCEN 17探针(ZytoVision，Bremerhaven，Germany)完成杂交。使用过氧化物酶偶联来自羊的抗地高辛抗体的Fab段(Boehringer-Mannheim，Mannheim，Germany)和硫酸镍铵/DAB/0.015％双氧水作为生色物能免疫组化观察到地高辛标记的探针。滴落至目标载片的固定的人淋巴细胞和在标准条件下培养并生长在盖玻片上的Hela细胞用作对照。对于每个案例分析贯穿内嗅皮质所有皮层取样的400到500个神经细胞核。以染色体17探针做显色原位杂交(CISH)一致显示了所有细胞类型(包括神经元、星形胶质细胞和神经胶质细胞)中不同的杂交点。在杂交脑部切面后，对于对照和AD患者的内嗅皮质中的多数神经元获得两个杂交点。此外，很少能观察到没有、有一个或三个点的神经元。图2B显示出在重症AD案例中的神经元，具有两个点(左)和四个点(右)(箭头)。比例尺：10微米。

[0088] (C)显微切割和定量PCR

[0089] 经神经丝(SMI311)免疫反应鉴定的单个神经元用激光显微切割器(PALMMicroBeam，P.A.L.M.Microlaser Technologies AG，Bernried，Germany)自脑部切片切出并随后进行DNA定量。单独的神经元的DNA含量通过实时PCR扩增alu重复(Walker等，2003)来定量，alu是在真核生物基因组中的一组短的散布的元件，其在灵长类中达到大约一百万拷贝数(Houck等，1979；Batzer和Deininger，2002)。选择Alu重复是因为它们与真核基因组中其他短的分散元件相比具有高拷贝数和低水平多态性(Roy-Engel等，2001)。通过个体内比较每个患者的两个不同脑部区域避免了几个个体间不同拷贝数或单核苷酸多态性的人工影响造成的残存的风险。Alu寡聚核苷酸引物alu-for5`-GTGGCTCACGCCTGTAATCCC-3`和alu-rev 5`-ATCTCGGCTCACTGCAACCTC-3`定位 于alu重复的保守区域，用“Primer3”程序(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)设计。在Rotor-Gene 2000(Corbett Research，Sydney，Australia)中完成了实时PCR定量。以Rotor-Gene 2000软件Rotorgene(4.6版)分析数据，用PlotIT
3.2(SPE Software，Quebec，Canada)完成统计分析。和人脑部组织同一处理的人淋巴细胞用作对照。分别从一单个和两个淋巴细胞得到2.07皮克±0.6(平均值±标准偏差)和
4.06皮克±0.5的DNA量。对于每个案例，至少20个取样自内嗅皮质所有层面的SMI311-免疫反应性的细胞以显微切割器捕获和进行PCR。

[0090] CISH之后，在同样案例中还通过激光捕获显微切割内嗅皮质中神经元(经显微镜和随后PCR扩增alu重复分别鉴定)分析单个细胞DNA量。用此方法获得的单个细胞DNA量的频度分布显示于图2C(上方图)。比较AD和对照，向更大类群的迁移和分布形式的不同变得明显。对照群分布具有单一最大值为2.5到3.5皮克每细胞，这相应于如在最初确认试验中所确定的2n DNA量的大小。此外，AD群在6.5-7.5皮克每细胞大小的群中显示出第二最大值，最有可能代表四倍体神经元(4n)(图2C，下方图)。

[0091] 实施例2

[0092] 克隆p16INK4a和生成转基因小鼠

[0093] 为克隆p16INK4a分离了人成纤维细胞RNA，使用随机pdN6引物和Superscript II RT(Gibco)反转录和使用以下特异性引物对：p16-forward：5’-GAG AAC AGA CAA CGG GCG GCG和p 16-revers：5’-CCT GTAGGA CCT TCG GTG ACT扩增获得的cDNA。

[0094] 琼脂糖凝胶电泳之后用确定克隆连接试剂盒(sure clone ligation kit，INK4aPromega)克隆p16 序列于克隆载体(即来自PUC18系列[Promega])产生pUC18-p16。
转化此质粒于氯化钙感受态JM109E.coli细胞并在氨苄青霉素存在的琼脂平板上培养。挑取一个克隆，培养于LB培养基，用Qiagen Maxi-prep分离质粒并测插入序列。用限制性酶INK4a
切下p16 插入并进一步亚克隆于pSinRep5载体(其事先经限制性酶在多克隆位点线性化)中。pSinRep5载体属于Sindbis表达系统，其购自Invitrogen(“Sindbis Expressions INK4a
System”；Invitrogen；catalog-Nr.K750-01)。新产生的pSinRep5-p16 载体被线性化并用SP6多聚酶转录RNA。也用SP6多聚酶从DH-BB辅助质粒中转录RNA。DH-BB辅助RNA和SinRep5-p16RNA以lipofectin(购自Gibco)混合并加入到培养的BHK细胞。在此共转染
24小时后移去培养基，以2000x g离心以去除细胞碎片和使用剩下的含有Sindbis-p16病毒的上清液作为病毒储存液用于实施例3所示的实验。

[0095] 从pUC18-p16质粒出发用限制性酶切下p16INK4a序列和进一步亚克隆于表达载体pEGFP-N(Clontech)，用于实施例3所示的实验。

[0096] 为生成转基因小鼠，用以下包含MluI和HindIII位点、使得亚克隆到pBI 载体的特异性引物对(p16-Mlu-F：ctcacgcgtagcgggagcagcatggagccggcg；p16-Hind-R：atcaagINK4a INK4acttgctctggttctttcaatcggggat)扩增p16 cDNA产生pBI-p16 。使用异源的tTA系INK4a
统生成带有诱导型神经特异性特异p16 表达的转基因小鼠。简单讲，携带荧光素酶和INK4a INK4a
p16 的双向转录单元的转基因株系ptetp16 (C57Bl/6-DBA背景并通过以传统方法显微INK4a
注射pBI-p16 到小鼠卵母细胞生成)个体与反式激活株系CamKII(C57Bl/6-NMRI背景)个体杂交。动物住在持续的12:12小时的日夜循环下并喂以标准chow饲料(chow diet)(Altromin 1324，Altromin Gesellschaft für Lage，Germany)，在所有条
件下能自由采食接触到水/盐酸强力霉素溶液。动物实验按照1986年11月24日的欧洲理事会指令(86/609/EEC)进行并经地方当局核准。

[0097] 盐酸强力霉素(Sigma，Deisenhofen，Germany，Dox)溶解于水中到50微克/毫升并于棕色瓶中提供，一周换两次以防止转录。通过纯水取代强力霉素来诱导转基因蛋白质INK4a表达。P16 表达小鼠和对照用于实施例3所述的实验中。

[0098] 实施例3

[0099] 通过体外和体内异常表达p16INK4a进行针对退行性疾病的保护

[0100] (A)体外神经保护实验(结果显示于图3A+B)

[0101] 大鼠脑部切片用(A)Sindbis病毒或(B)Sindbis-p16INK4a病毒转化。在用冈田酸(10nM OA，24h)处理大鼠脑部切片诱导神经细胞死亡后，用4％PFA孵育脑部切片和用dUTP-Rhodamin进行TUNEL反应。图3A：红色标记Sindbis转化的微植体中许多凋亡神经INK4a元。图3B显示Sindbis-p16 转化的培养微植体(TUNEL：dUTP-Rhodamin)，说明了具有较低数目凋亡神经元的降低的神经元细胞死亡。

[0102] (B)体外神经保护实验(结果显示于图3C+D)：

[0103] 用lipopfectamine法以pEGFP-N(C)或pEGFP-N-p16(D)构建体转染原代小鼠肝细胞和体外培养于6孔板。在24小时后加星形孢菌素入培养基中来诱导凋亡。当pEGFP-N转染的肝细胞死亡、显示为细胞出泡(C)时，pEGFP-N-p16转染的细胞存活(D)。

[0104] (C)体内神经保护(结果显示于图3E+F)

[0105] 以NMDA处理P16INK4a表达小鼠(在从饮用水中去除强力霉素后表达转基因INK4a INK4a INK4aP16 )和P16 不表达小鼠(因在饮用水中加入强力霉素抑制转基因P16 表达)。用立体定向仪器加以NMDA(2μgNMDA/μl PBS；注射速度0.1μl/min；注射时间5min；区域：
注入海马)。在14天存活时间后杀死小鼠，以4％多聚甲醛灌注脑部和Fluorojade染色切INK4a INK4a
片来检测死亡神经元。与具有抑制p16 表达的小鼠(图3E)对照，p16 表达小鼠显示低数目的凋亡神经元(图3F)。

[0106] Fluoro-Jade B是阴离子荧光染料，其选择性染色细胞体和退化神经元的进程。该方法轻微改编自最初所述的方法(Schmued等，1997)。切片安放在(2％)明胶包被的载片上，50℃空气干燥50分钟并浸入含有1％氢氧化钠(在80％乙醇中)溶液中3分钟。在70％乙醇中孵育1分钟和在蒸馏水中洗涤2分钟之后，转移载片到摇床台上的0.06％高锰酸钾溶液中15分钟。在蒸馏水中漂洗(1分钟)后，在Fluoro-Jade B染色液中孵育载片20分钟。为制备染色液，在100毫升蒸馏水中溶解10毫克Fluoro-Jade B(Histo-Chem Inc.，Jefferson，USA)并用90毫升0.1％乙酸稀释10毫升此储存液来提供染色液。染色后，以水漂洗载片、干燥和封片。应用NeurolucidaTM软件(5.05.4版，MicroBrightField Inc.，Williston，USA)，用系列Fluoro-Jade B染色切片确定病变量。简单讲，在每十张Fluoro-Jade B染色切片上圈出病变处，并通过NeurolucidaTM软件确定截面积。

[0107] 实施例4

[0108] 与强力霉素存在时抑制转基因p16INK4a表达(图4，左)相比，在去除强力霉素后转INK4a基因小鼠皮层(神经元)中的p16 诱导型神经元特异性表达(图4，右)

[0109] 用异源tTA系统(Baron和Bujard，2000；Gossen和Bujard，1992；Gossen等，INK4a INK4a1995)生成了带p16 [tTACamKIIa/tTA响应性启动子(Ptet)p16 ]诱导型神经元特异性表达的转基因小鼠。在此tTA系统中，反式激活子(tTA)，E.coli来源的tet抑制子(tetR)DNA结合结构域和来源自单纯孢疹病毒(Gossen和Bujard，1992)的VP16蛋白的反式激活结构域的融合蛋白，被置于CamKIIa启动子的控制下，以使神经元特异性表达tTA蛋白。tTAINK4a
蛋白能特异地结合于tet操纵子(tetO)序列并随后诱导自临近的与转基因(p16 )结合的细胞巨化病毒(CMV)最小化启动子的转录。四环素或其衍生物强力霉素(Dox)能阻止tTAINK4a
结合到tetO和停止任何克隆于CMV启动子之后的转基因的反式激活(此处阻止p16 表INK4a
达)。对比而言，去除强力霉素使得诱导转基因表达(此处允许p16 表达)。

[0110] 为此目的使用了一小鼠株系，带有染色体整合的ptetp16INK4a载体(Ueberham等，INK4a2008)，由在双向启动子Ptet-bi1(Baron等，1995)控制下的p16 和荧光素酶cDNA组成。
INK4a
为生成这个ptetp16 株系，用以下含有MluI和HindIII限制性内切酶位点、使得亚克隆到pBI-5载体(CVU89934，GenBank at NCBI，Bethesda，MD，USA；(Baron等，1995；Baron和Bujard，2000)的特异性引物对(p16-Mlu-F：ctcacgcgtagcgggagcagcatggagccggcg；
INK4a
p16-Hind-R：atcaagcttgctctggttctttcaatcggggat)扩增人的p16 cDNA(见上文)，生INK4a INK4a
成质粒pBI-p16 。质粒pBI-p16 用限制性内切酶线性化并用于通过传统卵母细胞注射生成转基因小鼠(C57Bl/6-DBA背景)。用标准PCR方法检验所得基础小鼠的转基因性。
INK4a INK4a
pBI载体由共遗传的荧光素酶和p16 cDNA双向转录单位组成，但在Ptetp16 小鼠株系中保持沉默。

[0111] 为获得神经元特异性表达，Ptetp16INK4a株系和表达为钙-钙调蛋白激酶IIa启动子所控制的反式激活子蛋白(tTA)的小鼠株系(tTACamKIIa-株系B；C57Bl/6-NMRI背景INK4a(Mayford等，1996))杂交。为阻止发育中p16 的不受控表达，当动物怀孕时，在饮用水中提供溶解于5％的蔗糖水溶液的盐酸强力霉素(Dox；0.05mg/mL；Sigma，Taufkirchen，Germany)。每隔一天准备新鲜溶液。在饮用水中获得同剂量强力霉素的非转基因同胞小鼠INK4a
不显示药物的毒性效应。通过从饮用水中去掉强力霉素、代为供给纯水可实现诱导p16表达。动物住在恒定的12:12小时日夜循环下并喂以标准chow饲料(Altromin 1324，Altromin Gesellschaft für Lage，Germany)，在所有自由采食条件下都
能接触到水或水/盐酸强力霉素溶液。动物实验按照1986年11月24日的欧洲理事会指令(86/609/EEC)进行并经地方当局核准。

[0112] 结果显示于图4：CamKII启动子控制的tTA表达使得tetO/CMVmin启动子连接的p16INK4a表达的调控依赖于强力霉素的施用(左边，加强力霉素，关闭态；右边，无强力霉素，开启态)。

[0113] 用于定义：质粒pBI-5用于生成pBI-p16INK4a(质粒)载体；载体pBI-p16INK4a用于生成Ptetp16INK4a小鼠株系。

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