MIR-208和MIR-499在治疗心脏病症中的双重靶向

摘要

本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗或预防心脏病症的方法，其通过抑制miR-499和miR-208两者在该受试者的心脏细胞中的表达或功能来进行。具体地，公开了用于施用所述两种miRNA的抑制剂的特定方案，所述抑制剂实现有效的、长期的遏制。另外，本发明提供了一种用于在有需要的受试者中治疗或预防肌肉骨骼病症的方法，其通过提高miR-499和miR-208两者在该受试者的骨骼肌细胞中的表达或活性来进行。

权利要求

1.一种在有需要的受试者中治疗病理性心脏肥大、心肌梗死、或心力衰竭的方法，包括对所述受试者施用miR-208a或miR-208b的抑制剂和miR-499的抑制剂，其中miR-208a或miR-208b和miR-499的表达或活性在施用后的所述受试者的心脏细胞中降低。

2.权利要求2的方法，其中所述miR-208a或miR-208b的抑制剂和所述miR-499的抑制剂是反义寡核苷酸。

3.权利要求1的方法，其中所述miR-208a或miR-208b的抑制剂和所述miR-499的抑制剂是共施用的。

4.权利要求3的方法，其中所述miR-208a或miR-208b的抑制剂和所述miR-499的抑制剂由表达载体编码。

5.权利要求4的方法，其中所述miR-208a或miR-208b的抑制剂和所述miR-499的抑制剂由同一表达载体编码。

6.权利要求1的方法，其中顺序施用所述miR-208a或miR-208b的抑制剂和所述miR-499的抑制剂。

7.权利要求6的方法，其中在所述miR-499的抑制剂前施用所述miR-208a或miR-208b的抑制剂。

8.权利要求6的方法，其中在所述miR-208a或miR-208b的抑制剂前施用所述miR-499的抑制剂。

9.权利要求6的方法，其中相隔至少24小时施用所述miR-208a或miR-208b的抑制剂和所述miR-499的抑制剂。

10.权利要求1的方法，其中以约1mg/kg至约200mg/kg的剂量施用所述miR-208a或miR-208b的抑制剂和所述miR-499的抑制剂。

11.权利要求1的方法，其中miR-208a或miR-208b和miR-499的表达或活性在施用所述抑制剂后的所述受试者的心脏细胞中降低大于60％。

12.权利要求1的方法，其中心脏压力响应在施用所述抑制剂后的所述受试者中降低。

13.权利要求12的方法，其中所述心脏压力响应包括所述受试者的心脏细胞中降低的α-MHC表达和/或升高的β-MHC表达。

14.权利要求12的方法，其中在施用所述抑制剂后小于8周发生所述心脏压力响应的降低。

15.权利要求12的方法，其中在施用所述抑制剂后小于4周发生所述心脏压力响应的降低。

16.权利要求12的方法，其中在施用所述抑制剂后小于1周发生所述心脏压力响应的降低。

17.一种在有需要的受试者中治疗或预防肌肉骨骼病症的方法，包括对所述受试者施用miR-208a或miR-208b的激动剂和miR-499的激动剂，其中miR-208a或miR-208b和miR-499的表达或活性在施用后的所述受试者的骨骼肌细胞中升高。

18.权利要求17的方法，其中所述miR-208a或miR-208b的激动剂和所述miR-499的激动剂是编码成熟miR-208a或miR-208b和/或miR-499序列的多核苷酸。

19.权利要求18的方法，其中所述miR-208a或miR-208b的激动剂和所述miR-499的激动剂在表达载体上编码。

20.权利要求17的方法，其中所述miR-208a或miR-208b的激动剂和所述miR-499的激动剂是共施用的。

21.权利要求17的方法，其中顺序施用所述miR-208a或miR-208b的激动剂和所述miR-499的激动剂。

22.权利要求21的方法，其中在所述miR-499的激动剂前施用所述miR-208a或miR-208b的激动剂。

23.权利要求21的方法，其中在所述miR-208a或miR-208b的激动剂前施用所述miR-499的激动剂。

24.权利要求17的方法，其中所述骨骼肌细胞中的一种或多种快速骨骼肌基因的表达在施用所述miR-499和miR-208激动剂后降低。

25.权利要求24的方法，其中一种或多种快速骨骼肌基因选自下组：肌钙蛋白I2、肌钙蛋白T3、快速骨骼肌球蛋白轻链、和α骨骼肌动蛋白。

说明书

MIR-208和MIR-499在治疗心脏病症中的双重靶向

[0001] 对相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2009年2月4日提交的美国临时申请No.61/149,915的权益，通过提述将它们都完整并入本文。

[0003] 关于政府资助的声明

[0004] 本发明是在国家卫生研究院授予的拨款号(Grant Number)HL53351-06下在政府支持下做出的。政府具有本发明的某些权利。

[0005] 关于电子提交的文本文件的说明

[0006] 通过提述将随此电子提交的文本文件的内容完整并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：MIRG_013_01WO_SeqList_ST25.txt，记录日：2010年2月1日，文件大小5千字节)。发明领域

[0007] 本发明涉及通过施用调控微小RNA(miRNA)活性或表达的药剂来治疗心脏和肌肉骨骼病症。具体而言，本发明提供了一种用于治疗或预防心脏病症的方法，其通过抑制miR-208a/miR-208b和miR-499两者在受试者(包括人)的心脏细胞中的表达或活性来进行。另外，本发明提供了一种用于治疗或预防肌肉骨骼病症的方法，其通过提高miR-208b和miR-499两者在受试者的骨骼肌细胞中的表达或活性来进行。

[0008] 发明背景

[0009] 心脏病及其表现，包括冠心病、心肌梗死、充血性心力衰竭和心脏肥大，清楚地呈现了美国当今的一项重大健康风险。诊断、治疗和支持罹患这些疾病的患者的花费完全达到数十亿美元。心脏病的两项特别严重的表现是心肌梗死和心脏肥大。

[0010] 心肌梗死(通常称为心脏病发作)是由于突然且持续缺乏向心脏组织的血流(其通常是冠状动脉变窄或阻塞的结果)引起的。没有足够的供血，组织变得缺血，这导致心肌细胞(例如心脏肌肉细胞)和血管结构的死亡。源自心肌细胞死亡的坏死组织一般被瘢痕组织替换，所述瘢痕组织没有收缩性，无助于心脏功能，而且常常通过在心脏收缩期间扩张或通过增加心室的大小和有效半径而在心脏功能中发挥有害作用，例如变成肥大。

[0011] 心脏肥大是心脏对实际上所有形式心脏病(包括那些源自高血压、机械负荷、心肌梗死、心脏心率失常、内分泌病症、和心脏收缩蛋白质基因中遗传突变)的适应性应答。虽然肥大性应答最初是提高心排血量的代偿机制，但是持久的肥大能导致扩张性心肌病(DCM)、心力衰竭、和猝死。在美国，每年有大约50万人诊断出心力衰竭，死亡率大约50％。

[0012] 众多信号传导途径，尤其是那些牵涉异常钙信号传导的，推动心脏肥大和病理性重塑(Heineke和Molkentin，2006)。响应压力而发生的肥大性生长涉及与响应锻炼而发生的生理性肥大不同的信号传导途径和基因表达样式。压力介导的心肌肥大是与众多不良后果有关的复杂现象，其中独特的分子和组织学特征引起心脏发生纤维组织形成、扩张和代偿失调，这经由心肌细胞变性和死亡而常常以心力衰竭达到极点。因此，对于解释根本的分子机制和为遏制不良心脏生长及最终衰竭发现新的治疗靶物很感兴趣。了解这些机制对于设计治疗心脏肥大和心力衰竭的新疗法是至关重要的。

[0013] 最近提出微小RNA涉及多种生物学过程，包括对发育时机、凋亡、脂肪代谢、和造血细胞分化等的调节。微小RNA(miRNA)指自常常编码多种密切相关miRNA的多顺反子转录物、自蛋白质编码基因的内含子、或自各miRNA基因衍生的，长度为约18个至约25个核苷酸的小型、非蛋白质编码RNA。参见Carrington等的综述(Science，第301卷(5631)：336-338，2003)。miRNA起靶mRNA的阻抑物的作用，这通过促进它们的降解(当它们的序列完美互补时)或通过抑制翻译(当它们的序列含有错配时)来实现。

[0014] miRNA由RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III；参见Qi等(2006)Cellular & Molecular Immunology第3卷：411-419)转录，而且源自称作初级miRNA转录物(pri-miRNA)的初始转录物，它们一般长数千碱基。pri-miRNA在细胞核中被RNA酶Drosha加工成约70个至约100个核苷酸的发夹形前体(pre-miRNA)。转运至细胞质后，发夹pre-miRNA被Dicer进一步加工以生成双链miRNA。然后将成熟miRNA链并入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，在那里它通过碱基对互补性与它的靶mRNA结合。在相对罕见的、miRNA与mRNA靶物完美碱基配对的情况中，它促进mRNA降解。更常见的是，miRNA与靶mRNA形成不完美的异源双链体，从而影响mRNA稳定性或抑制mRNA翻译。

[0015] 最近，发明人报告了一种心脏特异性微小RNA，即miR-208a，它是由α-肌球蛋白重链(MHC)基因的内含子编码的，而且是响应心脏压力而上调β-MHC表达和遏制心脏中的快速骨骼肌基因所需要的(van Rooij等，(2007)Science，第316卷：575-579)。本发明扩展了此发现，而且提供了一种用于治疗心脏和肌肉骨骼病症的新的治疗方法。

[0016] 发明概述

[0017] 本发明部分基于如下的发现，即miR-208a和miR-499两者在心脏细胞中的系统性下调对响应压力的心脏肥大形成、收缩性增强、和病理性心脏重塑产生协同影响。发明人已经令人惊讶地发现了，通过同时或顺序施用miR-208a和miR-499抑制剂来下调miR-208a和miR-499两者，从而显著缩短用于调节压力相关基因诸如β-MHC表达的时段。与仅下调miR-208a情况中观察到相似的效果所需要的几个月延迟相比，此类双重靶向对压力相关基因表达产生立即的影响。因而，本发明提供了一种用于在有需要的受试者(包括人)中治疗病理性心脏肥大、心力衰竭、和心肌梗死的新的治疗方法。

[0018] 在一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用miR-208a或miR-208b的抑制剂和miR-499的抑制剂，其中miR-208a或miR-208b和miR-499的表达或活性在施用后的所述受试者的心脏细胞中降低。在一些实施方案中，miR-208a或miR-208b和miR-499的表达或活性在施用所述抑制剂后的受试者的心脏细胞中降低大于60％。所述miR-208和miR-499抑制剂包括antagomir或反义寡核苷酸。在一个实施方案中，所述miRNA抑制剂在表达载体上编码。

[0019] 在另一个实施方案中，心脏压力响应在施用miR-208a或miR-208b的抑制剂和miR-499的抑制剂后的受试者中降低。心脏压力响应包括心肌细胞的肥大、心脏的纤维化、所述受试者的心脏细胞中α-MHC表达降低、和/或β-MHC表达升高。在某些实施方案中，在施用miR-208a/miR-208b和miR-499抑制剂后小于2个月发生心脏压力响应的降低。在一个优选的实施方案中，在施用抑制剂后小于1周发生心脏压力响应的降低。

[0020] 在一些实施方案中，顺序施用miR-208a/miR-208b抑制剂和miR-499抑制剂。两种抑制剂的施用可以以可为大约几分钟至几周的时间间隔分开。在一个实施方案中，相隔至少24小时施用miR-208a/miR-208b抑制剂和miR-499抑制剂。在另一个实施方案中，共施用miR-208a/miR-208b抑制剂和miR-499抑制剂。可以各以约1mg/kg至约200mg/kg的剂量施用两种抑制剂。

[0021] 本发明还提供了一种在有需要的受试者中治疗或预防肌肉骨骼病症的方法，包括对所述受试者施用miR-208的激动剂和miR-499的激动剂，其中miR-208和miR-499的表达或活性在施用后的受试者的骨骼肌细胞中升高。在一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用miR-208b的激动剂和miR-499的激动剂。miRNA激动剂可以是编码成熟miR-208a、miR-208b、或miR-499序列的多核苷酸。在一些实施方案中，此类多核苷酸与启动子序列可操作连接，并在表达载体中提供给受试者的细胞。

[0022] 可以共施用或以特定时间间隔分开顺序施用miRNA激动剂。在一些实施方案中，一种或多种快速骨骼肌基因在受试者的骨骼肌细胞中的表达在对受试者施用miR-499和miR-208a或miR-208b激动剂后降低。一种或多种快速骨骼肌基因可包括肌钙蛋白I2、肌钙蛋白T3、快速骨骼肌球蛋白轻链、和α骨骼肌动蛋白。

[0023] 附图简述

[0024] 图1.MiR-208敲除动物展现出响应胸主动脉缩窄而发生的心脏肥大和纤维化较小。A.示意性显示了胸主动脉缩窄(TAB)规程(左侧)。在TAB规程或假规程(右侧)后用于Masson三色染色的野生型和miR-208-/-小鼠的心脏的组织学切片。miR-208的缺乏减少进行TAB达21天的野生型小鼠中看到的肥大和纤维化。B.在假规程或TAB规程后的野生型和miR-208-/-动物的心脏中的β-肌球蛋白重链(β-MHC)、心房利钠因子(ANF)、和脑利钠肽(BNP)的相对表达水平。C.在假规程或TAB规程后对野生型和miR-208-/-动物的心脏中的α-MHC和β-MHC蛋白水平的Western分析。检测GAPDH作为加载对照。

[0025] 图2.miR-208的长期敲低表型模拟miR-208敲除动物中对压力响应的抑制。A.合成的寡核苷酸的序列靶向成熟的miR-208序列(SEQ ID NO：16)。错配对照序列与反-miR-208序列(SEQ ID NO：17)相比含有四个碱基错配。B.实时PCR分析显示了用反-miR-208寡核苷酸处理的动物的心脏中miR-208的有效敲低。C.在假规程或胸主动脉缩窄(TAB)规程后在接受反-miR-208寡核苷酸(反208)或错配对照(mm)的动物的心脏中的β-肌球蛋白重链(β-MHC)、心房利钠因子(ANF)、和脑利钠肽(BNP)的相对表达水平。
虽然响应TAB而诱导压力标志物ANF和BNP，但是接受反-miR-208的动物显示βMHC表达的诱导降低。

[0026] 图3.Myh7b和miR-499受miR-208调节。Northern印迹显示野生型(+/+)、miR-208杂合子(+/-)和miR-208敲除(-/-)小鼠的心脏中的miR-499的表达。在野生型和突变体小鼠中miR-208与miR-499，及Myh7b的表达之间有正相关。测量GAPDH的表达作为对照。

[0027] 图4.Myh7b和miR-499在心脏和慢速骨骼肌肉中表达。A.Northern分析指示miR-499在心脏和慢速骨骼肌肉(例如比目鱼肌)中表达。针对Myh7b的RT-PCR显示miR-499与其宿主基因共表达。B.在心脏和四种骨骼肌肉类型(腓肠肌/跖肌(GP)、胫骨前肌(TA)、趾长伸肌(EDL)、和比目鱼肌)上对miR-499的实时PCR分析确认miR-499主要在心脏和比目鱼肌中表达。仅可在TA和EDL中检测出微少水平的miR-499表达。C.原位杂交指示在胚胎发生期间，Myh7b在心脏和体节中特异性表达。

[0028] 图5.MiR-499不影响肌球蛋白表达。A.对Myh7b的RT-PCR分析显示miR-499的遗传删除不影响其宿主基因Myh7b的表达。GP-腓肠肌/跖肌；TA-胫骨前肌；EDL-趾长伸肌。测量GAPDH的表达作为对照。B.对来自野生型(WT)、杂合子(+/-)、和miR-499敲除(KO)动物的心脏的α-和β-MHC两者的Western印迹分析显示miR-499的删除不影响任一种基因在蛋白质水平的表达。C.丙基硫尿嘧啶(PTU)(其阻断甲状腺激素生物发生，而且是β-MHC的强诱导物)在野生型(WT)和miR-499敲除(KO)动物两者中都产生α-MHC的降低和β-MHC的升高。

[0029] 图6.通过体内敲低miR-208来调节miR-499。A.在指定量的反-miR-208寡核苷酸或盐水(Sal)的尾静脉注射后三天对miR-208和miR-499表达的Northern分析。B.处理后2个月对注射单剂80mg/kg反-miR-208、在连续两天注射两剂80mg/kg反-miR-208、或注射错配对照寡核苷酸(mm)的动物的心脏组织的miR-208和miR-499表达的Northern分析。C.在用单剂反-miR-208、在连续两天用两剂反-miR-208、或在连续两天用两剂错配寡核苷酸处理后2个月对心脏组织中的miR-208、miR-499、miR-208b、α-MHC、Myh7b、和β-MHC表达的实时PCR分析。D.在反-miR-208(单剂80mg/kg或连续两剂80mg/kg)或错配(mm)对照处理后2个月对心脏组织中的β-MHC表达的Western印迹分析。

[0030] 图7.miR-208和miR-499的双重靶向。A.对野生型和miR-499敲除动物的心脏组织中的miR-208、miR-208b和miR-499的Northern分析显示响应PTU的miR-208b的强诱导。MiR-208b与β-MHC共表达，而且指示其表达。在miR-499敲除动物中，miR-208b的诱导与野生型相当。然而，miR-499敲除动物中的miR-208敲低遏制PTU对miR-208b表达的诱导。B.在存在和没有PTU的情况中对野生型动物、miR-208敲除动物、miR-499敲除动物、和用反-miR-208处理的miR-499敲除动物的心脏组织中的miR-208、α-MHC、和β-MHC的实时PCR分析。

[0031] 发明详述

[0032] 心脏和骨骼肌肉通过调控调节收缩效率的肌球蛋白各同等型的表达来响应多种病理生理刺激，诸如工作负荷、甲状腺激素信号传导和损伤。

[0033] 在成人心脏中的α-与β-MHC同等型的比率是心脏收缩性的一项主要决定因素。β-MHC(即成人心脏中主要的肌球蛋白同等型)展现出相对较低的ATP酶活性，而α-MHC具有较高的ATP酶活性。在对多种病理学刺激诸如心肌梗死、高血压、和其它病症的响应中，β-MHC表达升高，而α-MHC表达降低，因此肌原纤维ATP酶活性降低，而且降低心脏肌原纤维的缩短速度，这导致最终的收缩功能障碍。显著的是，心脏的α-MHC含量的微小变化对心脏性能可具有深刻的影响。

[0034] 最近，本发明人报告了一种心脏特异性miRNA，即miR-208a，它是由α-肌球蛋白重链基因的内含子编码的，而且是在心脏中响应心脏压力而上调β-MHC表达和遏制快速骨骼肌基因所需要的(参见共同未决申请WO2008/016924，通过提述而完整并入本文)。

[0035] 最近，本发明人还已经发现了，miR-208a也是密切相关的miRNA(即miR-499，其由Myh7b基因的内含子编码)的心脏表达所需要的(参见共同未决申请PCT/US08/71837，通过提述而完整并入本文)。Myh7b和miR-499在心脏中的以及在慢速骨骼肌中的表达受到MEF2转录因子(条纹肌肉基因表达的一种信号依赖性调节物)的控制。miR-499或miR-208的受迫表达足以在体内介导快速向慢速肌纤维的转换。miR-208和miR-499能负调节Thrap1(一种甲状腺激素受体辅调节物)和转录因子PUR家族各成员的表达，它们继而负调节β-MHC在心肌和骨骼肌中的表达。Sox6发挥慢速纤维类型特异性基因的阻抑物的功能。Sox6表达在野生型肌管中的敲低导致β-MHC表达的显著升高。对β-MHC启动子的分析揭示了一种Sox共有序列，这提示Sox6在心脏中的胎骨骼肌纤维类型分化和β-MHC调节中起关键作用。这些发现揭示了Myh基因通过编码控制收缩性和信号响应性的调节性miRNA而调节条纹肌肉的基因表达样式的一种共同调节性机制(van Rooij等(2009)Developmental Cell，Vol.17：662-673)。

[0036] 本发明部分基于如下的发现，即在心脏细胞中下调miR-208和miR-499两者在遏制心脏压力响应方面产生协同效应。在心脏细胞中抑制miR-208a表达导致β-MHC的压力诱导的表达降低。然而，此效果直到施用miR-208抑制剂后2个月才被观察到。本发明人已经令人惊讶地发现了对miR-208a和miR-499两者的抑制导致在施用后几乎立即遏制压力诱导的β-MHC表达，如此加速对心脏压力响应的影响。因而，根据这些发现描述了通过同时或顺序调控miR-208和miR-499表达来操作骨骼和心脏肌肉基因表达的策略，以治疗和预防心脏病。

[0037] MiR-208a位于α-MHC基因的内含子内。精确的内含子位置取决于具体的物种和具体的转录物。例如，在人类中，miR-208a是在α-MHC基因的第28内含子内编码的，而在小鼠中，它是在第29内含子内编码的。下文分别以SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、和SEQ ID NO：4显示了人、小鼠、大鼠、和犬的miR-208a的pre-miRNA编码序列。SEQ ID NO：5中提供了成熟miR-208a序列。与α-MHC一样，miR-208a仅仅在心脏中表达。

[0038] 人pre-miR-208a(SEQ ID NO：1)

[0039] ACGGGCGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GATGCTCACG TATAAGACGA

[0040] GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A

[0041] 小鼠pre-miR-208a(SEQ ID NO：2)

[0042] ACGGGTGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GACTCTCACG TATAAGACGA

[0043] GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A

[0044] 大鼠pre-miR-208a(SEQ ID NO：3)

[0045] ACGGGTGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GACTCTCACG TATAAGACGA

[0046] GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A

[0047] 犬pre-miR-208a(SEQ ID NO：4)

[0048] ACGCATGAGC TTTTGGCTCG GGTTATACCT GATGCTCACG TATAAGACGA

[0049] GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A

[0050] 成熟的miR-208a(SEQ ID NO：5)

[0051] AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU

[0052] 对miR-499基因的基因组位置的分析显示它包含在Myh7b基因(即α-MHC基因的一种同源物)的第20内含子内。分别在SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQID NO：12中提供了小鼠、大鼠、人、犬、负鼠、鸡和热带爪蟾(X.tropicalis)的miR-499的pre-miRNA编码序列。SEQ ID NO：13是小鼠前体序列的茎-环结构，而SEQ ID NO：14是成熟的miR-499序列。Myh7b基因在脊椎动物中是保守的，而且仅在心脏和慢速骨骼肌肉(例如比目鱼肌)中表达。

[0053] 小鼠pre-miR-499(SEQ ID NO：6)

[0054] TCCCTGTGTC TTGGGTGGGC AGCTGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAGCT

[0055] CCTCTGCATG TGAACATCAC AGCAAG

[0056] 大鼠pre-miR-499(SEQ ID NO：7)

[0057] TCCCTGTCTT GGGTGGGCAG CTGTTAAGAC TTGCAGTGAT GTTTAGCTCC

[0058] TCTCCATGTG AACATCACAG CAAG

[0059] 人pre-miR-499(SEQ ID NO：8)

[0060] CCCCTGTGCC TTGGGCGGGC GGCTGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAACT

[0061] CCTCTCCACG TGAACATCAC AGCAAG

[0062] 犬pre-miR-499(SEQ ID NO：9)

[0063] CCCTTGCACC CTGGGCGGGC GGCCGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAACT

[0064] CCTCTCCACG TGAACATCAC AGCAAG

[0065] 负鼠pre-miR-499(SEQ ID NO：10)

[0066] CCCCTGCCTC CCCGGCGGGC AGCTGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAATT

[0067] CTTCTCTATG TGAACATCAC AACAAG

[0068] 鸡pre-miR-499(SEQ ID NO：11)

[0069] GGAGCGGCAG TTAAGACTTG TAGTGATGTT TAGATAATGT ATTACATGGA

[0070] CATCACTTTA AG

[0071] 热带爪蟾pre-miR-499(SEQ ID NO：12)

[0072] GTCTTAGCGA GGCAGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAGTT AAAATCTTTT

[0073] CATGAACATC ACTTTAAG

[0074] 小鼠pre-miR-499序列的茎-环(SEQ ID NO：13)

[0075] GGGUGGGCAG CUGUUAAGAC UUGCAGUGAU GUUUAGCUCC UCUGCAUGUG

[0076] AACAUCACAG CAAGUCUGUG CUGCUGCCU

[0077] 成熟的miR-499(SEQ ID NO：14)

[0078] UUAAGACUUG CAGUGAUGUU U

[0079] 本发明人还已经发现了基因组含有第二种型式的miR208a(称作miR-208b)，其在β-MHC基因内位于内含子31，而且与β-MHC一样，miRNA208b仅在心脏和慢速骨骼肌肉(例如比目鱼肌)中表达。受miR-208b调节的基因包括例如Sp3、肌肉抑制素(Myostatin)、PURβ、THRAP1、和快速骨骼肌蛋白基因。此miRNA的序列与在“种子区”(即限定某些miRNA的mRNA靶物的区域)中具有100％同源性的miR-208a在很大程度上重叠。如此，miR-208b可对人的心脏和骨骼肌肉收缩性具有深刻的影响。pre-miR-208b序列在数个哺乳动物物种(例如人、小鼠、大鼠、和犬)间是保守的。下文显示了pre-miR-208b序列及成熟的miR-208b序列：

[0080] pre-miR-208b(SEQ ID NO：18)

[0081] TTTCTGATCC GAATATAAGA CGAACAAAAG GTTTGTCTGA GGG

[0082] 成熟的miR-208b(SEQ ID NO：19)

[0083] AUAAGACGAA CAAAAGGUUU GU

[0084] 应当理解，在需要脱氧核糖核苷酸的实施方案中使用本文中所公开的RNA序列时，用胸苷残基替换尿苷残基。类似地，在需要核糖核苷酸的实施方案中，用尿苷残基替换本文中所公开的DNA序列中的胸苷残基。

[0085] 在一个实施方案中，本发明提供了一种在有需要的受试者(包括人)中治疗病理性心脏肥大、心肌梗死、或心力衰竭的方法，其通过在受试者的心脏细胞中靶向miR-208(例如miR-208a和/或miR-208b，或者换言之miR208a/miR208b)和miR-499中的任一种或两种的表达和/或活性来进行。在一些实施方案中，对受试者施用miR-208a/miR-208b的抑制剂和miR-499的抑制剂以降低miR-208a/miR-208b和miR-499在受试者的心脏细胞中的表达或活性。

[0086] 在另一个实施方案中，有需要的受试者可有风险形成病理性心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死。此类受试者可展现出一种或多种风险因子，包括但不限于长期存在的不受控制的高血压、未矫正的瓣膜病、慢性咽峡炎、近期的心肌梗死、对心脏病的先天性素因或病理性肥大。所述有风险的受试者可以诊断为具有心脏肥大的遗传素因或者可具有心脏肥大的家族史。

[0087] 优选的是，miR-208a/miR-208b的抑制剂和miR-499的抑制剂两者对受试者的施用导致受试者中心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的一种或多种症状的改善，或者导致自心脏肥大向心力衰竭的转变的延迟。所述一种或多种得到改善的症状可以是例如升高的运动能力、升高的心脏射血体积、降低的左心室舒张末期压、降低的肺毛细血管楔压、升高的心排血量、升高的心排血指数、降低的肺动脉压、降低的左心室收缩和舒张末期内径、降低的心脏纤维化、心脏肌肉中降低的胶原沉积、降低的左和右心室壁压、降低的壁张力、升高的生命质量、和降低的疾病相关发病率或死亡率。

[0088] 在本发明的一个实施方案中，心脏压力响应在施用miR-208(例如miR-208a和/或miR-208b)和miR-499抑制剂后的受试者中降低。心脏压力响应包括心肌细胞肥大、心脏的纤维化、心脏细胞中降低的α-MHC表达、和/或心脏细胞中升高的β-MHC表达等。与单独施用任一种抑制剂相比，对受试者施用miR-208a/miR-208b的抑制剂和miR-499的抑制剂两者导致对心脏压力响应的更快速影响。例如，在施用抑制剂后小于8周、小于6周、小于4周、小于3周、小于2周、小于1周、小于5天、小于3天、或小于1天发生心脏压力响应的降低。在另一个实施方案中，在施用抑制剂后小于12小时发生心脏压力响应的降低。

[0089] 在一些实施方案中，miR-208(例如miR-208a和/或miR-208b)和miR-499抑制剂可以是靶向成熟的miR-499和/或miR-208a或miR-208b序列的反义寡核苷酸。所述反义寡核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。优选的是，所述反义寡核苷酸具有至少一处化学修饰。例如，合适的反义寡核苷酸可以由一个或多个“构象约束性”或二环糖核苷修饰，例如“锁定核酸”构成。“锁定核酸”(LNA)指经修饰的核糖核苷酸，它在核糖糖模块的2’和4’碳之间含有额外桥接，导致赋予含有LNA的寡核苷酸以增强的热稳定性的“锁定”构型。靶向miR-208a/miR-208b和miR-499的反义寡核苷酸可以含有LNA或其它经修饰的核苷酸与核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的组合。或者，所述反义寡核苷酸可包含肽核酸(PNA)，其含有基于肽的主链，而非糖-磷酸酯主链。反义寡核苷酸可含有的其它化学修饰包括但不限于糖修饰，诸如2’-O-烃基或2’-O-烷基(例如2’-O-甲基、2’-O-甲氧乙基)、2’-氟、和4’-硫修饰，及主链修饰，诸如一个或多个硫代磷酸酯、吗啉代、或膦酰基羧酸酯(phosphonocarboxylate)连接(参见例如美国专利No.6,693,187和7,067,641，通过提述而完整并入本文)。例如，反义寡核苷酸，特别是那些具有较短长度(例如小于15个核苷酸)的反义寡核苷酸可以包含一处或多处亲和力增强性修饰，诸如但不限于LNA、二环核苷、磷酰基甲酸酯、2’O烃基或2’O烷基等。在一些实施方案中，合适的反义寡核苷酸是2’-O-甲氧乙基“缺口聚物”(gapmer)，其在5’和3’端都含有2’-O-甲氧乙基修饰的核糖核苷酸，且中央有至少十个脱氧核糖核苷酸。这些“缺口聚物”能够触发RNA酶H依赖性的对RNA靶物的降解机制。增强稳定性和提高功效的对反义寡核苷酸的其它修饰(诸如美国专利No.6,838,283中记载的那些，通过提述而完整并入本文)是本领域已知的，而且适合于在本发明的方法中使用。可用于抑制miRNA活性的优选的反义寡核苷酸长约5至约50个核苷酸，长约10至约30个核苷酸、或长约20至约25个核苷酸。在某些实施方案中，靶向miR-208a/miR-208b和miR-499的反义寡核苷酸长约8至约18个核苷酸，且在其它实施方案中，长约12至16个核苷酸。特别地，可以使用与miR208a或miR208b互补的任何8聚体或更长，即从miR的5’端开始到成熟序列的3’端的与miR208a或miR208b中的任何保守序列互补的任何antimir序列。反义寡核苷酸在一些情况中可以包含至少部分与成熟miRNA序列互补的序列，例如与成熟miRNA序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、或99％互补。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸可以与成熟miRNA序列基本上互补，也就是与靶多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、或99％互补。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与成熟miRNA序列100％互补的序列。

[0090] 在其它实施方案中，反义寡核苷酸是antagomir。“Antagomir”指单链的、经化学修饰的、至少部分与miRNA序列互补的核糖核苷酸。Antagomir可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，诸如2’-O-甲基-糖修饰。在一些实施方案中，antagomir仅包含经修饰的核苷酸。antagomir也可包含一个或多个硫代磷酸酯连接，导致部分或完全是硫代磷酸酯的主链。为了促进体内递送和稳定性，可将antagomir在其3’端连接至类固醇诸如胆固醇、脂肪酸、维生素、碳水化合物、肽或其它小分子配体。适合于抑制miRNA的antagomir可以长约15个至约50个核苷酸，更优选长约18个至约30个核苷酸，且最优选长约20个至约25个核苷酸。“部分互补”指某序列与靶多核苷酸序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、或99％互补。antagomir可以与成熟miRNA序列至少约75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、或99％互补。在一些实施方案中，antagomir可以与成熟miRNA序列基本上互补，也就是与靶多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、或99％互补。在其它实施方案中，antagomir与成熟miRNA序列100％互补。

[0091] 在一些实施方案中，miR-499和miR-208a/miR-208b的抑制剂是包含与成熟miR-499和成熟miR-208a或成熟miR-208b序列完美互补的序列的antagomir。在一个实施方案中，miR-499的抑制剂是具有与5’-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3’(SEQ ID NO：14)部分或完美互补的序列的antagomir。在另一个实施方案中，miR-208a的抑制剂是具有与5’-AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU-3’(SEQ ID NO：5)部分或完美互补的序列的antagomir。在另一个实施方案中，miR-208a的抑制剂是具有序列5’-ACAAGCUUUUUGCUCGUCUUAU-3’(SEQ ID NO：15)的antagomir。在又一个实施方案中，miR-208a的抑制剂是具有序列SEQ ID NO：16的antagomir。在另一个实施方案中，miR-208b的抑制剂是具有与5’-AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU-3’(SEQ ID NO：19)部分或完美互补的序列的antagomir。

[0092] 在一些实施方案中，miR-499和miR-208a或miR-208b的抑制剂是经化学修饰的反义寡核苷酸。在一个实施方案中，miR-499的抑制剂是经化学修饰的反义寡核苷酸，其包含与5’-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3’(SEQ ID NO：14)基本上互补的序列。在另一个实施方案中，miR-208a的抑制剂是经化学修饰的反义寡核苷酸，其包含与5’-AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU-3’(SEQID NO：5)基本上互补的序列。在又一个实施方案中，miR-208b的抑制剂是经化学修饰的反义寡核苷酸，其包含与5’-AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU-3’(SEQ ID NO：19)基本上互补的序列。如本文中所使用的，“基本上互补”指某序列与靶多核苷酸序列(例如成熟或前体miRNA序列)至少约95％、96％、97％、98％、99％、或100％互补。

[0093] 反义寡核苷酸可包含与miR-499或miR-208a/miR-208b的前体miRNA序列(pre-miRNA)基本上互补的序列。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与位于pre-miR-499或pre-miR-208a/miR-208b序列茎环区以外的序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，miR-499功能的抑制剂是反义寡核苷酸，其具有与选自下组的pre-miR-499序列基本上互补的序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。在另一个实施方案中，miR-208a功能的抑制剂是反义寡核苷酸，其具有与选自下组的pre-miR-208a序列基本上互补的序列：SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、和SEQ ID NO：4。在又一个实施方案中，miR-208b功能的抑制剂是反义寡核苷酸，其具有与SEQ ID NO：18的pre-miR-208b序列基本上互补的序列。

[0094] 在本发明的另一个实施方案中，可以使用单一核酸分子来同时抑制miR-208和miR-499两者。例如，单一核酸可以含有与成熟miR-208a序列(例如SEQ ID NO：5)至少部分互补的序列和与成熟miR-499序列(例如SEQ ID NO：14)至少部分互补的序列。在另一个实施方案中，单一核酸可以含有与成熟miR-208b序列(例如SEQ ID NO：19)至少部分互补的序列和与成熟miR-499序列(例如SEQ ID NO：14)至少部分互补的序列。在又一个实施方案中，单一核酸分子可以含有与pre-miR-208a序列(例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、和SEQ ID NO：4)至少部分互补的序列和与pre-miR-499序列(例如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12)至少部分互补的序列。在另一个实施方案中，单一核酸分子可以含有与pre-miR-208b序列(例如SEQ ID NO：18)至少部分互补的序列和与pre-miR-499序列(例如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12)至少部分互补的序列。单一核酸分子可以进一步在miR-208(例如miR-208a或miR-208b)与miR-499靶向序列之间包含一个或多个的间隔核苷酸。例如，单一核酸分子可在miR-208a/miR-208b与miR-499靶向序列之间含有约1至约200个间隔核苷酸，更优选地约5至约100个间隔核苷酸，最优选地约10至约50个间隔核苷酸。

[0095] 可以通过向细胞递送编码miR-208a/miR-208b和miR-499抑制剂的表达载体来将本文中所描述的任何miR-208a/miR-208b和miR-499的抑制剂递送到靶细胞(例如心脏细胞、骨骼肌细胞)。miR-208a/miR-208b的抑制剂和miR-499的抑制剂可以由同一表达载体编码。或者，miR-208(例如miR-208a或miR-208b)的抑制剂和miR-499的抑制剂在不同表达载体上编码。“载体”指可用于将感兴趣核酸递送至细胞内部的物质组成。本领域已知众多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲性化合物结合的多核苷酸、质粒、和病毒。如此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、等等。表达构建体能在活细胞中复制，或者它能合成制备。为了本申请，术语“表达构建体”、“表达载体”、和“载体”可互换使用，从而以一般性的、例示性的意义说明本发明的应用，而且并非意图限制本发明。

[0096] 在一个实施方案中，用于表达miR-208a/miR-208b和/或miR-499抑制剂的表达载体包含与编码反义寡核苷酸的多核苷酸可操作连接的启动子，其中所表达的反义寡核苷酸的序列与miR-208(例如miR-208a或miR-208b)和/或miR-499的成熟序列部分或完美互补。如本文中所使用的，短语“可操作连接”或“在转录控制下”意味着启动子相对于多核苷酸处于正确的定位和取向以控制RNA聚合酶进行的转录和多核苷酸表达的启动。在另一个实施方案中，如本文中所描述的，表达载体可以编码靶向miR-208(例如miR-208a或miR-208b)和miR-499两者的单一核酸，其中单一核酸与启动子可操作连接。在另一个实施方案中，单一表达载体可以编码miR-208a/miR-208b抑制剂和miR-499抑制剂，其中miR-208a/miR-208b抑制剂由与miR-499抑制剂不同的启动子驱动。

[0097] 如本文中所使用的，“启动子”指受到细胞的合成机构、或导入的合成机构识别，启动基因的特异性转录所需的DNA序列。合适的启动子包括但不限于RNApol I、pol II、pol III、和病毒启动子(例如人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳氏肉瘤病毒长末端重复)。在一个实施方案中，启动子是组织特异性启动子。特别感兴趣的是肌肉特异性启动子，更特别的是心脏特异性启动子。这些包括肌球蛋白轻链-2启动子(Franz等(1994)Cardioscience，第5卷(4)：235-43；Kelly等(1995)J.Cell Biol.，第129卷(2)：383-396)、α肌动蛋白启动子(Moss等(1996)Biol.Chem.，第271卷(49)：31688-31694)、肌钙蛋白1启动子(Bhavsar等(1996)Genomics，第35卷(1)：11-23)、Na+/Ca2+交换器启动子(Barnes等(1997)J.Biol.Chem.，第272卷(17)：11510-11517)、抗肌萎缩蛋白启动子(Kimura等(1997)Dev.Growth Differ.，第39卷(3)：257-265)、α7整联蛋白启动子(Ziober和Kramer(1996)J.Bio.Chem.，第271卷(37)：22915-22)、脑钠尿肽启动子(LaPointe等(1996)Hypertension，第27卷(3 Pt 2)：715-22)和αB-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子(Gopal-Srivastava(1995)J.Mol.Cell.Biol.，第15卷(12)：7081-7090)、α肌球蛋白重链启动子(Yamauchi-Takihara等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第86卷(10)：3504-3508)和ANF启动子(LaPointe等(1988)J.Biol.Chem.，第263卷(19)：
9075-9078)。

[0098] 在某些实施方案中，与编码miR-499和/或miR-208a/miR-208b抑制剂的多核苷酸可操作连接的启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子是本领域中已知的，并且包括但不限于四环素启动子、金属硫蛋白IIA启动子、热休克启动子、类固醇/甲状腺激素/视黄酸响应元件、腺病毒后期启动子、和诱导型小鼠乳房肿瘤病毒LTR。如本文中所描述的，表达载体可以编码靶向miR-208(例如miR-208a或miR-208b)和miR-499两者的单一核酸，其中单一核酸与诱导型启动子可操作连接。或者，单一表达载体可以编码miR-208a/miR-208b抑制剂和miR-499抑制剂，其中miR-208a/miR-208b抑制剂由第一诱导型启动子驱动，而miR-499抑制剂由第二诱导型启动子驱动。在另一个实施方案中，第一表达载体可以编码miR-208a/miR-208b抑制剂，其中miR-208a/miR-208b抑制剂与第一诱导型启动子可操作连接，而第二表达载体可以编码miR-499抑制剂，其中miR-499抑制剂与第二诱导型启动子可操作连接。也涵盖用于控制miR-208(例如miR-208a或miR-208b)和miR-499抑制剂表达的诱导型和组成性启动子的其它组合。例如，可以使用组成性启动子从载体表达miR-208a/miR-208b抑制剂，而可以使用诱导型启动子从载体表达miR-499抑制剂。

[0099] 本发明还包括用于在治疗后清除或消除miR-499和miR-208a/miR-208b抑制剂的方法。该方法可包括在心脏组织中过表达miR-499和miR-208a/miR-208b抑制剂的结合位点。在另一个实施方案中，本发明提供了用于在治疗后清除或消除miR-499和miR-208(例如miR-208a或miR-208b)的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在骨骼肌中使用骨骼和心脏肌肉特异性启动子(肌肉肌酸激酶(MCK))过表达miR-499和miR-208a/miR-208b的结合位点区。所述结合位点区优选含有miR-499和miR-208a或miR-208b的种子区的序列。种子区是miRNA中跨越碱基2-8的5’部分，其对于靶物识别是重要的。在一些实施方案中，所述结合位点可含有来自miR-499或miR-208的一种或多种靶物(诸如THRAP1或PURβ)的3’UTR的序列。在另一个实施方案中，可以在miR-499和miR-208之后施用miR-499和miR-208抑制剂以削弱或终止miRNA的功能。

[0100] 在本发明的另一个实施方案中，共施用miR-208(例如miR-208a或miR-208b)的抑制剂和miR-499的抑制剂。可以在单一配制剂中施用miR-208抑制剂和miR-208。例如，可以使用包含miR-208抑制剂和miR-499抑制剂的药物组合物以共施用两种抑制剂。或者，如本文中所描述的，miR-208和miR-499抑制剂可以由单一核酸，如表达载体编码。可以在持续的一段时间，例如1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、1年、2年、3年、4年、或5年里给予两种抑制剂的多次共施用。

[0101] 在一些实施方案中，顺序施用miR-208(例如miR-208a或miR-208b)的抑制剂和miR-499的抑制剂。在一个实施方案中，在miR-499的抑制剂前施用miR-208的抑制剂。在另一个实施方案中，在miR-208的抑制剂前施用miR-499的抑制剂。分开miR-208和miR-499抑制剂施用的时间间隔范围可以为几分钟至几天。例如，时间间隔可以是约1小时至约72小时、6小时至约48小时、或约12小时至约24小时。在一个优选的实施方案中，miR-208抑制剂与miR-499抑制剂的施用之间的时间间隔是至少24小时。本发明人已经观察到在miR-208抑制剂前至少约24小时施用miR-499抑制剂导致在施用miR-208抑制剂后约3天时压力诱导的β-MHC表达降低至少约50％。在没有miR-499抑制剂的情况中，对压力诱导的β-MHC表达的相当的效果直到施用miR-208抑制剂后至少约2个月才观察到。

[0102] 在本发明的其它实施方案中，可以采用miR-208和miR-499抑制剂的超过一次顺序施用以产生持续的效果。在这点上，可以使用各种组合。举例而言，在miR-499的抑制剂是“A”，而miR-208(例如miR-208a或miR-208b)的抑制剂是“B”的情况中，基于总共3和4次施用的下列排列是例示性的：

[0103] A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B

[0104] A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A[0105] A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B[0106] 同样涵盖其它组合。

[0107] 优选地，miR-208(例如miR-208a或miR-208b)和miR-499的表达或活性在对受试者施用miR-208抑制剂和miR-499抑制剂后的受试者的心脏细胞中降低。在某些实施方案中，miR-208a/miR-208b和/或miR-499的表达或活性在施用miR-208和miR-499抑制剂后降低大于50％、大于60％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、或大于95％。在一个实施方案中，miR-208a/miR-208b和miR-499的表达或活性在施用抑制剂后的受试者的心脏细胞中降低大于60％。在另一个实施方案中，miR-208a/miR-208b和miR-499的表达或活性在施用抑制剂后的受试者的心脏细胞中降低大于80％。在又一个实施方案中，miR-208a/miR-208b和miR-499的表达或活性在施用抑制剂后的受试者的心脏细胞中降低大于90％。

[0108] 本发明还包括调节心脏和/或骨骼肌肉收缩性的方法。根据专门化的收缩和代谢特性，成人骨骼肌纤维可分成快速和慢速颤动亚型。这些特性反映了肌球蛋白重和轻链、原肌球蛋白、和肌钙蛋白，及肌红蛋白的快速和慢速收缩蛋白质同等型的特定子集的表达(Naya等(2000)J Biol Chem，第275卷(7)：4545-4548)。慢速颤动肌肉主要用于长期活动，诸如保持姿势和持久的运动活性。快速颤动纤维主要用于大力爆发活动。成人骨骼肌表型不是静态的，而是保留响应于承重(load bearing)和收缩使用样式的变异来进行调节的能力，导致形态、表型、和收缩特性的适应。

[0109] 在缺乏这两个miR-208a等位基因的小鼠的心脏中观察到数种快速骨骼肌收缩蛋白质基因的上调。miR-208a敲除小鼠的心脏中快速骨骼肌收缩蛋白质基因的这种上调指示miR-208在正常情况中发挥遏制快速骨骼肌基因程序的功能。在miR-208a突变体小鼠中观察到伴随的miR-499表达降低(参见实施例3)，提示miR-499可能还负面地调节快速骨骼肌收缩蛋白质基因的表达。如上文所讨论的，miR-208b也主要在慢速骨骼肌(例如比目鱼肌)中表达。如此，miR-208b对人的心脏和骨骼肌肉收缩性可以具有深刻的影响，而且还可以调节快速骨骼肌基因程序并确定纤维身份。本发明人最近已经显示了，miR-208b和miR-499通过激活慢速肌纤维基因程序并遏制快速肌纤维基因程序而在肌肉纤维身份的规格上起重要作用。这些miRNA的作用部分是通过收集慢速肌纤维基因的转录阻遏物，如Sox6、PURβ、Sp3和HP1β来介导的。使用骨骼肌特异性MCK-启动子miR-499转基因动物还揭示了向更慢速的肌纤维类型的转换。甚至更显著的是，在小鼠进行被迫踏车奔跑方案时，miR-499转基因动物比野生型同窝出生者奔跑得长超过50％，指示源自快速肌纤维向更慢速的纤维类型的重编程的耐力增强。参见van Rooij等(2009)Developmental Cell，第17卷：662-673)。

[0110] 在一个实施方案中，调节心脏和/或骨骼肌肉收缩性的方法包括对心脏和/或骨骼肌肉细胞施用miR-499和miR-208(例如miR-208a或miR-208b)表达或活性的调控剂。在另一个实施方案中，所述方法包括施用miR-499和miR-208b的调控剂。在另一个实施方案中，提供了一种调节心脏收缩蛋白质基因表达的方法，包括对心脏细胞施用miR-499和miR-208(例如miR-208a或miR-208b)表达或活性的调控剂。在另一个实施方案中，提供了一种调节骨骼肌收缩蛋白质基因表达的方法，包括对骨骼肌细胞施用miR-499和miR-208(例如miR-208a或miR-208b)表达或活性的调控剂。在另一个实施方案中，提供了一种调节骨骼肌收缩蛋白质基因表达的方法，包括对骨骼肌细胞施用miR-499和miR-208b表达或活性的调控剂。在又一个实施方案中，本发明提供了一种诱导骨骼肌细胞的纤维类型转换的方法，包括对骨骼肌细胞施用miR-499和miR-208表达或活性的调控剂。在另一个实施方案中，诱导骨骼肌细胞的纤维类型转换的方法包括对骨骼肌细胞施用miR-499和miR-208b表达或活性的调控剂。所述调控物可以是miR-499、miR-208、和/或miR-208b表达或活性的激动剂或抑制剂。在一些实施方案中，通过使细胞与miR-499和miR-208a(或miR-208b)抑制剂接触来在细胞中提高THRAP1、PURβ、肌肉抑制素、Sp3、HP1β、和Sox 6的表达。在其它实施方案中，通过使细胞与miR-499和miR-208a(或miR-208b)的激动剂接触来在细胞中降低THRAP1、PURβ、肌肉抑制素、Sp3、HP1β、和Sox 6的表达。

[0111] 在本发明的某些实施方案中，提供了降低心脏细胞中的β-MHC表达的方法，包括对心脏细胞施用miR-499和miR-208(例如miR-208a或miR-208b)表达或活性的抑制剂。在一个实施方案中，提供了降低骨骼肌细胞中的β-MHC表达的方法，包括对骨骼肌细胞施用miR-499和miR-208b表达或活性的抑制剂。在本发明的其它实施方案中，提供了提高心脏细胞和/或骨骼肌细胞中的β-MHC表达的方法，包括提高内源miR-499和miR-208a(或miR-208b)表达或活性或对心脏细胞和/或骨骼肌细胞施用外源miR-499和miR-208a(或miR-208b)。

[0112] 在本发明的一个实施方案中，提供了提高心脏细胞中的快速骨骼肌收缩蛋白质基因表达的方法，包括对心脏细胞施用miR-499和miR-208(例如miR-208a或miR-208b)表达或活性的抑制剂。在另一个实施方案中，提供了提高骨骼肌细胞中的快速骨骼肌收缩蛋白质基因表达的方法，包括对骨骼肌细胞施用miR-499和miR-208b表达或活性的抑制剂。在本发明的另一个实施方案中，提供了降低心脏细胞和/或骨骼肌细胞中的快速骨骼肌收缩蛋白质基因表达的方法，包括提高内源miR-499和miR-208a(或miR-208b)表达或活性或对心脏细胞和/或骨骼肌细胞施用外源miR-499和miR-208a(或miR-208b)。可依照本发明的方法升高或降低的快速骨骼肌收缩蛋白质基因的例子包括但不限于肌钙蛋白I2、肌钙蛋白T3、快速骨骼肌球蛋白轻链、或α骨骼肌动蛋白。

[0113] 在骨骼肌中，对慢速纤维基因的遏制和对快速纤维基因的激活与多种肌肉骨骼病症(包括但不限于失用性萎缩、响应反重力而发生的肌肉萎缩、和去神经)有关。如此，在骨骼肌细胞中miR-499与miR-208a或miR-208b组合的表达可以用于遏制快速纤维基因，由此激活慢速纤维基因的交互表达。因而，本发明还涵盖一种用于在有需要的受试者中治疗或预防肌肉骨骼病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用miR-208(例如miR-208a或miR-208b)的激动剂和miR-499的激动剂，其中miR-208a/miR-208b和miR-499的表达或活性在施用后的受试者的骨骼肌细胞中升高。在另一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用miR-208b的激动剂和miR-499的激动剂，其中miR-208b和miR-499的表达或活性在施用后的受试者的骨骼肌细胞中升高。优选地，受试者的骨骼肌细胞中的一种或多种快速骨骼肌基因的表达在施用miR-499和miR-208a(或miR-208b)激动剂后降低。一种或多种快速骨骼肌基因可以包括但不限于肌钙蛋白I2、肌钙蛋白T3、快速骨骼肌球蛋白轻链、或α骨骼肌动蛋白。

[0114] 在另一个实施方案中，本发明提供了通过对骨骼肌施用miR-499和miR-208(例如miR-208a或miR-208b)的激动剂来治疗或预防响应降低的重力环境而发生的肌肉萎缩的方法。在另一个实施方案中，治疗或预防响应降低的重力环境而发生的肌肉萎缩的方法包括对骨骼肌施用miR-499和miR-208b的激动剂。在又一个实施方案中，本发明提供了通过对骨骼肌施用miR-499的激动剂和miR-208(例如miR-208a或miR-208b)的激动剂来治疗或预防肌肉萎缩的方法。在另一个实施方案中，治疗或预防肌肉萎缩的方法包括对骨骼肌施用miR-499的激动剂和miR-208b的激动剂。

[0115] 在一些实施方案中，miR-208(miR208a或miR-208b)的激动剂和miR-499的激动剂是编码成熟miR-208(miR208a或miR-208b)和/或miR-499序列的多核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含成熟miR-208a序列(SEQ ID NO：5)和成熟miR-499序列(SEQ ID NO：14)。在另一个实施方案中，所述多核苷酸包含成熟miR-208b序列(SEQ ID NO：19)和成熟miR-499序列(SEQ ID NO：14)。在另一个实施方案中，miR-499的激动剂和miR-208(miR208a或miR-208b)的激动剂可以是包含miR-499和miR-208(miR208a或miR-208b)的pri-miRNA或pre-miRNA序列的多核苷酸。或者，miR-208(miR208a或miR-208b)的激动剂和miR-499的激动剂可以是不同多核苷酸，其各包含miRNA的成熟序列或pre-miRNA序列。包含成熟miR-499和/或miR-208(miR208a或miR-208b)序列的多核苷酸可以是单链或双链的。所述多核苷酸可含有一处或多处化学修饰，诸如锁定核酸、肽核酸、糖修饰(诸如2’-O-烃基或2’-O-烷基(例如2’-O-甲基、2’-O-甲氧乙基)、2’-氟、和4’-硫修饰)、和主链修饰(诸如一个或多个硫代硫酸酯、吗啉代、或膦酰基羧酸酯连接)。在一个实施方案中，所述包含miR-499、miR-208、和/或miR-208b序列的多核苷酸偶联于胆固醇。

[0116] 在另一个实施方案中，miR-499和miR-208(miR208a或miR-208b)的激动剂可以在表达载体上表达。用于表达miR-499和miR-208(miR208a或miR-208b)的表达载体包含与编码miR-499和/或miR-208(miR208a或miR-208b)的多核苷酸可操作连接的至少一个启动子。编码miR-499的多核苷酸可以编码初级-miRNA-499序列(pri-miR-499)、前体-miRNA-499序列(pre-miR-499)或成熟miR-499序列。编码miR-208a/miR-208b的多核苷酸可以编码初级-miRNA-208a/208b序列(pri-miR-208/pri-miR-208b)、前体-miRNA-208/208b序列(pre-miR-208a/pre-miR-208b)或成熟miR-208a/208b序列。在一些实施方案中，表达载体包含与启动子可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：14。在其它实施方案中，表达载体包含与启动子可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO：19和SEQ IDNO：14。此类多核苷酸可以长约18至约2000个核苷酸，长约70至约200个核苷酸，长约20至约50个核苷酸，或长约18至约25个核苷酸。在另一个实施方案中，表达载体可以从不同启动子表达miR-499激动剂(例如包含miR-499序列的多核苷酸)和miR-208激动剂(例如包含miR-208a或miR-208b序列的多核苷酸)。编码miR-499、miR-208a、和/或miR-208b的多核苷酸可以位于编码内含子的核酸中或编码mRNA的非翻译区的核酸中或者非编码RNA中。在一个实施方案中，所述表达构建物可含有来自Myh7b基因第20内含子的序列或来自Myh7(β-MHC)基因第31内含子的序列。

[0117] 可以对受试者共施用miR-208a或miR-208b的激动剂与miR-499的激动剂。可以在单一配制剂(例如包含miR-208a或miR-208b激动剂和miR-499激动剂的药物组合物)中施用两种激动剂。或者，两种激动剂(例如miR-208a和miR-499或miR-208b和miR-499)可以是编码两种miRNA的成熟或pre-miRNA序列的单一多核苷酸。可以在持续的一段时间，例如1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、1年、2年、3年、4年、或5年里给予两种激动剂的多次共施用。

[0118] 在某些实施方案中，顺序施用miR-208a或miR-208b的激动剂和miR-499的激动剂。在一个实施方案中，miR-208a或miR-208b的激动剂在miR-499的激动剂前施用。在另一个实施方案中，miR-499的激动剂在miR-208a或miR-208b的激动剂前施用。分开激动剂施用的时间间隔范围可以为几分钟至几周，例如约1小时至约72小时、6小时至约48小时、或约12小时至约24小时。在一个优选的实施方案中，miR-208a或miR-208b激动剂与miR-499激动剂的施用之间的时间间隔是至少24小时。

[0119] 本发明还包括包含miR-499、miR-208a、和/或miR-208b的抑制剂或激动剂的药物组合物。在涵盖临床应用的情况中，会以适合于意图应用的形式制备药物组合物。一般地，这会需要制备基本上没有热原，及其它对人或动物可有害的杂质的组合物。

[0120] 在一个实施方案中，药物组合物包含有效剂量的miR-499抑制剂和/或有效剂量的miR-208a或miR-208b抑制剂。在另一个实施方案中，药物组合物包含有效剂量的miR-499激动剂和/或有效剂量的miR-208a或miR-208b激动剂。“有效剂量”指足以实现有益的或期望的临床结果的量。本发明的miRNA抑制剂或miRNA激动剂的有效剂量可以是约1mg/kg至约200mg/kg、约20mg/kg至约160mg/kg、或约40mg/kg至约100mg/kg。在一个实施方案中，各以约20mg/kg至约200mg/kg的剂量施用miR-208或miR-208b的抑制剂和miR-499的抑制剂。在另一个实施方案中，各以约80mg/kg的剂量施用miR-208或miR-208b的抑制剂和miR-499的抑制剂。在另一个实施方案中，各以约20mg/kg至约200mg/kg的剂量施用miR-208或miR-208b的激动剂和miR-499的激动剂。在又一个实施方案中，各以约80mg/kg的剂量施用miR-208或miR-208b的激动剂和miR-499的激动剂。认为什么是有效剂量的精确确定可以基于每名患者的个体因素，包括其体型、年龄、病症的类型(例如心肌梗死、心力衰竭、心脏肥大、或肌肉骨骼的)、和抑制剂或激动剂(例如antagomir、表达构建体、反义寡核苷酸等)的性质。因此，本领域普通技术人员通过此公开内容和本领域的知识可以容易地确定剂量。

[0121] 可以使用胶状分散系统(诸如高分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠、和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束(micelle)、混合胶束、和脂质体)作为miRNA功能的寡核苷酸抑制剂、编码miRNA激动剂的多核苷酸、或表达特定miRNA抑制剂或激动剂的构建体的递送运载体。适于将本发明的核酸递送至心肌和骨骼肌组织的商业上可得到的脂肪乳剂包括 II、 III、Nutrilipid、和其它类似的脂质乳剂。一种作为体内递送运载体使用的优选的胶状系统是脂质体(即人工膜囊泡)。
此类系统的制备和使用是本领域公知的。例示性的配制剂还披露于US 5,981,505；US
6,217,900；US 6,383,512；US 5,783,565；US 7,202,227；US 6,379,965；US 6,127,170；
US5,837,533；US 6,747,014；和WO03/093449，通过提述完整并入本文。

[0122] 一般会希望采用适宜的盐和缓冲剂来使得递送运载体稳定且容许被靶细胞摄取。本发明的水性组合物包含有效量的递送运载体，其包含溶解或分散在药学可接受载体或水性介质中的抑制剂多核苷酸或miRNA多核苷酸序列(例如脂质体或其它复合物或表达载体)。短语“药学可接受的”或“药理学可接受的”指在对动物或人类施用时不产生不利的、变应性的、或其它不想要的反应的分子实体和组合物。如本文中所使用的，“药学可接受载体”包括可接受用于配制药物(诸如对于人类施用合适的药物)的溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。此类介质和试剂用于药学活性物质的使用是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与本发明的活性成分不相容，涵盖它在治疗性组合物中的用途。还可以将补充性活性成分掺入组合物中，只要它们不灭活所述组合物的载体或多核苷酸。

[0123] 本发明的活性组合物可包括经典的药学制备物。依照本发明的这些组合物的施用可以经由任何常用路径，只要靶组织经由该路径可及。这包括口服、鼻、或含服。或者，施用可以是经过皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射，或者通过直接注射入心脏组织。包含miRNA抑制剂的药物组合物、编码miRNA序列的多核苷酸或包含miRNA序列的表达构建体也可以通过导管系统或为将治疗剂递送至心脏而分离冠状循环的系统来施用。本领域知道用于将治疗剂递送至心脏和冠状脉管系统的多种导管系统。美国专利No.6,416,510；美国专利No.6,716,196；美国专利No.6,953,466；WO 2005/082440；WO 2006/089340；美国专利公开文本No.2007/0203445；美国专利公开文本No.2006/0148742；和美国专利公开文本No.2007/0060907(通过提述完整并入本文)中披露了适用于本发明的基于导管的递送方法或冠状动脉分离方法的一些非限制性例子。此类组合物通常会作为如本文中所述的药学可接受组合物来施用。

[0124] 活性化合物也可以胃肠外或腹膜内施用。举例而言，可以在与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备游离碱或药理学可接受盐形式的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中及在油中制备分散体。在普通贮存和使用条件下，这些制备物一般含有防腐剂以防止微生物生长。

[0125] 适于注射使用或导管递送的药物形式包括例如无菌水溶液或分散体及用于临场制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。一般而言，这些制备物是无菌的，而且存在易于注射的流动性程度。制备物在制造和贮存条件下应当是稳定的，而且应当针对微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用进行防腐。适宜的溶剂或分散介质可含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇、等等)、它们的合适混合物、及植物油。可以通过例如使用涂层(诸如卵磷脂)、通过维持所需粒度(在分散体的情况中)和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现对微生物作用的预防，例如对羟苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞、等等。在许多情况中，会优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂来实现可注射组合物的吸收的延长，例如单硬脂酸铝和明胶。

[0126] 可如下制备无菌注射液，即以适宜的量将活性化合物根据需要与任何其它成分(例如上文所列)一起并入溶剂中，接着过滤除菌。一般而言，如下制备分散体，即，将各种经灭菌的活性成分掺入含有基本分散介质和期望的其它成分(例如上文所列)的无菌运载体中。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况中，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，它们自先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何附加的所需成分的粉末。

[0127] 本发明的组合物一般可配制成中性或盐形式。药学可接受盐包括例如自无机酸(例如盐酸或磷酸)或自有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)衍生的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的)。也可以自无机碱(例如氢氧化钠、钾、铵、钙、或铁)或自有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)衍生与蛋白质的游离羧基形成的盐。

[0128] 配制后，优选以与剂型相容的方式和以治疗上有效的量施用溶液。所述配制剂可以容易地以多种剂量形式来施用，诸如注射液、药物释放胶囊等等。例如，为了以水溶液形式胃肠外施用，一般将溶液适当缓冲，并且首先例如用足够的盐或葡萄糖使得液体稀释剂等渗。此类水溶液可用于例如静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。优选的是，采用无菌水介质，正如本领域技术人员所知的，特别是根据本公开内容来进行。举例而言，可以将单剂溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并且或是添加至1000ml皮下输液或是在建议的输注部位注射(参见例如《Remington’s Pharmaceutical Sciences》第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。根据所治疗的受试者的状况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况中，负责施用的人会为各受试者确定适宜的剂量。此外，对于人类施用，制备物应当达到FDA生物制剂标准办公室要求的无菌度、热原度、一般安全和纯度标准。

[0129] 本文所述任何成分可以包含在试剂盒中。在一个实施方案中，试剂盒含有包含miR-208a或miR-208b抑制剂的第一药物组合物和包含miR-499抑制剂的第二药物组合物。在另一个实施方案中，试剂盒含有包含miR-208a或miR-208b抑制剂和miR-499抑制剂的单一药物组合物。在另一个实施方案中，试剂盒含有包含miR-208a或miR-208b激动剂的第一药物组合物和包含miR-499激动剂的第二药物组合物。在又一个实施方案中，试剂盒含有包含miR-208a或miR-208b激动剂和miR-499激动剂的单一药物组合物。在一些实施方案中，试剂盒还可包括一种或多种转染试剂以便于将miRNA激动剂或抑制剂递送至细胞。

[0130] 试剂盒的成分可以在水介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器装置一般会包括至少一个管形瓶(vial)、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器手段，其中装有(优选合适地分配的)成分。在试剂盒中有超过一种成分的情况中，试剂盒一般还会包含第二、第三或其它附加的容器，其中可以分开装纳别的成分(例如无菌的、药学可接受缓冲液和/或其它稀释剂)。然而，可以在管形瓶中装纳各种成分组合。通常，本发明的试剂盒一般还包括为了商业销售而牢固地安置核酸，和任何其它试剂容器的手段。此类容器可包括用于保留期望的管形瓶的注射或吹塑成形的塑料容器。

[0131] 当所述试剂盒的成分在一种和/或多种液体溶液中提供时，所述液体溶液是水溶液，特别优选无菌的水溶液。

[0132] 然而，试剂盒的成分可以以干粉形式提供。当试剂和/或成分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来将所述粉剂重构。可预见的是所述溶剂也可以在另一容器手段中提供。

[0133] 此类试剂盒还可包括保存或维持miRNA激动剂或miRNA抑制剂或者保护它们免于降解的成分。此类成分可以不含DNA酶、不含RNA酶或针对核酸酶(RNA酶和DNA酶)提供保护。此类试剂盒一般会以合适的手段为每种单独的试剂或溶液包含独特的容器。

[0134] 试剂盒还会包括关于采用试剂盒成分以及使用试剂盒中没有包括的任何其它试剂的指示。指示可包括能执行的变化形式。试剂盒还可包括通过多种施用路径(诸如胃肠外或导管施用)施用miRNA激动剂或抑制剂的器具或装置。

[0135] 涵盖的是此类试剂是本发明试剂盒的实施方案。然而，此类试剂盒不限于上文鉴定的具体项，而且可包括任何用于miRNA操作或表征的试剂。

[0136] 仅为了说明本发明的各个方面而包括下列实施例。在实施例和图中提及miR208指小鼠中的miR208a。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当领会，本发明同样适用于任何人或其它动物，而且涵盖调控miR208a和/或miR208b。实施例

[0137] 实施例1：MiR-208敲除小鼠展现出响应压力超载而发生的心脏肥大和纤维化降低

[0138] miR-208在α-MHC基因的内含子内编码。与α-MHC一样，miR-208在心脏中特异性表达，在肺中有痕量表达。miR-208是自α-MHC pre-mRNA加工出的，而不是作为分开的转录物转录得到的。然而，有趣的是，miR-208展现出长得引人注目的、至少14天的半衰期，而且由此甚至能在α-MHC mRNA表达已经下调时发挥功能。

[0139] 通过生成miR-208靶向载体来创建MiR-208敲除小鼠，所述miR-208靶向载体通过将在miR-208编码区上游延伸的0.4kb片段(5’臂)用SacII和NotI消化，并将片段连接入pGKneoF2L2dta靶向质粒，在loxP位点和侧翼为Fit的新霉素盒的上游来得到。将3.3kb片段(3’臂)用SalI和HindIII消化并连接入载体，在新霉素抗性与Dta负选择盒之间。用5’和3’探针通过Southern印迹分析来鉴定携带被破坏的等位基因的靶定ES细胞。鉴定出三个miR-208靶定ES克隆并用于胚泡注射。将所得嵌合小鼠与C57BL/6交配以获得突变等位基因的种系传递。

[0140] 虽然小鼠中的miR-208遗传删除未能诱发明显表型，但是对来自2月龄野生型和miR-208-/-动物的心脏进行的微阵列分析揭示了miR-208消除导致众多快速骨骼肌收缩蛋白质基因的显著表达，它们在正常情况中在心脏中不表达。如此，这些结果提示在正常条件下，miR-208与唯一的心脏特异性MHC基因共表达，通过遏制骨骼肌基因在心脏中的表达来维持心肌细胞身份。

[0141] miR-208无效(null)小鼠对心脏压力的异常响应揭示了miR-208的最显著功能(van Rooij等，(2007)Science，Vol.316：575-579)。响应于通过胸主动脉缩窄(TAB)(其驱动心脏的病理性重塑)的压力超载，与来自野生型小鼠的切片相比，来自miR-208敲除小鼠的心脏的组织学切片实际上显示无心肌细胞肥大或纤维化(图1A)。另外，miR-208敲除动物不能响应压力超载而上调β-MHC表达(图1B和C)。相反，其它压力响应性基因(诸如那些编码ANF和BNP的)在miR-208突变动物中被强烈诱导(图1B)，证明了miR-208明确专门致力于控制β-MHC表达，它能与心脏压力应答的其它方面脱离(uncouple)。

[0142] 实施例2：敲低miR-208表型模拟响应压力的miR-208敲除动物

[0143] 为了检查miR-208的缺乏对心脏压力响应的影响的特异性，每天给动物静脉内注射antagomir，其具有与成熟miR-208序列互补的序列(反208；SEQ IDNO：16)或错配序列(mm；SEQ ID NO：17)。所有核苷是经2’-OMe修饰的，而且5’端的两个和3’端的四个碱基含有核苷间硫代磷酸酯。经由羟基脯氨醇接头将胆固醇附接于信使链的3’端(图2A)。治疗后2个月对注射miR-208antagomir的动物的心脏的实时PCR分析显示miR-208的有效敲低(图2B)。

[0144] 为了测试体内miR-208下调对心脏压力响应的影响，接受反-miR-208antagomir或错配对照的动物进行假规程或胸主动脉缩窄规程以诱导压力超载。用错配对照处理的动物展现出典型的压力响应，其中上调β-MHC及其它压力基因(ANF和BNP)。相反，用反-miR-208 antagomir处理的动物未能显示响应压力刺激的β-MHC上调。然而，观察到其它压力基因(ANF和BNP)的表达升高(图2C)。用反-miR-208 antagomir处理的动物的压力响应与miR-208敲除动物的压力响应显著相似，提示miR-208在调节响应压力的β-MHC表达调节中起关键的作用。

[0145] 实施例3：MiR-208是miR-499表达所需要的

[0146] 为了进一步探索miR-208在心脏中的作用机制，发明人通过微阵列分析来限定来自野生型和miR-208敲除小鼠的心脏的miRNA表达样式。在miR-208敲除心脏中上调和下调的数种miRNA中，发明人发现miR-499在正常心脏中高度丰富，但是在miR-208敲除动物中不超过背景水平表达。这些发现得到了Northern印迹的证实(图3)。对miR-499基因的基因组定位的分析显示了它包含在Myh7b基因(α-MHC基因的一种同源物)的第20内含子内。miR-208表现出在转录水平调节Myh7b和由此miR-499表达，因为针对Myh7b的RT-PCR指示宿主基因的mRNA在不存在miR-208的情况中被剂量依赖性地消除(图3)。

[0147] Myh7b基因在脊椎动物中是保守的，而且仅仅在心脏和慢速骨骼肌(例如比目鱼肌)中表达(图4A)。相似地，miR-499与其宿主基因具有相同的表达样式，如通过实时PCR分析所确认的(图4A和B)。使用针对Myh7b基因3’端的探针进行的原位杂交指示此肌球蛋白(和miR-499)在心脏中与E 10.5一样早地表达(图4C)。后来在胚胎发生期间，Myh7b/miR-499也在体节中表达。这些数据指示miR-208是驱动另一种肌球蛋白(即Myh7b，它产生相关的miR-499)所需要的。另外，miR-499在心脏肥大期间下调。

[0148] 为了进一步探索miR-499在病理学心脏肥大和肌肉收缩性调节中的作用，产生miR-499敲除动物。miR-499的遗传删除对其宿主基因Myh7b的表达没有影响(图5A)。对来自miR-499突变体和野生型动物的心脏的α-和β-MHC两者的Western印迹分析显示miR-499的删除不影响任一种基因在蛋白质水平的表达(图5B)。为了检查miR-499是否对β-MHC调节具有影响，野生型和miR-499敲除动物接受丙基硫尿嘧啶(PTU)，其诱导甲状腺功能减退症并上调β-MHC。野生型和miR-499敲除动物两者都展现出响应PTU的α-MHC降低和β-MHC升高(图5C)。令人惊讶的是，与miR-208不同，miR-499不是调节α-或β-MHC的表达所需要的。

[0149] 实施例4：miR-208和miR-499的双重靶定

[0150] MiR-208调节miR-499的表达，如通过miR-208杂合子和miR-208敲除动物中的miR-499表达的剂量依赖性降低所显示的(图3和实施例3)。为了进一步阐明miR-208与miR-499之间的相互作用，给野生型动物静脉内注射盐水或四剂量之一(20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg和160mg/kg)的合成寡核苷酸(例如antagomir)，其具有与成熟miR-208序列互补的序列(反-miR-208；SEQ ID NO：16)。尾静脉注射后3天对心脏组织的Northern分析揭示成熟miR-208表达的剂量依赖性降低，而使pre-miR-208表达保持原样(图6A)。然而，与在遗传删除模型中不同，miR-499的表达保持不变。另外，β-MHC的表达水平在注射反-miR-208antagomir后3天也不受影响(数据未显示)。

[0151] 在第二个实验系列中，给野生型动物静脉内注射单剂反-miR-208(80mg/kg)、在连续两天注射连续两剂(80mg/kg)反-miR-208、或在连续两天注射连续两剂(80mg/kg)错配对照寡核苷酸(SEQ ID NO：17)。处理后2个月对心脏组织的Northern分析显示miR-208和miR-499表达在用反-miR-208处理的动物中均降低(图6B)。实时PCR分析确认这些结果(图6C)。另外，还观察到miR-208b(其在β-MHC的内含子内编码，并与β-MHC共表达)的表达降低。对相应的宿主肌球蛋白基因的实时PCR分析揭示miR-208的敲低不影响α-MHC的表达，但是诱导β-MHC和Myh7b的表达降低(图6C)。在用反-miR-208治疗后2个月还观察到β-MHC蛋白的降低(图6D)。这些结果指示延迟后发生miR-208对miR-499和β-MHC表达的调节，提示miR-208在miR-499的上游，其又在β-MHC的上游。如此，miR-208和miR-499两者都需要下调以获得β-MHC表达的加速降低。单独的MiR-208下调导致最终的miR-499表达降低，这继而诱导β-MHC表达的降低。为了获得对β-MHC表达的更即刻的影响，可以靶定miR-499和miR-208两者来进行下调。

[0152] 为了检查下调miR-208和miR-499两者的组合效果，对miR-499敲除动物施用反-miR-208寡核苷酸，之后接受丙基硫尿嘧啶(PTU)，即β-MHC表达的一种诱导物。与先前的结果相似，PTU在没有用反-miR-208寡核苷酸处理的野生型和miR-499敲除动物两者中都诱导α-MHC表达降低和β-MHC/miR-208b表达(miR-208b与β-MHC共表达)升高(图7A，B)。此类效应是心脏压力响应特征性的。相反，处理后2周来自用反-miR-208寡核苷酸处理的miR-499敲除动物的心脏组织的Northern和实时PCR分析显示，没有观察到响应PTU的β-MHC/miR-208b表达升高(图7A，B)。用反-miR-208处理的miR-499敲除动物的响应与miR-208敲除动物的响应相似(图7B)。这些结果提示可以通过靶定miR-208和miR-499两者来实现β-MHC的有效且快速下调。对动物施用的反-miR-208寡核苷酸的剂量产生降低60％的miR-208表达。此百分比降低足以在没有miR-499的情况中遏制PTU对β-MHC的诱导(图7B)。这些发现指示miR-499和miR-208两者的降低可为用于治疗心脏病症诸如病理学心脏肥大和心力衰竭的有效治疗策略。

[0153] 实施例5：敲低miR-208和miR-499抑制心脏压力响应

[0154] 为了进一步评估靶定miR-208和miR-499对于治疗心脏病症的治疗价值，给小鼠静脉内注射具有与成熟miR-208a序列互补的序列的反义寡核苷酸(反-208)、具有与成熟miR-499序列互补的序列的反义寡核苷酸(反-499)、或反-208和反-499寡核苷酸序列两者。反-208和反-499两者都含有由核苷间硫代磷酸酯键连接的锁定核酸(LNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的组合。使用处理后3周直至2个月的注射反义寡核苷酸的动物心脏的实时PCR分析来评估对miR-208和miR-499的敲低。

[0155] 为了测试体内miR-208和miR-499下调对心脏压力响应的影响，接受反-208、反-499、或反-208和反-499寡聚物两者的动物进行假规程或胸主动脉缩窄规程以诱导压力超载。未处理的动物展现出典型的压力响应，其中上调β-MHC及其它压力基因(ANF和BNP)。相反，用反-208和反-499两者处理的动物展现出响应压力刺激的β-MHC上调的降低，其比仅接受任一种反义寡聚物的动物更显著。

[0156] 通过提述将本文中所讨论和引用的所有出版物、专利和专利申请完整并入本文。应当理解，所公开的发明不限于所描述的具体的方法、方案和材料，因为这些可以有所变化。还应当理解，本文中所使用的术语是仅为了描述具体的实施方案，而并不意图限制本发明的范围，它们仅会由所附权利要求书来限制。

[0157] 本领域技术人员会认可，或者仅使用常规实验便能够确定本文中所描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。此类等同方案意欲被所附权利要求书所涵盖。