一种胰蛋白酶抑制剂活性片段衍生物及其制备方法和应用

摘要

一种胰蛋白酶抑制剂活性片段衍生物Argc，其结构与野生片段相比二硫键由3对变为2对，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。Argc通过如下方法获得：化学合成MBTI-Argc片段的基因序列，将pGEX-4T-1-Argc表达载体转化到大肠杆菌DH5α，构建大肠杆菌工程菌pGEX-4T-1-Argc/DH5α，将工程菌接种在含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至A600nm为0.4-0.6，加入IPTG使终浓度为0.5mmol/L，诱导表达3-5小时，收集菌体，将上清液经亲和层析纯化获得目的蛋白。Argc可在细胞损伤修复和创伤愈合中应用。

权利要求

1.一种胰蛋白酶抑制剂活性片段衍生物Argc，其结构与野生片段相比二硫键由3对变为2对，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其对细胞迁移和增殖有促进作用。

2.编码权利要求1所述Argc的基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO：2。

3.一种载体，含有权利要求2所述的核苷酸序列。

4.一种Argc工程菌，含有权利要求3所述的载体。

说明书

一种胰蛋白酶抑制剂活性片段衍生物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种来源于绿豆胰蛋白酶抑制剂精氨酸片段衍生蛋白的工程菌构建表达及在细胞损伤修复中的应用。

背景技术

[0002] 胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor，TI)是指具有胰蛋白酶抑制活性的多肽或蛋白质，是一种重要的生化药物和生化试剂。绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)属于Bowman-Birk类型抑制剂，含有赖氨酸和精氨酸两个活性中心，分别位于Lys-Ser(20-21)和Arg-Ser(47-48)。目前，对MBTI的研究多聚焦在MBTI全长片段或Lys活性片段，而对Arg活性片段研究较少。

[0003] Arg活性片段含有七个巯基，它们包含的三对二硫键对于蛋白质的活性，结构稳定性都具有很重要的作用。本专利应用化学合成方法获得Arg片段的编码基因序列，所获得的重组蛋白衍生物与天然的绿豆胰蛋白酶抑制剂精氨酸片段相比有明显不同：其结构发生变化，二硫键数目有所减少，游离的巯基数增加。且该重组蛋白对细胞具有特定的生物学活性：该片段基本不具有胰蛋白酶抑制剂的活力，对细胞迁移和增殖有促进作用。

[0004] 创伤愈合是指机体遭受外力作用，组织出现离断或缺损后的愈复过程，包括各种组织的再生、细胞增殖、迁移、肉芽组织增生、胶原分泌、组织重建的过程。细胞迁移是创伤修复的第一阶段。近年来，由于氧自由基在缺血性组织损伤的发病中具有重要作用，其介导的细胞损伤得到广泛关注。高浓度的氧自由基会抑制，毒杀细胞。蛋白质中含有的巯基具有抗氧化作用，可有效地消除自由基，从而抑制细胞凋亡。它可以与活性氧自由基结合，降低其毒性作用，对氧自由基引起的细胞损伤起防御作用。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种胰蛋白酶抑制剂活性片段衍生物及其制备方法和应用。

[0006] 本发明胰蛋白酶抑制剂活性片段衍生物(Argc)的基因序列来源于绿豆胰蛋白酶抑制剂的一个活性区域，含有27个氨基酸残基，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1；其结构与野生片段相比发生了变化，是野生片段二硫键由3对变为2对后衍生的蛋白，其不具有胰蛋白酶抑制剂的活力，而对细胞迁移和增殖有促进作用。

[0007] 本发明Argc的核苷酸序列由81个核苷酸组成，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

[0008] 一种含有编码Argc的核苷酸序列的载体，它是将编码Argc的核苷酸片段克隆至原核表达载体后获得的重组子pGEX-4T-1-Argc。所述的载体，是质粒，含有M13启动子。

[0009] 一种Argc工程菌，它含有如前所述的载体。是将所述的pGEX-4T-1-Argc重组子转化至一种菌中，例如大肠杆菌DH5α中，构建成工程菌。

[0010] 本发明的Argc通过以下方法获得：化学合成MBTI-Argc片段的基因序列，将该序列连接到pGEX-4T-1载体上，获得重组子pGEX-4T-1-Argc，将该重组子转化到大肠杆菌DH5α，构建大肠杆菌工程菌pGEX-4T-1-Argc/DH5α，将该工程菌接种在含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至A 600nm为0.4-0.6，加入IPTG使终浓度为0.5mmol/L，诱导表达3-5小时，收集菌体，将上清液经亲和层析纯化获得目的蛋白。

[0011] 采用MTT法和细胞划痕实验对Argc的生物学活性研究，实验证明：Argc作用于细胞，能有效的促进多种细胞的生长和迁移效应。划痕实验表明Argc对细胞机械损伤后的修复有一定促进作用，而二硫键测定结果说明它同时具有抗氧化功能。因此，该衍生物可应用于细胞损伤修复和创伤愈合。

附图说明

[0012] 图1：GST-Argc重组质粒的鉴定(其中泳道一是重组质粒经BamH I和Xho I双酶切)

[0013] 图2：GST-Argc Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲和层析(其中泳道一为纯化的GST-Argc，泳道二为GST蛋白对照以noitomorp)

[0014] 图3：GST-Argc的胰蛋白酶抑制剂相对活力

[0015] 图4：GST-Argc对细胞增殖的影响

[0016] 图5：GST-Argc对细胞迁移的影响

具体实施方式

[0017] 实施例1：Argc片段编码基因的合成及重组表达质粒pGEX-4T-1-Arg的构建[0018] 根据文献报道的MBTI-Arg片段氨基酸序列，委托大连宝生物公司合成Argc片段的编码基因(两端插入BamH I和Xho I酶切位点)，BamH I和Xho I双酶切、胶回收目的基因片段，与同样BamH I和Xho I双酶切的pGEX-4T-1载体进行连接，得到重组表达质粒pGEX-4T-1-Argc。通过双酶切及测序鉴定重组质粒(见图1)。

[0019] 实施例2：Argc片段蛋白的表达及纯化

[0020] 将重组表达质粒pGEX-4T-1-Argc转入大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆，挑取单菌落接种于5mLLB培养基中过夜培养，然后接种于1L的培养基中，37℃震荡培养至A600nm达到0.5时，加入浓度为0.5mol/L的IPTG，继续培养4h收集菌体。用PBS缓冲液重悬菌体后超声破碎，收集上清。采用GST亲和层析法纯化上清样(见图2)。待总蛋白充分吸附以后，用PBS(pH 7.4)缓冲液清洗亲合柱，洗至紫外吸收值为0时停止洗涤。50mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0，10mM的GSH，)缓冲液洗脱，收集洗脱液，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。

[0021] 实施例3：胰蛋白酶抑制剂活力测定

[0022] 以BAPA(苯甲酰-dl-Arg-P-硝基酰替苯胺盐酸盐)为底物，加入不同浓度的融合蛋白各100μL，用紫外吸收法于410nm处测定胰蛋白酶抑制剂的活力(见图3)。

[0023] 实施例4：二硫键定量测定

[0024] 自由巯基含量的测定，CBB法检测待测样品的浓度，取200μL待测样品，加入4.8g尿素定容至1mL，37℃温浴4h。加入2mLTris-Gly缓冲液，50μLDTNB，5分钟后测412nm吸光值。根据吸光值大小判断多肽中游离巯基的含量。根据总巯基数即可计算二硫键个数。计算方法：

[0025]

[0026] A412：412nm处的吸光值 D：稀释倍数 C：蛋白浓度(mg/ml)[0027] 由以上公式得μM SH/g(GST-Argc)＝105.62(对照GST蛋白无吸光度值)[0028] 游离SH数＝105.62M/106＝3.06(M：GST-Argc相对分子量)

[0029] 二硫键对数＝7(总巯基数)-3.06(游离巯基数)/2＝2

[0030] 实施例5：MTT法检测对细胞增殖影响

[0031] 指数生长期的SW480、SW620、HepG2及MDCK细胞以1×104个/孔传入96孔培养板，37℃含5％的CO2培养箱孵育24h后，加入不同浓度的融合蛋白至终浓度依次为2.0μM、
5.0μM、10.0μM。每个浓度设四个复孔，并用含GST蛋白的洗脱缓冲液作为对照。孵育24h后吸弃孔内液体，PBS洗涤后加入新培养基，每孔加MTT溶液(5mg/ml)20μl，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值(见图4)。

[0032] 实施例6：细胞迁移实验

[0033] 将HL7702细胞以5～10×105个/孔密度接种到24孔板上，细胞贴壁并形成单层细胞后，用10μL无菌移液枪枪头垂直划线，PBS洗涤，显微镜下测量划痕直径，并分别设有实验组和对照组。实验组加入终浓度7.5μM的纯化蛋白Argc，对照组加入相同浓度的GST蛋白。孵育24h后显微镜下测量划痕处细胞向外移动的距离(见图5)。