源自RHBDD1的蛋白及其在制备用于检测结直肠癌或乳腺癌的单克隆抗体中的用途

摘要

本发明提供了一种源自RHBDD1的蛋白，该蛋白的氨基酸序列为RHBDD1的215-315位氨基酸。本发明还提供了所述源自RHBDD1的蛋白在制备用于检测直肠癌或乳腺癌的单克隆抗体中的用途，该用途主要为：利用所述源自RHBDD1的蛋白作为抗原，通过杂交瘤技术制备并得到杂交瘤细胞株，进一步使用该杂交瘤细胞株进行小鼠腹腔免疫，收腹水并纯化得到RHBDD1的小鼠单克隆抗体，该小鼠单克隆抗体即为用于检测直肠癌或乳腺癌的抗体。利用本发明获得的所述单克隆抗体为结直肠癌或乳腺癌的临床诊断提供了辅助检测手段，其利用RHBDD1在结直肠癌和乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织作为判断依据进行辅助诊断。

权利要求

1.源自RHBDD1的蛋白在制备用于检测直肠癌或乳腺癌的单克隆抗体中的用途，其特征在于，将RHBDD1的215-315位氨基酸作为抗原表位，制备单克隆抗体，该单克隆抗体即为用于检测直肠癌或乳腺癌的单克隆抗体，RHBDD1的215-315位氨基酸的序列如SEQ IDNO：

1所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述制备单克隆抗体的方法为杂交瘤技术制备单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：(1)抗原制备；

(2)免疫动物；

(3)免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；

(4)细胞融合；

(5)杂交瘤细胞的选择培养；

(6)杂交瘤细胞的筛选；

(7)杂交瘤细胞的克隆化；

(8)单克隆抗体的检定；

(9)分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；

(10)单克隆抗体的大量制备。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，通过构建原核表达质粒并进行大肠杆菌原核表达纯化的方法进行抗原制备。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，单克隆抗体的大量制备采用动物体内诱生法或体外培养法。

6.一种源自RHBDD1的蛋白，其特征在于，该源自RHBDD1的蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示的RHBDD1的215-315位氨基酸。

7.编码权利要求6所述的源自RHBDD1的蛋白的基因。

8.利用权利要求6所述的源自RHBDD1的蛋白作为抗原制备的单克隆抗体。

说明书

源自RHBDD1的蛋白及其在制备用于检测结直肠癌或乳腺

癌的单克隆抗体中的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及源自RHBDD1的蛋白及其在制备用于检测结直肠癌或乳腺癌的单克隆抗体中的用途。

背景技术

[0002] 一般来说，多跨膜蛋白在进化中并不是特别保守，但是Tatusov RL等在搜索Clusters of Orthlologous Groups of proteins(COGs)数据库时发现了唯一的一个非常保守的蛋白家族，即Rhomboid蛋白家族。该家族是近年来才发现的，已经在古生菌、细菌、酵母菌、蜾蝇、哺乳动物，包括人，甚至植物等生物中发现了Rhomboid蛋白同源物。这是一类能够切割单一跨膜蛋白跨膜结构域的丝氨酸蛋白酶。

[0003] 第一个Rhomboid蛋白是Christiane Nusslein-Volhard和Eric Wieschaus在遗传扫描(genetic screens)中通过突变发现的，并因此获得了1995年诺贝尔奖。他们发现该基因突变的蜾蝇胚胎有着Rhomboid形的头，即菱形的头。Rhomboid基因是相关于蜾蝇胚胎中腹外侧位置信息的四个基因之一，这也是Rhomboid蛋白家族的典型，涉及表皮生长因子受体(EGFR)信号传导通路的调节蛋白。

[0004] 直到最近，已经发现的Rhomboid家族蛋白约有100种，它们均进化保守，广泛地存在于各种生物中。但是其序列同源性比较低，只是具有保守的Rhomboid结构域。如此保守的蛋白质在数万年的进化过程中保存下来，肯定有其重要的作用。尽管目前人们对这个家族蛋白的认识还很肤浅，只是集中在果蝇中的一些了解，但是从这些初步的结果以及其逐渐体现出的独特作用来看，如果进一步深入研究这些蛋白质的功能将有助于我们认识关于细胞之间信息传导的详细机制。

[0005] Rhomboid家族蛋白的表达受调控，而且催化底物具有特异性，这可能暗示这些蛋白质在某些重要组织中有作用。它既体现了类似于一些管家蛋白的保守性，却没有管家蛋白的表达普遍性，又体现了类似于组织细胞特异表达蛋白的特异性，却又有着代表一类蛋白的保守性；所以，它们可能在一些对于生物发育成长重要的事件中发挥重要作用。

[0006] RHBDD1是发明人所在实验室从睾丸抑制性消减杂交文库中筛选出的一个在睾丸组织中高表达的新基因(GenBank登录号：AY640233)。该基因在人中表达全长为315个氨基酸，含有四个跨膜结构域，其215-315位氨基酸为一段高度亲水区。蛋白结构域分析表明，在其61-214位氨基酸含有一个高度保守的Rhomboid结构域，故该蛋白属于Rhomboid蛋白酶家族的新成员。实验室前期对RHBDD1的功能进行了较为深入的研究，包括：发现RHBDD1通过特异性切割并降解促凋亡蛋白质BIK而发挥抑制凋亡的作用(Cellular and Molecular LifeSciences 65：3822-9，2008)；应用自己建立并完善的小鼠精子发生重塑模型观察RHBDD1对精子发生的影响，结果发现RHBDD1基因敲减后明显抑制GC-1细胞的分化发育(BMC Cell Biol10：25，1-7，2009)；RHBDD1可以特异性切割肿瘤抑制子活化通路蛋白6(TSAP6)，进而参与调节TSAP6介导的外体分泌过程(文章在投稿中)；此外，发现RHBDD1具有特异性的促进AP-1信号通路的作用，可能在促进细胞周期、癌症发生中发挥特定作用。

发明内容

[0007] 本发明的目的是基于RHBDD1的功能研究提供RHBDD1在制备临床诊断试剂或治疗试剂方面的用途。

[0008] 本发明提供了源自RHBDD1的蛋白在制备用于检测直肠癌或乳腺癌的单克隆抗体中的用途，主要为：将RHBDD1的215-315位氨基酸作为抗原表位，制备单克隆抗体，该单克隆抗体即为用于检测直肠癌或乳腺癌的单克隆抗体，RHBDD1的215-315位氨基酸的序列如SEQ ID NO：1所示。

[0009] 较佳地，所述制备单克隆抗体的方法为杂交瘤技术制备单克隆抗体。

[0010] 杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤可以包括：

[0011] (1)抗原制备；

[0012] (2)免疫动物；

[0013] (3)免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；

[0014] (4)细胞融合；

[0015] (5)杂交瘤细胞的选择培养；

[0016] (6)杂交瘤细胞的筛选；

[0017] (7)杂交瘤细胞的克隆化；

[0018] (8)单克隆抗体的检定；

[0019] (9)分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；

[0020] (10)单克隆抗体的大量制备。

[0021] 较佳地，通过构建原核表达质粒并进行大肠杆菌原核表达纯化的方法进行抗原制备。

[0022] 单克隆抗体的大量制备可以采用动物体内诱生法或体外培养法。

[0023] 相应地，源自RHBDD1的215-315位氨基酸的蛋白(序列如SEQ ID NO：1所示)及其基因和将其作为抗原制备的单克隆抗体也都是本发明的一部分。

[0024] 本发明基于RHBDD1的功能研究提供了其在制备临床诊断试剂方面的用途。本发明为结直肠癌或乳腺癌的临床诊断提供了辅助检测手段，其利用RHBDD1在结直肠癌和乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织作为判断依据，为RHBDD1的应用做出了有益的探索。

附图说明

[0025] 图1为大肠杆菌表达纯化的抗原蛋白(RHBDD1的215-315位氨基酸)的凝胶电泳图；

[0026] 图2-1和图2-2分别为获得两株特异性高的单克隆抗体细胞株26号和30号的抗体特异性检测结果；

[0027] 图3为26号抗体Western blot检测结直肠癌病人的癌与癌旁中RHBDD1的表达情况的结果；

[0028] 图4-1和图4-2分别为通过组织芯片技术检测RHBDD1在结直肠癌和癌旁组织中的表达情况的检测结果；

[0029] 图5为从芯片结果中各选取两例结肠癌和两例直肠癌的拍照结果；

[0030] 图6为RHBDD1的RNA干扰稳定细胞株(两个靶点)的鉴定结果如图；

[0031] 图7为RHBDD1的RNA干扰稳定细胞株测定的细胞生长情况的生长曲线；

[0032] 图8-1和图8-2表示了RHBDD1的RNA干扰稳定细胞株克隆形成实验检测的细胞生长情况；

[0033] 图9为通过体细胞基因敲入技术制备RHBDD1内源活性位点突变失活的结直肠癌细胞株HCT116和RKO的鉴定结果；

[0034] 图10-1和图10-2分别为通过体细胞基因敲入技术制备RHBDD1内源活性位点突变失活的结直肠癌细胞株HCT116和RKO的细胞生长情况的生长曲线；

[0035] 图11-1和图11-2分别为通过体细胞基因敲入技术制备RHBDD1内源活性位点突变失活的结直肠癌细胞株HCT116和RKO的克隆形成实验检测的细胞生长情况；

[0036] 图12-1和图12-2分别为通过体细胞基因敲入技术制备RHBDD1内源活性位点突变失活的结直肠癌细胞株HCT116和RKO的软琼脂集落形成实验的结果；

[0037] 图13表示了微波加热修复(pH 6修复液)条件下RHBDD1的免疫组化染色结果(人结肠癌)(100×)；

[0038] 图14-1到图14-8表示了RHBDD1在不同样本中的表达水平，依次为阴性对照(40×)、阳性对照(40×)、弱阳性(100×)、弱阳性(200×)、中等阳性(100×)、中等阳性(200×)、强阳性(100×)和强阳性(200×)；

[0039] 图15-1和图15-2为RHBDD1在癌旁正常乳腺组织中的表达情况，分别为阴性(100×)和弱阳性(100×)的情况；；

[0040] 图16表示了不同RHBDD1表达程度患者的Kaplan-Meier生存曲线(比较阴性、弱阳性、中等阳性和强阳性)；

[0041] 图17表示了不同RHBDD1表达程度患者的Kaplan-Meier生存曲线(比较阴性和阳性)。

具体实施方式

[0042] 下面进一步说明本发明的具体实施方式。

[0043] 首先是利用杂交瘤技术制备小鼠单克隆抗体，制备流程的主要步骤包括：

[0044] (1)抗原制备；

[0045] (2)免疫动物；

[0046] (3)免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；

[0047] (4)细胞融合；

[0048] (5)杂交瘤细胞的选择培养；

[0049] (6)杂交瘤细胞的筛选；

[0050] (7)杂交瘤细胞的克隆化；

[0051] (8)单克隆抗体的检定；

[0052] (9)分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；

[0053] (10)单克隆抗体的大量制备。

[0054] 下面简要介绍单克隆抗体的制备过程：

[0055] 1)、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

[0056] 2)、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

[0057] 3)、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

[0058] 4)、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

[0059] 5)、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备采用动物体内诱生法或体外培养法。

[0060] (1)体内诱生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。

[0061] (2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。

[0062] 其中，制备过程中的关键性数据结果如下：

[0063] 1)RHBDD1全长315个氨基酸，我们通过亲疏水性分析和抗原表位预测后，选择215-315位氨基酸(依次对应于SEQ ID NO：1所示序列的1-101位氨基酸)作为抗原表位，构建原核表达质粒并进行大肠杆菌原核表达纯化，蛋白纯化结果如图1所示，得到的RHBDD1融合表达蛋白的纯度较高(＞90％)，可用于制备单克隆抗体。

[0064] 2)制备RHBDD1的小鼠单克隆抗体，并获得两株特异性高的单克隆抗体细胞株26号和30号，抗体特异性检测结果分别如图2-1和图2-2所示(wt：野生型；mt：突变型)，都处于34kDa与26kDa之间，邻近34kDa。获得的26号和30号RHBDD1小鼠单克隆抗体的特异性好，效价高。

[0065] 下面为一部分检测结果

[0066] 1.使用26号抗体Western blot检测结直肠癌病人的癌与癌旁中RHBDD1的表达情况，检测结果如图3所示，RHBDD1在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织。

[0067] 2.通过组织芯片技术检测RHBDD1在结直肠癌和癌旁组织中的表达情况，71例结肠癌的检测结果如图4-1所示，71例直肠癌的检测结果如图4-2所示。

[0068] 从芯片结果中各选取两例结肠癌和两例直肠癌拍照结果如图5所示，可以看出，RHBDD1在癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织。

[0069] 3.制备了RHBDD1的RNA干扰稳定细胞株(两个靶点)，鉴定结果如图6所示。两个靶点的RNA干扰效果均大于80％。

[0070] 生长曲线测定细胞生长情况如图7所示，RHBDD1表达受到抑制后细胞的生长明显减慢。

[0071] 克隆形成实验检测细胞生长情况如图8-1和图8-2所示。RHBDD1表达受到抑制后细胞克隆的生长明显减慢。

[0072] 4.通过体细胞基因敲入技术制备RHBDD1内源活性位点突变失活的结直肠癌细胞株HCT116和RKO，鉴定结果如图9所示，RHBDD1活性位点的内源突变使该蛋白质结构改变并被体内降解，因此在蛋白质水平检测不到RHBDD1的表达，相当于RHBDD1的基因敲入细胞。

[0073] 生长曲线测定细胞生长情况如图10-1和图10-2所示，在HCT116和RKO细胞中，内源RHBDD1的突变失活使细胞的生长明显减慢。

[0074] 克隆形成实验检测细胞生长情况如图11-1和图11-2所示，在HCT116和RKO细胞中，内源RHBDD1的突变失活导致细胞克隆的生长明显减慢。

[0075] 软琼脂集落形成实验的结果如图12-1和图12-2所示，在HCT116和RKO细胞中，内源RHBDD1的突变失活导致细胞在软琼脂中生长缓慢。

[0076] 总结：本发明选择RHBDD1的215-315位氨基酸作为抗原进行原核表达纯化，再通过杂交瘤技术制备并得到26#和30#两株特异性较高的杂交瘤细胞株。进一步使用该细胞株进行小鼠腹腔免疫，收腹水并纯化得到RHBDD1的小鼠单克隆抗体。使用该抗体检测肿瘤组织表达情况(包括结直肠癌和乳腺癌等)，发现RHBDD1在结直肠癌和乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织。这一临床检测结果提示RHBDD1在肿瘤发生和发展过程中可能具有重要作用，并且该蛋白在肿瘤中的表达检测可以成为临床诊断的辅助检测手段，这些研究结果为RHBDD1的开发应用打下了坚实的基础。

[0077] 本发明的理论基础是RHBDD1在结直肠癌和乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织。下面通过RHBDD1免疫组化染色实验来验证该理论基础。

[0078] 一、RHBDD1免疫组化染色条件

[0079] 选取较新鲜的人结肠癌石蜡标本，切片，抗原修复法分别采用微波热修复(酸性修复液和碱性修复液)、高压热修复、胰酶修复、不修复，结果显示各修复方法均有染色，相比较而言，微波热修复(酸性修复液)染色效果最佳。碱性修复液及高压热修复方法可造成少部分细胞核异位染色，胰酶修复与不修复条件下染色偏浅。

[0080] 后续实验抗原修复条件均采用微波热修复、酸性修复液(柠檬酸缓冲液pH 6.0)。

[0081] 图13表示了微波加热修复(pH 6修复液)条件下RHBDD1的免疫组化染色结果(人结肠癌)(100×)

[0082] 二、RHBDD1在浸润性乳腺癌中的表达

[0083] 1.RHBDD1在浸润性乳腺癌中的表达水平

[0084] RHBDD1在浸润性乳腺癌中阳性表达为35例，阴性22例，阳性者其中3例为强阳性，4例为中等阳性，28例为弱阳性。阳性率61.4％。

[0085] 图14-1到图14-8表示了RHBDD1在不同样本中的表达水平，依次为阴性对照(40×)、阳性对照(40×)、弱阳性(100×)、弱阳性(200×)、中等阳性(100×)、中等阳性(200×)、强阳性(100×)和强阳性(200×)。阴性对照为一抗孵育环节仅加入一抗稀释液，作为空白对照；阳性对照为明确证实p53阳性的人浸润性乳腺导管癌标本，作为实验方法对照。RHBDD1抗体的稀释倍比均为1∶200。

[0086] 2.RHBDD1在不同类型的浸润性乳腺癌中的表达

[0087] 如表1所示，在27例浸润性乳腺导管癌中，RHBDD1阴性6例，弱阳性18例，中等阳性3例。在27例浸润性乳腺小叶癌中，RHBDD1阴性13例，弱阳性10例，中等阳性1例，强阳性3例。3例浸润性导管癌合并小叶癌中，RHBDD1染色均为阴性。

[0088] 比较RHBDD1在不同病理类型中的阳性率，浸润性导管癌中为77.8％，浸润性小叶2
癌中为51.8％，经Pearson卡方检验，此两者差异具有统计学意义。(X ＝3.979，p＝0.046)[0089] 表1RHBDD1在不同病理类型的乳腺癌中的表达差异

[0090]

[0091] 注：括号内数字为所占百分比(％)

[0092] 3.RHBDD1在癌旁正常乳腺组织中的表达

[0093] 全部57例中，10例缺乏癌旁正常组织或数量过少、不足以计数，其余47例中，32例为阴性，14例为弱阳性，1例为强阳性。阳性率为31.9％。

[0094] 比较RHBDD1在乳腺癌与癌旁正常组织中的表达，具有显著性差异。(X2＝8.973，p＝0.003)

[0095] 图15-1和图15-2为RHBDD1在癌旁正常乳腺组织中的表达情况，分别为阴性(100×)和弱阳性(100×)的情况。

[0096] 三、RHBDD1表达与肿瘤临床病理特点之间的联系

[0097] 采用Spearman秩相关检验，考察RHBDD1表达情况与乳腺癌其他常用的临床病理指标之间是否存在相关性。各组指标的分等级说明如下：

[0098] 肿瘤T分期：根据美国癌症联合委员会(AJCC)对乳腺癌的TNM分期(2003)，其中T分期依据肿瘤的最大直径，分为T1：≤2.0cm、T2：＞2.0cm且≤5.0cm、T3：≥5.0cm、T4：无论肿瘤大小，直接侵犯胸壁或皮肤。

[0099] 淋巴结转移：根据AJCC对乳腺癌的TNM分期(2003)，其中pN分期依据病理学证实的淋巴结转移情况，pN0：无组织学上的区域淋巴结转移，pN1：1-3个腋窝淋巴结转移，或前哨淋巴结活检发现内乳淋巴结有微小转移，但临床不明显，pN2：4-9个腋窝淋巴结转移，或内乳淋巴结转移但腋窝淋巴结无转移，pN3：≥10个腋窝淋巴结转移，或内乳及腋窝淋巴结均有转移，或同侧锁骨上/锁骨下淋巴结转移。

[0100] 免疫组化指标：根据外检报告结果。

[0101] 表2RHBDD1的表达程度与其他临床病理指标间的关系

[0102]

[0103] 表2的统计结果表明RHBDD1的表达与肿瘤T分期、PR呈负相关(相关系数分别为-0.277、-0.318，p值均小于0.05)，与淋巴结转移、ER、HER2及p53无关。

[0104] 四、RHBDD1表达与预后的关系

[0105] 在随放到的45例浸润性乳腺癌患者中，RHBDD1阴性表达的为17例，至随访时间终点(2011年5月25日)，共有3例发生死亡；RHBDD1弱阳性表达的有23例，共有3例发生死亡；RHBDD1中等阳性表达的4例，其中1例发生死亡；RHBDD1强阳性表达1例，1例发生死亡。

[0106] 图16表示了不同RHBDD1表达程度患者的Kaplan-Meier生存曲线。阳性表达组平均生存时间为55.0月(95％CI 51.0-58.9月)，阴性表达组平均生存时间为55.0月(95％CI 48.0-62.0月)。

[0107] 在RHBDD1染色强度进行水平间的整体比较，发现染色强度与预后呈负相关(Log2 2
Rank检验：X ＝13.475，p＝0.004，Breslow检验：X ＝13.006，p＝0.005)。进一步进行分组的两两比较，发现阴性、弱阳性、中等阳性各组间的差异均无统计学意义(Log Rank检验和Brewlow双重检验，p均大于0.1)，强阳性与其它各组间的差异均有统计学意义(Log Rank检验和Brewlow双重检验，p均小于0.05)。

[0108] 将RHBDD1弱阳性、中等阳性及强阳性合并为阳性表达组，图17表示了不同RHBDD1表达程度的患者的Kaplan-Meier生存曲线(仅比较阴性表达组与阳性表达组)，比较阳性表达组与阴性表达组的生存期，发现RHBDD1表达与否对预后的影响无差异(Log Rank检2 2
验：X ＝0.190，p＝0.663；Breslow检验：X ＝1.214，p＝0.271)。

[0109] 下面补充说明一下免疫组化染色和结果判定的方法。

[0110] 1.实验方法：

[0111] 1)烤片：将石蜡切片置于烤片机，温度设定于66℃，烤片1小时。

[0112] 2)脱蜡及水化：将石蜡切片置于金属片篮中，置于100％二甲苯中脱蜡，每次15分钟，共3次；再分别置于100％、90％、80％乙醇中水化，各浓度乙醇分别保留1分钟；用去离子水冲洗3次，每次1分钟。

[0113] 3)抗原修复：不同抗原修复条件如下：

[0114]

[0115] 凡热修复后使切片在原修复液环境下冷却至室温，用PBS冲洗3次，每次2分钟；胰酶修复完成后直接用PBS冲洗3次，每次2分钟。

[0116] 4)内源性过氧化物酶封闭：每张切片滴加50μl 3％过氧化氢去离子水，于室温下湿盒内孵育10分钟；用PBS冲洗3次，每次2分钟。

[0117] 5)非特异性抗原结合位点封闭：每张切片滴加50μl进口羊血清工作液，于室温下湿盒内孵育10分钟；甩去玻片上的液体后进行下一步(不冲洗)。

[0118] 6)一抗孵育：每张切片滴加50μl稀释后的一抗工作液，于4℃、湿盒内孵育过夜(13-14小时)；用PBS冲洗3次，每次2分钟。注：PI4KIIα抗体采用1∶100稀释；RHBDD1抗体采用1∶200稀释。

[0119] 7)二抗孵育：根据不同试剂盒的要求：

[0120] PV-6000-G通用型(鼠/兔)检测试剂盒：直接滴加50μl工作液于玻片上，室温下孵育20分钟，后用PBS冲洗3次，每次2分钟；

[0121] PV-9000通用型(鼠/兔)检测试剂盒：滴加50μl试剂1(聚合酶辅助剂，增加细胞膜通透性)于玻片上，室温下孵育20分钟，后PBS冲洗3次，每次2分钟；滴加50μl试剂2(山羊抗鼠/兔Ig聚合物-HRP)于玻片上，室温下孵育30分钟，后PBS冲洗3次，每次2分钟。

[0122] 8)DAB显色：将DAB显色剂以1∶20稀释于DAB底物缓冲液，每张切片滴加50μl，显色2-4分钟；在显微镜下观察，达到适宜的显色程度时，以自来水冲洗终止。

[0123] 9)苏木素复染：苏木素染色3分钟，自来水充分冲洗；盐酸酒精分化10秒，自来水充分冲洗；氨水返蓝30秒，自来水充分冲洗。

[0124] 10)制片：分别置于80％、90％、100％乙醇中脱水，各浓度乙醇分别保留1分钟；再置于100％二甲苯中透明，每次5分钟，共3次；中性树胶制片。

[0125] 2.阳性对照与阴性对照：

[0126] 1)阳性对照：p53阳性的浸润性乳腺导管癌，实验方法同上，一抗孵育时滴加p53鼠单抗工作液。

[0127] 2)阴性对照：组织来源同阳性对照片，实验方法同上，一抗孵育时仅滴加抗体稀释液。

[0128] 3.结果判定：

[0129] 按照积分综合计量方法，分别对浸润性肿瘤组织及同一张切片上的正常乳腺组织进行评分。肿瘤组织计数10个高倍镜视野，正常乳腺组织(视面积大小)计数3-5个高倍镜视野。每个高倍镜视野评分方法如下：根据细胞染色强度的深浅，分别计0-3分：0分＝阴性，无着色，1分＝弱阳性，浅黄色、细颗粒，2分＝中等阳性，棕黄色、中等颗粒，3分＝强阳性，棕褐色、粗大颗粒；根据细胞染色面积的大小，计数阳性细胞的百分比，每个高倍镜视野分数＝弱阳性细胞百分比×1+中等阳性细胞百分比×2+强阳性细胞百分比×3，后取所有高倍镜视野的平均分。

[0130] 最终结果根据以上计数得到的平均分：0分，为阴性；＜1.0分，为弱阳性(+)；≥1.0分且＜1.5分，为中等阳性；≥1.5分，为强阳性。

[0131] 对于PI4KIIα及RHBDD1，特异性的染色为细胞浆着色，细胞核、细胞膜均不着色。

[0132] 每张切片的染色结果由两人分别独立评分判定，如2份结果一致，则结果认可；如2份结果不一致，由第三人进行独立评分。

[0133] 下面介绍一下提出本发明前的一些研究工作，这些内容有助于进一步理解本发明。

[0134] 本发明的发明人前期成功建立了三个SSH(suppressive subtract hybrid)文库，测序得到1092个差异克隆EST。为了寻找精子发生过程中可能的重要基因，本研究中首先分析了其中约200个EST，最终选择了9个，并从人睾丸文库中扩增得到相应的全长基因，其中4个提交GenBank并得到登录号，它们分别为：HSD-43(AY640232)、HSD-44(AY640234)、HSD-50(AY640233)、HSD-51(AY973323)。选择原则有两个：1.为了方便克隆基因，利用EST序列比对GenBank数据库之后可以得到相应的核苷酸序列；2.没有对应于该EST的有实验证据支持的基因申请提交，可以有相应的推测基因(hypothetic gene)存在。HSD-50(RHBDD1)被最终作为研究对象进行深入研究。

[0135] HSD-50基因是作为一个新基因被提交到GenBank数据库中的，因为之前没有任何有实验证据支持的关于该基因的报道。HSD-50含有一个非常保守的Rhomboid结构域，含有该结构域的蛋白质组成一个Rhomboid家族；因此，HSD-50可能是这个家族的新成员。这个蛋白家族是一个非常保守的家族，广泛的存在于各种生物中，已经在古生菌、细菌、酵母菌、果蝇、哺乳动物，包括人，甚至植物等生物中发现了Rhomboid蛋白同源物。这是一类能够切割单一膜蛋白跨膜结构域的丝氨酸蛋白酶[1-4]。它们各成员之间的序列同源性比较低，只是具有保守的Rhomboid结构域。如此保守的蛋白质在数万年的进化过程中保存下来，肯定有其重要的作用。尽管目前人们对这个家族蛋白的认识还很肤浅，只是集中在果蝇中的一些了解，但是从这些初步的结果以及其逐渐体现出的独特作用来看，如果进一步深入研究这些蛋白质的功能将有助于我们认识关于细胞之间信息对话的详细机制。Rhomboid蛋白酶加工修饰的底物涉及到许多信号传导通路，这也许是揭示这些蛋白功能的一个钥匙。

[0136] Rhomboid家族蛋白的表达受调控，而且催化底物具有特异性，这可能暗示这些蛋白质在某些重要组织中有作用。本实验中克隆得到的HSD-50是从人睾丸组织中获得，这可能提示其在精子发生过程中有一定的作用。这类蛋白质体现了类似于一些管家蛋白的保守性，却没有管家蛋白的表达普遍性，又体现了类似于组织细胞特异表达蛋白的特异性，却又有着代表一类蛋白的保守性；所以，它们可能在一些对于生物发育成长重要的事件中发挥作用，这些事件就可能涉及生殖系统、神经系统等。如果具有一些重要的功能，其也许会有更复杂的作用模式存在，不仅仅是简单的对一些蛋白质的切割加工；可能会存在一些复合体，比如Rhomboid蛋白自身缺失一些重要的功能基序，而其分子伴侣中却存在互补，这样就可以精细的调控其切割活性，以适应复杂的生命现象。或者，也可能化复杂为简单，进化越高级，这些蛋白质可能只剩下必要的功能结构域而使自身更俭约。

[0137] 针对人多组织膜进行Northern blot杂交分析发现其为多组织表达，且睾丸组织高表达；构建了HSD-50蛋白质的原核表达载体，用HSD-50蛋白C端非保守区域100aa的多肽作为高纯度抗原肽免疫新西兰大白兔，制备了多克隆抗体。经ELISA测定抗体滴度达1：32万；免疫组化结果显示，HSD-50主要在精原细胞胞浆中表达；被动免疫新西兰大白兔之后，动物的睾丸组织病理切片结果显示，多数曲细精管中精子细胞形成融合的巨细胞，有少数曲细精管中个别精原细胞、精母细胞出现核固缩现象，并且约10％各型细胞有脱落，曲细精管横切面可见生精细胞脱落后遗留的空隙。

[0138] 酵母双杂交实验结果发现，HSD-50可与Bcl-2家族的促凋亡分子BIK相互作用；免疫共沉淀实验也进一步证明了这两个蛋白质之间的相互作用；免疫荧光实验结果显示，HSD-50和BIK之间存在较好的共定位现象。

[0139] HSD-50蛋白包含的Rhomboid结构域是一个特殊的丝氨酸蛋白酶结构域，具有这个结构域的蛋白质组成了一个蛋白家族，即Rhomboid家族，它们具有蛋白酶的活性，可以切割其特异的底物。在本研究中发现，外源性的HSD-50可以有效的降解外源性的BIK，当同时转染针对HSD-50有效的RNAi载体pSilencer-AB时，可以部分的抑制这个过程；这种降解过程具有时间依赖性，随着时间的增加，相同量HSD-50可以降解更多的BIK；也具有剂量依赖性，不同剂量的HSD-50，在相同时间内，对等量BIK的降解程度不同；这种降解过程对丝氨酸蛋白酶特异的抑制剂Aprotinin敏感，降解的过程可以被有效抑制；该过程不能被蛋白酶体抑制剂pS341抑制。

[0140] 根据HSD-50蛋白和Rhomboid家族中的典型代表Rhomboid1进行比对，预测了发挥其丝氨酸蛋白酶活性的关键氨基酸：N44、G142、S144和H184；其中HSD-50蛋白的G(142)FS(144)GV结构高度同源于Rhomboid1蛋白中非常重要的结构G(215)AS(217)GG。针对这些预测，构建了一系列点突变N44、G142、S144和H184为A的突变体，同时缺失G142、S144和H184的突变体，以及只包括Rhomboid结构域的N端214aa的突变体和不包括Rhomboid的C端101aa的突变体；经过对这些突变体降解BIK的分析发现，点突变N44和H184并不影响HSD-50对BIK的降解活性；而单个点突变G142、S144后会降低其对BIK的降解活性，但当同时缺失G142和S144时，HSD-50对BIK的降解活性会严重降低；突变体214具有部分降解BIK的活性，而突变体101没有这种活性。

[0141] HEK 293T细胞中有HSD-50和BIK的内源性表达，但是BIK的表达量非常低。蛋白酶体抑制剂pS341可以诱导内源性的BIK在HEK 293T细胞中的积累。为了方便内源性BIK的检测，应用1μM的pS341诱导来构建BIK高表达模型，同时研究了HSD-50过表达和表达抑制时，内源性BIK在细胞中的含量变化。结果显示，过表达时，与对照相比BIK的含量有所降低；而当用RNAi抑制HSD-50的表达时，与对照相比BIK的含量明显增加。这个现象反映了在近似生理状态下，内源性的HSD-50也是可以降解内源性BIK的，这个过程可能是调节Bcl-2家族中促凋亡的分子BIK在细胞中水平的一种方式。实验中，同时检测了HSD-50是否会影响Bcl-2家族中的Bax和Bcl-2的表达，Western blot分析结果显示：没有引起这两种蛋白质表达量的明显变化。

[0142] 此外，HSD-50在HEK 293T细胞中过表达时可以激活AP1信号通路，而当RNAi有效抑制内源性HSD-50的表达时可以逆转这种现象。