一种β-葡聚糖酶GLU、耐高温β-葡聚糖酶VGLU及其基因和应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种β-葡聚糖酶GLU、耐高温β-葡聚糖酶VGLU及其基因和应用。本发明提供了一种β-葡聚糖酶GLU，其具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，一种耐高温β-葡聚糖酶VGLU其具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述β-葡聚糖酶和耐高温β-葡聚糖酶的基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4所示，本发明还提供了包含上述两种基因的重组载体、重组菌株及其应用。本发明的耐高温β-葡聚糖酶通过高效表达后能够达到较高的发酵水平，在工业生产中可大大降低生产成本，使其在饲料、啤酒酿造等工业中显示出更大的应用潜力。

权利要求

1.一种β-葡聚糖酶GLU，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种β-葡聚糖酶基因GLU，其特征在于，编码权利要求1所述的β-葡聚糖酶，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种β-葡聚糖酶VGLU，其特征在于，由权利要求1所述β-葡聚糖酶改造获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种β-葡聚糖酶基因VGLU，其特征在于，编码权利要求3所述的β-葡聚糖酶。

5.根据权利要求4所述的β-葡聚糖酶基因VGLU，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.包含权利要求2所述β-葡聚糖酶基因GLU或权利要求4所述β-葡聚糖酶基因VGLU的重组载体。

7.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPICzαA-GLU或pPICzαA-VGLU，其中，将权利要求2所述β-葡聚糖酶基因GLU与权利要求4所述β-葡聚糖酶基因VGLU分别插入到质粒pPICzαA上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使所述基因的核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，分别得到重组酵母表达质粒pPICzαA-GLU与pPICzαA-VGLU。

8.包含权利要求2所述β-葡聚糖酶基因GLU或权利要求4所述β-葡聚糖酶基因VGLU的重组菌株。

9.一种制备β-葡聚糖酶VGLU的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用重组载体pPICzαA-VGLU转化宿主细胞，得重组菌株，其中，权利要求4所述β-葡聚糖酶基因VGLU插入到质粒pPICzαA上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使所述基因的核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPICzαA-VGLU；

2）培养重组菌株，诱导β-葡聚糖酶VGLU的表达；以及

3）回收并纯化所表达的β-葡聚糖酶VGLU。

10.权利要求1所述β-葡聚糖酶GLU或权利要求3所述β-葡聚糖酶VGLU用于非治疗目的降解β-葡聚糖的应用。

说明书

一种β-葡聚糖酶GLU、耐高温β-葡聚糖酶VGLU及其基

因和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种β-葡聚糖酶GLU、耐高温β-葡聚糖酶VGLU及其基因和应用。

背景技术

[0002] β-葡聚糖是植物细胞壁的主要组成成分，属结构性非淀粉多糖(Non-starch polysaccharides，NSP)，广泛存在于禾谷类（大麦、燕麦、黑麦和小麦等）的糊粉层和胚乳细胞壁中。β-葡聚糖通常是饲料中的抗营养因子及在啤酒酿造过程中会降低啤酒的品质及产率。

[0003] β-葡聚糖酶（β-Glucanase，E.C 3.2.1.73）可水解β-糖苷键而形成葡萄糖聚合物等小分子物质，属于半纤维素水解酶。由于β-葡聚糖酶的作用特点，该酶可广泛应用于啤酒酿造、饲料等行业，具有十分广阔的应用前景。

[0004] 改革开放以来，我国的饲料工业得到迅速发展。据统计，2010年，中国饲料总产量达到1.57亿吨，比上年提高5.9%。在饲料产量快速增长的同时，饲料原料的短缺问题日益7
严重，预计2010年到2020年我国饲料用粮将缺乏2.4～8.3×10 吨能量饲料，因此，非常规饲料原料如大麦、小麦、棕榈粕等的应用成为解决短缺问题的有效途径，但由于这些原料中β-葡聚糖等抗营养因子含量较高，单胃动物不能分泌内源性β-葡聚糖酶，无法消化利用β-葡聚糖，再加上β-葡聚糖的存在会造成较高的黏稠性，影响其它营养物质的消化吸收，因此β-葡聚糖成为饲料中一种主要的抗营养因子，严重影响了这些原料的使用。

[0005] β-葡聚糖是由β-1，3和β-1，4混合的糖苷键连接形成的葡聚糖聚合物，分为水溶性和水不溶性两种，其中与蛋白质结合的β-葡聚糖大都不溶于水。水溶性的β-葡聚糖所占的比例较大，可与水形成粘稠状物质，而且β-葡聚糖浓度愈高，粘度越大。

[0006] 高浓度β-葡聚糖会形成网状结构，吸收其周围的水分子，从而降低了周围环境的物理特性。β-葡聚糖是表层带负电荷的表面活性物质，在溶液中极易与带相反电荷的养2+ 2+ +
分物质结合，从而影响养分的吸收。此外，β-葡聚糖还能吸附Ca 、Zn 、Na 等金属离子以及有机质，造成这些物质的代谢受阻。

[0007] 研究表明：β-葡聚糖，尤其是水溶性β-葡聚糖具有很强的抗营养作用，即使饲料中含有少量的β-葡聚糖，也能对畜禽（主要是单胃动物）的营养吸收具有很强的阻碍作用，其结果可造成畜禽营养性下痢，动物生长和饲料利用率降低，蛋鸡采食量、蛋重和产蛋率下降。由于畜禽均不能分泌β-葡聚糖酶，因此对这类物质的转化需要添加外源酶制剂。

[0008] β-葡聚糖的抗营养作用主要表现在以下几个方面：

[0009] （1）增大动物胃肠道食糜粘性

[0010] 麦类饲料中含有的葡聚糖类物质能结合大量水分，增加了消化道内容物的粘稠度。高粘度的肠道食糜对畜禽动物的料重比和增重有十分明显的负面影响。因为葡聚糖类物质可使肠内容物呈浓稠的胶冻样，因此减缓了肠内食糜通过消化道的速度，从而降低了畜禽的采食量。另外，高粘度会使畜禽的饮水量增加，粪便水分含量随之提高，从而养分排出量也增加，这就意味着养分消耗增加。β-葡聚糖导致消化道内容物粘度增加，降低了葡萄糖、脂肪、水和氨基酸等营养物质在肠道中的吸收，引起腹泻，生产性能明显降低。

[0011] （2）营养屏障作用

[0012] 粘稠的胶状β-葡聚糖类物质可将肠道中的食糜如网状包裹起来，阻碍了内源消化酶与营养物质的接触，起营养屏障作用。

[0013] 另外，β-葡聚糖的存在还会抑制胆酸的分泌，影响了脂肪代谢的顺利进行。

[0014] 通过添加外源性β-葡聚糖酶，可将胶质状的β-葡聚糖水解为小分子物质，食糜的粘性则大大降低，内源性消化酶可充分与食糜混合，提高了淀粉、蛋白质、脂肪等营养物质有吸收。

[0015] （3）促进肠道内有害菌的增殖，损害肠道粘膜正常形态

[0016] 养分的消化吸收不良可导致营养物质在肠道内蓄积，富含养分的食糜是细菌，特别是致病菌的良好培养基，并且食糜通过消化道的速率降低，会大大减少了菌群的移动，使细菌尤其是厌氧微生物得以在肠道上大量定居下来，从而改变了肠道内的微生物区系。并且大量有害细菌的增殖会消耗许多营养物质，从而降低营养物质的利用率。

[0017] 此外，肠内细菌数量增多会刺激肠壁，并使之增厚，同时损伤肠壁，进一步降低肠道对养分的吸收。某些细菌还可能产生毒素，影响宿主健康。

[0018] 通过外源添加β-葡聚糖酶是一种有效途径，但由于饲料制粒需要经受高温，要求所使用的β-葡聚糖酶不仅作用效果显著，还需具有耐高温的特点。

[0019] β-葡聚糖酶作为一种饲料用酶，其作用机理主要包括如下几个方面：

[0020] （1）β-葡聚糖酶可以降解饲料原料中的β-葡聚糖，消除β-葡聚糖的抗营养作用，提高饲料的消化利用率。

[0021] （2）β-葡聚糖酶可改善动物消化道的生态环境和功能。β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖后，粘性大大降低，食糜的排空速度提高，减少了肠道内发酵，尤其是厌氧微生物发酵的可能性，从而降低了动物肠道疾病的发生。有研究表明，在大麦日粮中添加以β-葡聚糖酶可显著降低断奶仔猪的腹泻率。另外，消外道黏度的降低也有利于水、蛋白质、脂类、电解质的内源分泌，使消化道的功能得到改善。

[0022] （3）提高动物内源酶的分泌及活性。研究表明，添加β-葡聚糖酶可显著提高畜禽肠道内容物中的胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等内源酶的分泌及活性。β-葡聚糖酶可使饲料营养物质的消化转移至肠道进行，从而提高内源酶的活性，降低胆汁盐的早期分离，可更好地促进动物对养分的消化吸收，显著提高大麦等农副产品的消化利用率。在β-葡聚糖酶对仔猪消化机能的影响实验中，仔猪十二指肠内溶物总蛋白水解酶和淀粉酶的活性分别提高了20.96%(P<0.01)和5.66%（P<0.05）。

[0023] （4）促进动物生长，提高机体免疫功能。添加β-葡聚糖酶于大麦、小麦等日粮中，可明显改善动物神经内分泌状况。研究表明，麦类等高水平SNSP基础日粮中添加以β-葡聚糖酶为主的NSP酶制后，除了加强营养成分的消化吸收外，还能影响神经内分泌调节，从而影响代谢，促进生长。

[0024] 啤酒作为一种大众化的酒精饮料，素有“液体面包”之称，其消费量呈逐年上升趋势。在啤酒生产时需要用到大麦，通常大麦中β-葡聚糖含量高达4%-8%，由于大麦β-葡聚糖链分子发生扭结，分子间结合不紧密，且溶解后黏度高，糖化时使麦汁黏度增高，β-葡聚糖易被高分子蛋白质吸附，造成麦糟“板结”，从而导致麦汁和啤酒过滤困难，降低麦汁得率；另外，大麦β-葡聚糖不能被酵母利用或分解，易引起啤酒混浊和凝胶沉淀，影响啤酒的稳定性，降低啤酒的品质和经济效益。

[0025] 据统计，2010年中国啤酒产量达到4300万吨，连续9年位居世界第一。但由于大麦中β-葡聚糖的影响，每年对啤酒行业造成的经济损失估计在20亿元左右，解决大麦中的β-葡聚糖问题一直是该行业的一个重大课题。

[0026] 最近的研究及应用情况表明，采用β-葡聚糖酶可有效地去除啤酒糖化过程大麦中的β-葡聚糖。

[0027] β-葡聚糖酶属于水解酶类，对水解谷物中的β-葡聚糖具有重要作用。其应用于啤酒生产中，可以分解大麦及麦芽中的β-葡聚糖凝胶，降低胶状深沉物，发送啤酒的混浊度，提高产品质量。近年来，利用β-葡聚糖酶分解β-葡聚糖提高发酵菌种的糖化力，减少麦芽汁中β-葡聚糖的残留量，改善啤酒质量，取得了良好效果。

[0028] 目前，β-葡聚糖酶广泛应用于啤酒发酵工业，美国、日本、丹麦、德国、澳大利亚、加拿大等国均已采用β-葡聚糖酶作为啤酒工业的主要酶制剂。我国每年啤酒产量达4300多万吨，且仍量上升趋势，但在啤酒酿造过程中，大麦胚乳细胞中的β-葡聚糖不能充分降解，β-葡聚糖的残留是造成啤酒酒体混浊、泡沫持久力减少和挂杯力不强的主要原因之一。

[0029] β-葡聚糖酶作为啤酒用酶，其主要作用机理如下：

[0030] （1）降解大麦胚乳细胞中的β-葡聚糖，增加可发酵产物，提高糖化生产效率。β-葡聚糖酶可专一性地分解粘度很高的各种大麦β-葡聚糖，能够疏松大麦胚乳细胞壁，促进细胞内容物的外溢，从而提高了原料的利用率。

[0031] （2）降低麦汁粘度，改善过滤性能，提高过滤速度，改善麦汁清亮度。

[0032] （3）提高啤酒的胶体稳定性，清除因β-葡聚糖引起的冷混浊。

[0033] 另外，β-葡聚糖酶还可用于制糖工业、环保及资源处理等方面，具有良好的应用前景。

[0034] β-葡聚糖酶主要来源于微生物，产生β-葡聚糖酶的微生物主要包括细菌（芽孢杆菌）、真菌（曲霉、毛霉、木霉等）和瘤胃微生物等。

[0035] 由于饲料制粒、啤酒酿造过程中通常均需高温处理，而普通β-葡聚糖酶耐热性能较差，因此开发出的β-葡聚糖酶应具有耐高温性能，才能广泛地作为饲料用酶、啤酒酿造用酶等使用。

[0036] 本发明提供了一种耐高温β-葡聚糖酶，其耐热性能良好，并在毕赤酵母这一真核系统中高效表达，具有重要的工业应用价值。

发明内容

[0037] 本发明的目的是提供一种β-葡聚糖酶GLU。

[0038] 本发明的另一目的是提供编码上述β-葡聚糖酶的基因。

[0039] 本发明的另一目的是提供一种耐高温β-葡聚糖酶VGLU。

[0040] 本发明的另一目的是提供编码上述耐高温β-葡聚糖酶的基因。

[0041] 本发明的另一目的是提供包含上述β-葡聚糖酶或上述耐高温β-葡聚糖酶的重组载体。

[0042] 本发明的另一目的是提供包含上述β-葡聚糖酶基因GLU或上述耐高温β-葡聚糖酶基因VGLU的的重组菌株。

[0043] 本发明的另一目的是提供制备上述耐高温β-葡聚糖酶VGLU的方法。

[0044] 本发明的另一目的是提供上述β-葡聚糖酶GLU或耐高温β-葡聚糖酶VGLU的应用。

[0045] 本发明的一种生产上述β-葡聚糖酶GLU的黑曲霉AN070902（Aspergillus niger），于2010年10月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101），其保藏号为：CGMCC No.4235，其相关信息记载于申请号为CN201010566249.0的专利申请中，已于2011年4月6日公开。

[0046] 本发明提供了一种β-葡聚糖酶GLU，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

[0047]

[0048] 该酶蛋白由344个氨基酸组成，其理论pI/Mw：4.70/38025.29。

[0049] 本发明还提供了编码上述β-葡聚糖酶的基因GLU，该基因的序列如SEQ ID NO.2所示：

[0050]

[0051]

[0052] 经检测，该酶在pH 2.0～6.5的条件下酶活稳定，属于酸性葡聚糖酶，动物消化道全程的各种pH环境均不会显著降低酶活，同时蛋白酶体外水解实验表明本发明获得的β-葡聚糖酶具有良好的耐胃蛋白酶及胰蛋白酶消化能力。另外，在模拟啤酒酿造条件下，该酶也对麦芽中的β-葡聚糖具有良好的水解效果。但该酶具有一个缺点，即其耐高温性能稍差，75℃水浴中保存10min后，其酶活力损失达70%左右，因此，需对该酶进行相应的改造，以筛选获得耐高温性能的β-葡聚糖酶。

[0053] 本发明优选采用定点突变法和易错PCR对SEQ ID NO.1所示的黑曲霉（Aspergillus niger）来源的β-葡聚糖酶GLU进行改造，并经过高通量筛选的方法筛选得到耐高温β-葡聚糖酶VGLU。本发明的耐高温β-葡聚糖酶VGLU和原有黑曲霉生产的β-葡聚糖酶GLU相比，有4个氨基酸的差异，突变位点由+46G，+62N,+288T,+313D突变成+46C,+62C，+288C,+313C，整个蛋白质空间结构中增加了两个二硫键，突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

[0054]

[0055] 编码该氨基酸序列的基因如SEQ ID NO.4所示，命名为VGLU：

[0056]

[0057]

[0058] 经检测，该重组酶的热稳定性良好，在75℃水浴中放置1h酶活力仍能保持85%左右，在很大程度上能减少高温操作时引起的酶活丧失，并且该酶的其他性能及稳定性能也非常优良，因此该酶可广泛作为饲料用酶及啤酒酿造用酶使用，该酶的理论PI/Mw：4.74/38050.50。

[0059] 本发明还提供了包含上述β-葡聚糖酶基因GLU的重组载体，优选为pPICzαA-GLU；以及包含上述耐高温β-葡聚糖酶基因VGLU的重组载体，优选为pPICzαA-VGLU。将本发明的β-葡聚糖酶基因与耐高温β-葡聚糖酶基因分别插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的β-葡聚糖酶基因与耐高温β-葡聚糖酶基因分别插入到质粒pPICzαA上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，分别得到重组酵母表达质粒pPICzαA-GLU与pPICzαA-VGLU。

[0060] 本发明还提供了包含上述β-葡聚糖酶基因GLU或耐高温β-葡聚糖酶基因VGLU的重组菌株的重组菌株，优选为毕赤酵母重组菌株X33。

[0061] 本发明还提供了一种制备耐高温β-葡聚糖酶VGLU的方法，包括以下步骤：

[0062] 1）用上述重组载体pPICzαA-VGLU转化宿主细胞，得重组菌株；

[0063] 2）培养重组菌株，诱导耐高温β-葡聚糖酶VGLU的表达；以及

[0064] 3）回收并纯化所表达的耐高温β-葡聚糖酶VGLU。

[0065] 本发明还提供了上述β-葡聚糖酶GLU或耐高温β-葡聚糖酶VGLU的应用，优选其在饲料、啤酒酿造工业中的应用。本发明的耐高温β-葡聚糖酶的耐热性能良好，是一种优良的酸性β-葡聚糖酶，并且具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解能力，完全可达到饲料及啤酒酿造用酶的要求。本发明的耐高温β-葡聚糖酶通过高效表达后能够达到较高的发酵水平，在工业生产中可大大降低生产成本，使其在饲料、啤酒酿造等工业中显示出更大的应用潜力。

附图说明

[0066] 图1重组耐高温β-葡聚糖酶在50L罐中的发酵过程曲线。

[0067] 图2重组耐高温β-葡聚糖酶的最适反应温度。

[0068] 图3重组耐高温β-葡聚糖酶的最适反应pH值。

[0069] 图4重组耐高温β-葡聚糖酶的温度耐受性能（不同处理温度）。

[0070] 图5重组耐高温β-葡聚糖酶的温度耐受性能（不同处理时间）。

[0071] 图6重组耐高温β-葡聚糖酶的pH耐受性能。

[0072] 图7重组耐高温β-葡聚糖酶在胃蛋白酶，胰蛋白酶处理后剩余酶活。

[0073] 本发明的一种生产上述β-葡聚糖酶GLU的黑曲霉AN070902（Aspergillus niger），于2010年10月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101），其保藏号为：CGMCC No.4235，其相关信息记载于申请号为CN201010566249.0的专利中，该专利已公开于2011年4月6日。

具体实施方式

[0074] 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0075] 实验材料和试剂：

[0076] 1、菌株与载体

[0077] 大肠杆菌菌株Topl0、毕赤酵母X33、载体pPICzalphaA购自Invitrogen公司。

[0078] 2、酶与试剂盒

[0079] 逆转录酶SuperScriptTM III、RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司。质粒DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，PCR纯化试剂盒购自上海生工公司。限制性内切酶购自Fermentas公司。

[0080] 3、培养基

[0081] 基本盐培养基：磷酸氢二铵5%、磷酸二氢钾0.5%、七水硫酸镁1.5%、硫酸钾1.95%、硫酸钙0.1%、氢氧化钾0.1%、消泡剂0.03%。高压后每升加4.35毫升PTM1

[0082] PTM1（微量盐溶液）：硫酸铜0.6%、碘化钾0.018%、一水硫酸锰0.3%、二水钼酸钠0.02%、硼酸0.002%、六水氯化钴0.05%、氯化锌2%、七水硫酸铁6.5%、浓硫酸0.5%、生物素
0.02%

[0083] 实施例1、黑曲霉（Aspergillus niger）β-葡聚糖酶GLU基因的克隆

[0084] 运用RNA提取试剂盒，提取黑曲霉（Aspergillus niger）总RNA，按照逆转录酶TMSuperScript III Reverse Transcriptase操作说明合成第一链cDNA。以cDNA为模板，设计β-葡聚糖酶引物（GLU5EcoRI，GLU3NotI）进行PCR扩增，将PCR产物由EcoRI和NotI进行双酶切，然后与经过同样酶切的毕赤酵母表达载体pPICzalphaA相连接，连接产物转化大肠杆菌Topl0感受态细胞，经抗生素Zeocin筛选后,获得阳性克隆。提取阳性克隆的质粒。送样到上海英骏生物公司测序，测序结果表明，所获得克隆DNA插入片段含有β-葡聚糖酶基因完整的开放阅读框。该β-葡聚糖酶基因GLU，全长1035bp，编码344个氨基酸。

[0085] 扩增所用引物如下：

[0086] GLU 5EcoRI：

[0087] 5’CTGAGAATTCATGTCTAGACCATTCATTTTTCCCG3’

[0088] GLU 3NotI：

[0089] 5’AGAGCGGCCGCTTAGGTGGAAGATTGACCGTTGAAG3’

[0090] 实施例2、GLU的基因定点突变

[0091] 将克隆出的GLU基因，采用EcoRI和NotI进行双酶切，连接到经相同双酶切的载体pPICzαA上，获得重组表达载体pPICzαA-GLU，然后转化到BL21中，选择阳性克隆子采用IPTG诱导产酶。然后采用该酶在不同温度下（60-100℃）处理10min后检测剩余酶活，发现该酶在85℃下酶活损失达80%以上，这说明直接由GLU编码的β-葡聚糖酶耐高温性能较差。因此需对该基因进行优化改良。通过对β-葡聚糖酶进行蛋白结构自动建模分析（swissmodel），分析其二级结构和三级结构。在不破坏其二级结构与活性中心的前提下，对活性中心附近以及二级结构连接处进行氨基酸定点突变，增加二硫键，以增强β-葡聚糖酶蛋白的稳定性能及耐高温性能。共预测了4个待突变位点，分别为：+46G，+62N,+288T，+313D，然后针对性的设计了4对突变引物，目的基因突变位点统一为TGC，TGC左右各取15个碱基构成正向引物；反向引物与正向引物完全互补。

[0092] PCR产物经DpnI酶切处理后转化BL21感受态细胞，在LB-Amp平板筛选阳性突变重组克隆，并对筛选的阳性克隆子进行摇瓶培养，采用IPTG诱导，经对比测试，优化后的基因所编码的β-葡聚糖酶耐高温性能大大提高。经四次定点突变，获得了优化后的β-葡聚糖酶基因，命名为VGLU。

[0093] 实施例3、包含耐高温β-葡聚糖酶基因VGLU的毕赤酵母工程菌的构建

[0094] 优化后的耐高温β-葡聚糖酶基因VGLU，采用EcoRI和NotI进行双酶切，重新连接到经相同双酶切的载体pPICzαA上，获得重组表达载体pPICzαA-VGLU。然后采用SacI进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母X33，电转化后涂布于YPD（Zeo+）平板上进行筛选，得到毕赤酵母重组菌株。

[0095] 实施例4、耐高温β-葡聚糖酶重组菌株的高效表达

[0096] 将筛选获得的耐高温β-葡聚糖酶重组菌株pPICZaA-VGLU-X33-9进行高密度发酵培养。

[0097] 配制20L基本盐培养基，在50L自动控制发酵罐中灭菌后，冷却至常温备用。用氨水和磷酸调节发酵液的pH值至4.6，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于20%以上，发酵温度为30℃。整个发酵过程分3个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，将重组菌pPICZaA-VGLU-X33-9按照10%的接种量接种至发酵罐中，流加已灭菌的4L50%的葡萄糖，培养24-30小时，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上即表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在180-200小时之间。发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得酶液。

[0098] 在发酵过程中的不同时间点取样测定酶活，发酵过程中耐高温β-葡聚糖酶的表达情况如图1所示，发酵195h的发酵液酶活为16250U/mL。

[0099] 实施例5、重组耐高温β-葡聚糖酶的活性分析

[0100] 采用DNS法进行检测。

[0101] 1个酶活单位(U)定义为：在规定条件(pH 4.8，40℃)下，每分钟释放出具有相当于1μmol葡萄糖反应力的还原性碳水化合物所需的酶量（μmol／min）

[0102] 实施例6、重组耐高温β-葡聚糖酶的性质测定

[0103] 1、耐高温β-葡聚糖酶比活测定

[0104] 将上述发酵液中的耐高温β-葡聚糖酶通过离子交换柱（Q SepharoseTM Fast Flow IonExchanger）纯化，采用改良型Bradford试剂盒（上海Sangon公司）测定蛋白浓度，得出该耐高温β-葡聚糖酶比活为2031U/mg。

[0105] 2、耐高温β-葡聚糖酶的最适反应温度及pH测定

[0106] 最适反应温度：将酶液稀释适当倍数，在不同温度(25～80℃)下反应，测定耐高温β-葡聚糖酶的酶活。以最高酶活力为100%，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下的相对酶活。最适反应温度曲线见图2。

[0107] 最适反应pH：将稀释后的酶液，与不同pH(2.0～7.0)检测条件下，检测该耐高温β-葡聚糖酶的酶活力，并采用最高酶活为100%，其他检测结果与之相比，即得到不同pH检测条件下的相对酶活。最适反应pH曲线见图3。

[0108] 结果如图3和图4所示：该重组耐高温β-葡聚糖酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH为5.0。

[0109] 3、耐高温β-葡聚糖酶的耐热性能测定

[0110] （1）不同温度耐热性能：将酶液稀释适当倍数，在不同温度下处理10min后，以未处理的酶活力为对照测定耐高温β-葡聚糖酶的相对酶活，结果见图4。

[0111] （2）不同时间耐热性能：在75℃条件下，将适当稀释的酶液处理不同时间（10min-60min），以未处理的酶活为对照测定该耐高温β-葡聚糖酶的耐热性能，结果见图5。

[0112] 结果显示该耐高温β-葡聚糖酶的耐热性能良好，完全可达到饲料及啤酒酿造用酶的要求。

[0113] 4、耐高温β-葡聚糖酶pH稳定性测定

[0114] 将稀释后的酶液与不同pH的缓冲液混合，室温放置2h，以未处理的酶液为对照，测定耐高温β-葡聚糖酶的相对酶活，结果如图6所示。

[0115] 该β-葡聚糖酶的最适pH为5.0，并且在pH 3～6范围内相对酶活均可达到80%以上，为一种良好的酸性β-葡聚糖酶。

[0116] 5、耐高温β-葡聚糖酶对胃蛋白酶、胰蛋白酶消化耐受性测定

[0117] 取0.1mL耐高温β-葡聚糖酶液，分别加入0.5mL 0.1mg/mL胃蛋白酶（pH 2.0浓度80U/mL）和0.5mL 0.1mg/mL胰蛋白酶（pH 7.0浓度150U/mL），于37℃处理不同时间后测酶活。结果如图7所示。

[0118] 其中胃蛋白酶处理120min后，酶活性仍达92%左右，用胰蛋白酶处理120min后，剩余83%。这说明本β-葡聚糖酶具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解能力。

[0119] 6、金属离子和EDTA对酶活力的影响

[0120] 将含有1mM K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Co2+、Cu2+和EDTA的溶液与稀释适当倍数的酶液混合，室温放置30min，以未处理的酶液为对照，结果如表1所示。

[0121] 结果表明，Mg2+、Ca2+对该β-葡聚糖酶有一定的激活作用，酶活性分别促进11％、+ 2+ 3+ 2+ 2+ 3+25％；K、EDTA、Zn 对酶活性没有影响；其余金属离子Cr 、Cu 、Fe 和Fe 对酶活性均有不同程度的抑制作用；而SDS完全抑制了酶的活性。

[0122] 表1金属离子和EDTA对重组耐高温β-葡聚糖酶酶活力的影响

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