本发明公开了一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，包括如下步骤：首先提取颚口线虫DNA，同时进行棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫特异引物设计。然后，对设计的引物进行PCR反应条件的优化，确定最佳多重PCR模式。按照最佳多重PCR模式进行实验，验证各引物单一PCR特异性、多重PCR特异性、PCR敏感性和临床样本操作的可行性。此外，本发明还公开了用于同时检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的引物序列。通过各种验证表明本发明方法可以同时鉴定棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫，其快速、敏感、特异和同步鉴定3种颚口线虫的特点可应用于水产品颚口线虫的鉴定和检疫。
1.一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，所述方法不包括疾病诊断方法，其特征在于，具体步骤包括如下:①棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的虫体DNA提取；
②引物设计与筛选；所述的引物设计与筛选具体为：应用分子生物学软件对颚口属线虫种间的ITS2基因序列进行比对分析，选择碱基差异较大的区域，在该范围设计棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫特异性引物，筛选确定引物，确保所设计引物必须为特异性引物，一对引物只能扩增出相应虫种的序列片段，并且与其它引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构；所述设计的引物序列为：棘颚口线虫的特异性引物：
GS2-F：5’-GAGATGTCTAGCATCATCTCT-3’（SEQ ID NO.1）；
GS4-R：5’-ACTGTATCGGCGAAGCTG-3’（SEQ ID NO.2）；
GD2-F：5’-AGATTTTGTTGCTGTTCGTT-3’（SEQ ID NO.3）；
GD3-R：5’-TATATACGGCCGCAGCTC-3’（SEQ ID NO.4）；
GN1-F：5’-TCTACGACGACGAGAGGACT-3’（SEQ ID NO.5）；
GN5-R：5’-TGGAGTTGTCGATGTGTG-3’（SEQ ID NO.6）；
③对步骤②所设计的引物进行PCR反应条件优化，得到最佳多重PCR模式；
④按照步骤③的最佳PCR反应条件进行单一PCR扩增特异性验证；
⑤按照步骤③的最佳PCR反应条件进行多重PCR扩增特异性验证；
⑥按照步骤③的最佳PCR反应条件进行PCR敏感性验证；
⑦按照建立的多重PCR方法对临床虫种鉴定方法进行可行性验证。
2.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤①中，所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的虫体DNA提取方法为：从70%乙醇保存液中取出单个标准虫种，采用DNA提取试剂盒提取棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫基因组DNA，将提取的基因组DNA置-20℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤③中，所述的PCR反应条件优化具体方法为：选择25μL的PCR反应体
系，体系包含25mmol／L Mg 2.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol／L dNTP 1μL，
5U／μL Taq聚合酶0.1μL，DNA模板1μL，引物工作浓度为10μmo1/L，根据多重PCR条带的明亮，适当调整步骤②的引物加入量的比例；退火温度根据引物Tm值范围进行51℃、
53℃、55℃、57℃、59℃、61℃退火温度梯度试验，最后确定最佳的多重PCR模式。
4.根据权利要求1或3所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤③的最佳多重PCR模式具体为：最佳多重PCR反应体系：25μL反
应体系中10×buffer 2.5μL，25mmol／L Mg 2.5μL，2.5mmol／L dNTP 1μL，10μmo1/L杜氏颚口线虫与日本颚口线虫上下游引物各0.3μL，10μmo1/L棘颚口线虫上下游引物各0.4μL；5U／μL Taq聚合酶0.1μL，模板DNA各1μL，加灭菌双蒸水至25μL；最佳的多重PCR反应条件为：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
5.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤④中，所述的单一PCR扩增特异性验证具体方法为：用步骤②的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的单一引物，分别对棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫与欧猥裂头蚴的DNA模板，按照步骤③的最佳多重PCR模式，在同等条件下进行PCR反应，以鉴定其特异性。
6.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤⑤中，所述的多重PCR扩增特异性验证具体为：同时用步骤②的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫3对引物，分别对棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫及其不同组合、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫与欧猥裂头蚴的DNA模板，按照步骤③的最佳多重PCR模式，在同等条件下进行PCR反应，以鉴定其特异性。
7.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤⑥中，所述的PCR敏感性验证具体为：先将棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫3种标准虫种DNA用核酸蛋白测定仪测定模板原液浓度，再以10倍连续稀释分别将棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的DNA模板稀释成5个浓度梯度，按步骤③的最佳多重PCR模式进行PCR扩增，测定单一PCR和多重PCR反应的敏感性。
8.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤⑦中，所述的临床虫种鉴定方法进行可行性验证具体为：将各地检出的颚口线虫虫体，提取DNA模板，按步骤③建立的多重PCR方法进行扩增。
9.用于同时检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的引物，其特征在于，其序列为：棘颚口线虫的特异性引物：
GS2-F：5’-GAGATGTCTAGCATCATCTCT-3’（SEQ ID NO.1）；
GS4-R：5’-ACTGTATCGGCGAAGCTG-3’（SEQ ID NO.2）；
GD2-F：5’-AGATTTTGTTGCTGTTCGTT-3’（SEQ ID NO.3）；
GD3-R：5’-TATATACGGCCGCAGCTC-3’（SEQ ID NO.4）；
GN1-F：5’-TCTACGACGACGAGAGGACT-3’（SEQ ID NO.5）；
GN5-R：5’-TGGAGTTGTCGATGTGTG-3’（SEQ ID NO.6）。
棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测
方法及检测用引物
技术领域
[0001] 本发明涉及农业和动物检疫技术领域，具体涉及一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的检测方法，具体涉及一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法。此外，本发明还涉及用于同时检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的引物。
背景技术
[0002] 颚口线虫病是因人食入生的或未熟的含有颚口属(Gnathostoma)幼虫的淡水鱼引起的人畜共患寄生虫病。颚口线虫属有13个有效种，目前已报道的致病种有棘颚口线虫(G.spinigerum)、刚刺颚口线虫(G.hispidum)、杜氏颚口线虫(G.doloresi)、日本颚口线虫(G.nipponicum)、马来颚口线虫(G.malaysiae)和双核颚口线虫(G.binucleatum)，因此，对食品中检出的颚口线虫幼虫虫种的鉴别对该病的诊断与防治有重要意义。颚口线虫种类的鉴定，传统方法是以形态特征为鉴别指标，但颚口线虫的生活史复杂，不同发育阶段形态变化较大，有些虫种的第三期幼虫形态相似，传统形态方法很难鉴别，因而不能作为虫种鉴别的精确指标，且传统方法也费时费力。
[0003] PCR技术具有简便、快速、灵敏的优点，目前，该技术已逐渐应用于寄生虫种类的鉴别，研究的目的基因多以核糖体DNA(rDNA)为主。真核生物rDNA的内转录间隔区(internal transcribed spacerregion，ITS)包括ITS-1和ITS-2，进化较快，具有种间特异性和种内保守性，是进行种间分类的极好材料，可设计特异性的引物进行扩增，并比较ITS序列的差异来鉴定形态学上难以区别的近缘种。将ITS序列用多重PCR方法来鉴别颚口线虫虫种，目前国内尚无相关报道。棘颚口线虫、杜氏颚口线虫、日本颚口线虫是亚洲最常见的3种颚口线虫致病种，本发明根据ITS-2序列，分别设计这3种颚口线虫的特异引物，进行多重PCR扩增，旨在建立一种快速、灵敏、可靠的鉴别颚口线虫种类的方法。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题在于提供一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其不需要繁杂的形态鉴定与测序步骤，就可以同时鉴别棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫三种颚口线虫。旨在解决颚口线虫鉴定时耗时、成本高、工作量大等问题，也为进一步同时鉴定所有13个颚口线虫虫种奠定了基础。该方法的建立可满足进出口水产品检疫、快速、准确的要求，同时，为我国人畜共患寄生虫病的研究与食品安全防控上提供一种新的适用方法。为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006] 在本发明的一方面，提供一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，具体步骤包括：
[0007] 1虫体DNA提取
[0008] 2引物设计与筛选
[0009] 3PCR反应条件优化
[0010] 4单一PCR扩增特异性验证
[0011] 5多重PCR扩增特异性验证
[0012] 6PCR敏感性验证
[0013] 7临床虫种鉴定方法的可行性验证
[0014] 步骤1中，所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫DNA提取方法为：从70％乙醇保存液中取出单个标准虫种(3株标准虫种已经过形态学和分子生物学鉴定)，置于1.5mLEppendorf管中，按照QIAGEN公司DNA提取试剂盒(DNeasy Blood&Tissue kit)使用说明书提取颚口线虫基因组DNA，将提取的基因组DNA置-20℃保存备用。
[0015] 步骤2中，所述的颚口线虫引物设计与筛选具体为：应用DNAstar7.1与Primer5.0等分子生物学软件对颚口属线虫种间的ITS2基因序列进行比对分析，选择碱基差异较大的区域，在该范围设计棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫特异性引物。筛选确定最终实验所用的引物，确保所设计引物能特异扩增出对应虫种的目标产物，并且在实施多重PCR过程中，多对引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构等。最终所确定的引物序列见表1。
[0016] 表1多重PCR引物序列
[0017]
[0018]
[0019] 步骤3中，所述的PCR反应条件优化具体方法为：选择25μL的PCR反应体系，体系包含25mmol/L Mg2+2.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 1μL，5U/μLTaq聚合酶0.1μL，DNA模板1μL，引物工作浓度为10μmol/L，根据多重PCR条带的明亮，适当调整3对引物加入量的比例。退火温度根据引物Tm值范围进行51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃退火温度梯度试验。最后确定最佳的多重PCR模式。最终确定最佳的多重PCR反应体系为：25μL反应体系中10×buffer 2.5μL，Mg2+2.5μL(25mmol)，dNTP1μL(2.5mmol)，G.doloresi与G.nipponicum上下游引物各0.3μL(10μmol)，G.spinigerum上下游引物各0.4μL(10μmol)。Taq聚合酶0.1μL(5U/μL)，模板DNA各1μL，加灭菌双蒸水至
25μL。最佳的多重PCR反应条件为：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；
72℃5min。
[0020] 步骤4中，所述的单一PCR扩增特异性验证具体方法为：用G.spinigerum、G.doloresi 或G.nipponicum 的 单 一 引 物，分 别 对 G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫与欧猥裂头蚴的DNA模板，在同等条件下进行PCR反应，以鉴定其特异性。
[0021] 步骤5中，所述的多重PCR扩增特异性验证具体为：同时用3对引物，分别对G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum及其不同组合、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫与欧猥裂头蚴的DNA模板，在同等条件下进行PCR反应，以鉴定其特异性。
[0022] 步骤6中，所述的PCR敏感性验证具体为：先将3种标准虫种DNA用核酸蛋白测定仪测定模板原液浓度，再以10倍连续稀释分别将G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum3种颚口线虫的DNA模板稀释成5个浓度梯度，按以上条件进行PCR扩增，测定单一PCR和多重PCR反应的敏感性。
[0023] 步骤7中，所述的临床虫种的鉴定验证方法可行性具体为：将各地检出的颚口线虫虫体(均经过形态学和分子生物学鉴定)，提取DNA模板，按上述建立的多重PCR方法进行扩增。
[0024] 在本发明的另一方面，还提供用于同时检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的引物，其序列为：
[0025] 棘颚口线虫的特异性引物：
[0026] GS2-F：5’-GAGATGTCTAGCATCATCTCT-3’(SEQ ID NO.1)；
[0027] 6S4-R：5’-ACTGTATCGGCGAAGCTG-3’(SEQ ID NO.2)；
[0028] 杜氏颚口线虫的特异性引物：
[0029] GD2-F：5’-AGATTTTGTTGCTGTTCGTT-3’(SEQ ID NO.3)；
[0030] GD3-R：5’-TATATACGGCCGCAGCTC-3’(SEQ ID NO.4)；
[0031] 日本颚口线虫的特异性引物：
[0032] 6N1-F：5’-TCTACGACGACGAGAGGACT-3’(SEQ ID NO.5)；
[0033] GN5-R：5’-TGGAGTTGTCGATGTGTG-3’(SEQ ID NO.6)。
[0034] 上述3种颚口线虫多重PCR检测方法具有如下优点：
[0035] 1.简单、直观：本发明设计的3对引物，GC含量相近，Tm值相近，这就保证了在相同的退火温度下，G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum都能得到很好的扩增。其扩增片段分别为282bp、183bp、358bp，这使得在检测时能在同一个电泳胶上进行，通过观察PCR产物条带的位置就能判断虫种。
[0036] 2.特异性强：本发明建立的检测方法显示，无论是单一PCR还是多重PCR，均能特异性扩增出G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum条带；同时试剂用量少，所需成本较低，可节约成本，减少人力消耗。
[0037] 3.反应快速，耗时短：本发明方法耗时仅需3小时，反应快速、充分、需时短，节省了测序过程的时间。
[0038] 与现有技术相比，本发明可以同时鉴定3种颚口线虫(棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫)，并且可以根据需要进行灵活组合，联合检测，且操作简单，用时短(整个反应可以在3小时内完成)，传统的形态学鉴定方法与测序鉴定方法无法做到这点。利用该发明可以快速、廉价、准确地鉴定棘颚口线虫、杜氏颚口线虫、日本颚口线虫，其快速、敏感、特异和同步鉴定3种颚口线虫的特点可以应用于颚口线虫种的鉴定和水产品颚口线虫的检疫。
附图说明
[0039] 图1是本发明实施例中单一引物PCR扩增特异性验证的结果示意图；其中，图1A是G.spinigerum引物PCR的结果示意图，其中1-7分别以G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫、迭宫绦虫DNA为模板，8为空白对照；图1B是G.doloresi引物PCR的结果示意图，其中1-7分别以G.doloresi、G.spinigerum、G.nipponicum、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫、迭宫绦虫DNA为模板，8为空白对照；图1C是G.nipponicum引物PCR的结果示意图，其中1-7分别以G.nipponicum、G.spinigerum、G.doloresi、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫、迭宫绦虫DNA为模板，8为空白对照；M：
DL500Marker。
[0040] 图2是本发明实施例中多重PCR扩增特异性验证的结果示意图；其中，M：DL500Marker；1：G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum混合模板；2：G.spinigerum、G.doloresi混 合 模 板；3：G.spinigerum、G.nipponicum混 合 模 板；4：G.doloresi、G.nipponicum混合模板；5：G.spinigerum模板；6：G.doloresi模板；7：G.nipponicum模板；8-11分别为宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫、迭宫绦虫DNA模板；12为空白对照。
[0041] 图3是本发明实施例中PCR敏感性试验验证的结果示意图；图3A是G.doloresi单一PCR敏感性试验的结果示意图；图3B是G.nipponicum单一PCR敏感性试验的结果示意图；图3C是G.spinigerum单一PCR敏感性试验的结果示意图；图3D是混合模板多重PCR敏感性试验的结果示意图；其中，M：DL500Marker；1-6分别为100-10-5倍稀释的各DNA模板。
[0042] 图4是本发明实施例中多重PCR方法鉴定样品结果示意图；其中，M：DL500Marker；1-8为印度尼西亚分离株，9-10为菲律宾分离株，12-13为黑龙江分离株，11、
14为G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum阳性混合样品对照，15为空白对照。
具体实施方式
[0043] 下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如J.Sambrook等在《分子克隆实验指南》(科学出版社，1992)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0044] 实施例
[0045] 1.首先提取棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫DNA
[0046] DNA提取方法以QIAGEN公司的DNA抽提试剂盒(DNeasy Blood&Tissue kit)描述DNA提取方法：挑取单条三种已知虫体(这三株虫的来源：G.spinigerum(宜州株)、G.doloresi(福建株)由广西疫病预防控制中心张鸿满主任医师惠赠，G.nipponicum(广州株)由上海出入境检验检疫从泥鳅中分离并经形态学和分子生物学鉴定，70％乙醇中保存)放入灭菌离心管，加入灭菌蒸馏水，重复洗涤3次，洗涤完毕后弃掉离心管中蒸馏水，用碾磨棒将离心管中虫体碾碎，加入180μl Buffer ATL，20μL蛋白酶K，混匀后于56℃孵育1h～3h至消化完全，期间不时震荡摇晃。消化完全后，漩涡震荡15s，加200μL Buffer AL，立即漩涡震荡混匀，再加入200μL乙醇(96％～100％)，漩涡震荡混匀。离心柱置于收集管上，将上一步的混合物吸入离心柱中，8000r/min离心1min，弃收集管。将离心柱置于新的收集管中，加500μL Buffer AW1，8000r/min离心1min，弃收集管。将离心柱置于新的收集管中，加500μL Buffer AW2，14000r/min离心3min，弃收集管。将离心柱置于一灭菌的1.5mL离心管中，加入200μL Buffer AE室温孵育1min，8000r/min离心1min，离心所得DNA于-20℃冰箱保存备用。(重复该步骤可扩大DNA回收率)
[0047] 2.引物设计与筛选
[0048] 应用DNAstar7.1与Primer5.0等分子生物学软件对颚口属线虫种间的ITS2基因序列进行比对分析，选择碱基差异较大的区域，在该范围设计棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫特异性引物。筛选确定最终实验所用的引物，确保所设计引物能特异扩增出对应虫种的目标产物，并且在实施多重PCR过程中，多对引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构等。最终所确定的引物序列见表1。
[0049] 表1多重PCR引物序列
[0050]
[0051]
[0052] 3.PCR反应体系与条件
[0053] 本发明所使用的PCR试剂为TAKARA公司生产。PCR反应条件优化具体方法为：2+
选择25μL的PCR反应体系，体系包含25mmol/L Mg 2.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，
2.5mmol/L dNTP 1μL，5U/μL Taq聚合酶0.1μL，DNA模板1μL，引物工作浓度为
10μmol/L，根据多重PCR条带的明亮，适当调整3对引物加入量的比例。退火温度根据引物Tm值范围进行51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃退火温度梯度试验。最后确定最佳的多重PCR模式。最终确定最佳的多重PCR反应体系为：25μL反应体系中10×buffer 2.5μL，
2+
Mg 2.5μL(25mmol)，dNTP 1μL(2.5mmol)，G.doloresi与G.nipponicum上下游引物(见表1)各0.3μL(10μmol)，G.spinigerum上下游引物(见表1)各0.4μL(10μmol)。Taq聚合酶0.1μL(5U/μL)，模板DNA各1μL，加灭菌双蒸水至25μL。最佳的多重PCR反应条件为：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
[0054] 4.单一PCR扩增特异性验证
[0055] 用G.spinigerum、G.doloresi或G.nipponicum的单一引物(见表1)，分别对G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫与欧猥裂头蚴的DNA模板，按照以上PCR反应体系与条件，在同等条件下进行PCR反应。单一PCR扩增后，产物经3.0％琼脂糖凝胶电泳检测，可见G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum分别扩增出1条282bp、183bp、358bp的条带，与各自的预期目的条带相符；3种引物对宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫与欧猥裂头蚴均未扩增出任何条带(见图1)。G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum单一PCR特异性扩增产物经测序分析后，结果显示与该3种颚口线虫的ITS2目的基因序列相吻合。可见，单一PCR的特异性验证试验证实了这3对引物有很强的特异性，可以分别检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫。
[0056] 5.多重PCR扩增特异性验证
[0057] 同时用3对引物(见表1)，分别对G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum及其不同组合、宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫与欧猥裂头蚴的DNA模板，按照以上PCR反应体系与条件，在同等条件下进行PCR反应。同时用3对引物分别对G.spinigerum、G.doloresi、G.nipponicum的DNA模板进行PCR扩增，均扩增出1条预期目的条带；对G.spinigerum与G.doloresi、G.spinigerum与G.nipponicum和G.doloresi与G.nipponicum 3种不同组合的DNA模板进行PCR扩增，分别扩增出2条预期目的条带，而对宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫以及欧猥裂头蚴DNA均未扩增出相应条带；对G.spinigerum、G.doloresi和G.nipponicum 3种颚口线虫的混合DNA模板，扩增出3条预期大小的目的条带(见图2)。可见，多重PCR的特异性验证试验证实了这3对引物有很强的特异性，可以同时检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫。
[0058] 6.敏感性试验验证
[0059] 经核酸蛋白测定仪测定G.doloresi、G.nipponicum、G.spinigerum DNA模板原浓度分别为133ng/μL、125ng/μL、204ng/μL。将DNA模板按10-1～10-5倍连续稀释成5个浓度梯度，按以上PCR反应体系与条件进行PCR扩增，单一PCR对G.doloresi、G.nipponicum和G.spinigerum的最小检出量分别为0.01ng/μL、0.01ng/μL、0.2ng/μL。混合模板多重PCR最小检出量与单一PCR相同(见图3)。可见，PCR敏感性试验验证了这
3对引物对模板浓度的敏感性较高，远远超过对1条颚口线虫所提DNA浓度的实验要求。
[0060] 7.临床虫种的鉴定验证方法的可行性
[0061] 对2010年～2011年分离自菲律宾、印度尼西亚进口黄鳝与黑龙江泥鳅的颚口线虫分离株，按照建立的多重PCR方法进行鉴定。2株菲律宾、8株印度尼西亚颚口线虫分离株的DNA模板进行扩增，电泳条带与G.spinigerum阳性对照的条带位置一致，为282bp；对2株黑龙江颚口线虫分离株的DNA模板进行扩增，电泳条带与G.nipponicum阳性对照条带位置一致，为358bp(见图4)。可见，多重PCR鉴定结果与原样品形态鉴定和分子鉴定结果完全相符，证明该多重PCR方法进行临床样本的鉴定时，验证了该方法的可行性。
[0062] 在图4中，8株印度尼西亚颚口线虫(图4中1-8)：上海出入境检验检疫局自印度尼西亚进口黄鳝中分离出，并且经过形态学和分子生物学测序鉴定为棘颚口线虫。2株菲律宾(图4中9-10)：上海出入境检验检疫局从菲律宾进口黄鳝中分离出，并且经过形态学和分子生物学测序鉴定为棘颚口线虫。2株黑龙江颚口线虫(图4中12-13)：上海出入境检验检疫局委托黑龙江出入境检验检疫局购自黑龙江农贸市场的泥鳅中分离出，并且经过形态学和分子生物学测序鉴定为日本颚口线虫。
