用于治疗和/或预防皮肤病的组合物

摘要

以提供治疗和/或预防皮肤病的组合物为目的，发明人进行了认真研究，结果发现山竹果皮提取物具有抑制皮肤病的效果。本发明提供由山竹果皮提取物形成的用于治疗和/或预防皮肤病的组合物。

权利要求

1.用极性溶剂从山竹（Garcinia mangostana L.）果皮提取的提取物在制备治疗和/或预防由紫外线照射引起的皮肤病的组合物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述极性溶剂为乙醇或乙醇的水溶液。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，抑制因紫外线照射引起的皮肤的含水量的减少。

说明书

用于治疗和/或预防皮肤病的组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及由山竹果皮的提取物形成的用于治疗和/或预防皮肤病的组合物。

背景技术

[0002] 皮肤的皱纹、弹性的下降、水分保持能力下降等皮肤病会使患有皮肤病的患者看起来年老、有损外观，还会有产生痒和痛等不适的情况。因此，需要皮肤病的治疗或预防。

[0003] 皮肤病的原因虽然尚未完全弄清楚，但认为其大多是由活性氧引起的。活性氧是指氧具有化学活性而形成的化学物类(chemical species)，非常不稳定且显示出强氧化能力。作为活性氧，已知的有过氧化物阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢、单态氧等。另一方面，生物体中具备通过过氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等各种酶，还有维生素E、维生素C、β-胡萝卜素、尿酸等的作用将活性氧除去的抗氧化作用。然而，当产生的活性氧过多时，就会超过生物体具备的抗氧化作用。这种状态称为氧化应激状态，在氧化应激状态下，蛋白质、脂质、糖及核酸等会被氧化。

[0004] 在皮肤组织中，由于活性氧会引起表皮的角化细胞受到损伤、细胞外基质的代谢紊乱，其结果是由于角质厚度变得不均匀或角质层屏障机能降低而引起干燥，并进一步导致皱纹产生。此外，在真皮中，由于活性氧会使成纤维细胞受到损伤，而使得真皮胶原的量降低，促进胶原间形成交联，并使得真皮的柔软性和伸缩性降低。作为这样的机制的详细描述，可认为是如下所述。即，活性氧对表皮组织的细胞的受体及其配体产生影响，引起源于表皮角化细胞和真皮成纤维细胞的白介素1(IL-1：interleukin 1)和TNF-α(肿瘤坏死因子：tumor necrosis factor-α)等细胞因子的产生，此外，对转录因子产生影响，诱导AP-1(激活蛋白-1：activator protein-1)和NF-κβ的活化，并诱导增加基质金属蛋白酶(MMP：matrix metalloprotease)的产生。特别是MMPs的活化被认为是形成皱纹、促进老化的原因。

[0005] 作为在皮肤组织中诱导产生活性氧的代表，紫外线是已知的。紫外线是10～400nm的不可见光，根据对人和环境的影响的不同，分为UVA(315～400nm)、UVB(280～
315nm)和UVC(280nm以下)。通常人在日常生活中照射到的紫外线主要是太阳光。太阳光中含有UVA、UVB和UVC的波长的紫外线。其中，UVC被臭氧层吸收，几乎不会到达地表，但UVA和UVB的一部分会到达地表，给皮肤带来各种各样的变化。因暴露于紫外光下，皮肤组织中会产生过氧化氢、过氧化物阴离子、单态氧等。反复且长期暴露在紫外线下，会对皮肤的结构和机能产生不良影响。这种现象称为光老化。此外，已知因紫外线照射引起的炎症，即晒伤(sun burn)，在皮肤组织中进一步诱导了活性氧的产生。关于紫外线暴露对真皮的影响，还可以确认其一部分受通过表皮得到控制。

[0006] 山竹是以马来半岛附近为原产地，为金丝桃科(Guttiferae)藤黄属常绿乔木，分布遍及泰国、印度、斯里兰卡、马来西亚等，被作为果树栽培。不仅如此，山竹自古就在东南亚地区被作为天然药物使用，已知具有抗炎症作用和抗菌效果，被作为退烧药、传染病治疗药物，并且山竹还被用于皮肤的炎症和损伤的治疗。

[0007] 关于山竹的抗氧化作用有如下的报道。已知在山竹果皮提取物中含有多种有效成分，以具有非常强的抗氧化作用的氧杂蒽酮为代表，还含有丰富的儿茶素、多酚、多糖、矿物质、维生素等。其中，对多酚之一的氧杂蒽酮研究不断深入，并报道了多种氧杂蒽酮类化合物(《农业与食物化学杂志》，第54卷，第2077页～2082页，2006年出版(Journal of Agricultural and food chemistry 54：2077-2082，2006))。作为山竹果皮中含有的特有的氧杂蒽酮，具代表性的化合物有α-倒捻子素(α-mangostin)和γ-倒捻子素(γ-mangostin)，这些化合物显示具有抑制脂质氧化的作用。特别是γ-倒捻子素，被发现具有比α-生育酚和BHA更强的抑制氧化的作用和与α-生育酚同等的除去自由基的作用(《药学杂志》，第114卷，第2期，第129页～133页，1994年出版(YAKUGAKU ZASSI 114(2)：129-133，1994))。另一方面，还已知α-倒捻子素和γ-倒捻子素具有抗组胺效果或者抗血清素效果(日本专利第3968405号公报)

[0008] 另一方面，关于山竹对皮肤、肌肤的改善和治疗等还有如下报道。日本专利特开2007-31287号公报公开了含有露兜树(日语：パンダヌス)果实成分的化妆品，其中掺入了山竹提取物。日本专利特开2002-47125号公报公开了含有基质金属蛋白酶抑制剂的皮脂分泌抑制剂，并揭示山竹提取物含有该抑制剂。此外，日本专利特开平9-87155号公报公开了以山竹为有效成分的紫外线吸收剂。此外，日本专利申请特愿2008-134246号报道了通过口服摄入山竹提取物以治疗、预防特异性皮炎。可是，该报道仅将对象限定于特异性皮炎。即，在这些报道中都没有揭示山竹提取物不含有其他有效成分而被用作治疗和/或预防皮肤病的组合物。

[0009] 此外，对山竹果皮的提取物进行了各种安全性试验。日本专利特开平5-17365号公报的[0015]段中用小鼠进行了采用口服给药的急性毒性试验，结果显示，即使给予10g/Kg的山竹果皮提取物，也未观察到死亡例。另外，在日本专利特开平4-244004号公报的[0047]段所示的安全性试验中，进行了将山竹果皮提取物涂布于人皮肤的刺激性试验，结果显示，刺激性极低，其安全性高。

[0010] 另一方面，作为除山竹以外的可降低或者除去活性氧的作用的成分，已知有例如绿茶多酚和葡萄种子中的原花色素。2004年出版的《调查皮肤生理病理学杂志》第122卷的第1480页～1487页(Journal of investigative Dermatology 122：1480-1487，2004)中报道了绿茶多酚在无毛小鼠皮肤试验中具有抑制由UV引起的氧化损伤和MMP表达的效果。2007年出版的《分子癌症疗法》第6卷第3期的第995页～1005页(Molecular Cancer Therapeutics6(3)：995-1005，2007)中报道了葡萄种子中的原花色素可以抑制因UVB产生的氧化过激，并抑制MAPK和NF-κβ的活化。

[0011] 发明的揭示

[0012] 在上述的文献中都没有揭示山竹提取物具有治疗和/或预防皮肤病的效果。本发明的目的在于提供由用极性溶剂从山竹(Garcinia mangostana L.)果皮提取的提取物形成的用于治疗和/或预防皮肤病的组合物。

[0013] 本申请的发明人以提供由用极性溶剂从山竹果皮提取的提取物形成的用于治疗和/或预防皮肤病的组合物为目的，进行了认真研究，发现用极性溶剂从山竹的果皮提取的提取物可以治疗和/或预防皮肤病，从而完成了本发明。

[0014] 即，本发明提供由用极性溶剂从山竹的果皮提取的提取物形成的用于治疗和/或预防皮肤病的组合物。

[0015] 本发明提供所述用于治疗和/或预防上述皮肤病的组合物，所述皮肤病由活性氧引起。

[0016] 本发明提供所述用于治疗和/或预防皮肤病的组合物，所述皮肤病由紫外线照射引起。

[0017] 另外，本发明还提供含有所述用于治疗和/或预防皮肤病的组合物的食品。

[0018] 本发明中山竹的果皮可使用从山竹果实(新鲜或干燥物)得到的果皮。山竹的果皮可直接使用，但如果考虑到提高提取率，则较好是在粉碎或制成粉末后进行提取。此外，也可在提取前用非极性溶剂将山竹果皮脱脂。

[0019] 本发明的提取中使用选自作为极性溶剂的甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯和水的至少1种极性溶剂来实施提取。也可将2种以上的溶剂组合起来实施提取。另外，如果考虑到用作口服剂或饮食品的情况，则作为提取溶剂，从安全性的角度来看优选使用乙醇、或者水和乙醇的组合。提取的温度无特别限定，从提取效率的角度来看，较好在室温到溶剂的沸点温度的范围内。提取时间根据溶剂的种类、果皮的状态(新鲜或干燥物、粉碎物或粉末等)和提取温度而变化，较好在0.5～24小时的范围内。

[0020] 提取物也可以根据需要用蒸发器等将提取溶剂浓缩或除去。此外，提取物也可根据需要通过溶剂分提或色谱法进行纯化后使用。

[0021] 本说明书中“皮肤”与“肌肤”的意义相同，是动物身体的表面层，由表皮、真皮、皮下组织形成。本说明书中，“皮肤病”是指具有皮肤炎症、水分减少、柔性降低、产生皱纹中的至少1种的状态。

[0022] 本说明书中“活性氧”是指氧具有化学活性而形成的化学物类，非常不稳定且显示出强氧化能力，作为例子可例举过氧化物阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢、单态氧、一氧化氮、二氧化氮、臭氧、过氧化脂质。

[0023] 本说明书中的“紫外线”是波长为10～400nm的光线。

[0024] 本发明的用于治疗和/或预防皮肤病的组合物的给药方法没有限定，较好是口服摄入。因此，本发明的用于治疗和/或预防皮肤病的组合物可以添加到清凉饮料、点心、冷饮、乳制品、酒类和肉类等食品中。

[0025] 作为用于治疗和/或预防皮肤病的组合物的山竹果皮提取物的给药剂量随给药方法和必要的治疗而变化，不可一概而论，在口服摄入的情况下，提取物的给药剂量为动物每1kg体重60～250mg，人为0.3mg～300mg/kg体重/天，更好为0.5mg～200mg/kg体重/天。

[0026] 本发明的用于治疗和/或预防皮肤病的组合物，可规定处方量而使得以作为食品的1天的常规摄入量可满足上述的有效量。1天的剂量也可分数次摄入。

[0027] 根据本发明，提供了由山竹果皮的提取物形成的用于治疗和/或预防皮肤病的组合物。

[0028] 山竹被称为“果后”，其果实可供食用，知名度也高，是印象良好的原材料。因此，由山竹果皮的提取物形成的用于治疗和/或预防皮肤病的组合物，易于被消费者接受，可令人满意地作为添加到食品的组合物使用。另外，由于本发明是山竹中通常应当废弃的果皮的提取物，所以原料可以低价获得，在环境保护的观点来看也是较好的。

[0029] 此外，本发明的提取物是用极性溶剂从山竹中提取的，即使不进行进一步的纯化也可获得上述效果。

[0030] 附图的简单说明

[0031] 图1表示山竹果皮提取物的混饵给药实验的日程。

[0032] 图2表示UVB灯的光谱分布。

[0033] 图3是对Cutometer SEM 575的各种参数进行说明的图。

[0034] 图4表示体重。图4A是体重变化的曲线图，图4B是全部数据。

[0035] 图5表示食入量。图5A是食入量变化的曲线图，图5B是食入量数据。

[0036] 图6表示皮肤含水量。图6A表示含水量的经时变化和测定时的湿度，图6B表示第8周时的含水量。

[0037] 图7表示皮肤弹性。图7A表示分组时的皮肤弹性，图7B表示解剖时的皮肤弹性。

[0038] 图8表示背部皮肤的外观。图8A是对照(-)组中第3号无毛小鼠的外观，图8B是对照(+)组中第26号无毛小鼠的外观，图8C是0.15％(+)组中第36号无毛小鼠的外观。

[0039] 图9表示光老化模型的无毛小鼠的HE染色标本。(a)是对照(-)组中第9号无毛小鼠的标本，(b)是0.072％(-)组中第11号无毛小鼠的标本，(c)是对照(+)组中第25号无毛小鼠的标本，(d)是0.072％(+)组中第29号无毛小鼠的标本，(e)是0.15％(+)组中第41号无毛小鼠的标本，(f)是GlcN(+)组中第50号无毛小鼠的标本。

[0040] 图10表示由病理HE染色标本算出的表皮厚度。

[0041] 图11表示皮肤提取物的SDS-PAGE的结果。

[0042] 图12表示用于检测I型胶原的蛋白质印迹法的结果。图12A表示皮肤提取物的蛋白质印迹法的结果，图12B表示通过光密度分析法测定的条带强度。

[0043] 图13A表示通过醋酸纤维膜电泳进行的GAG鉴定，图13B表示通过光密度分析法测定的条带强度。

[0044] 图14表示通过TBA法测定的过氧化脂质的测定结果。

[0045] 图15表示皮肤提取物的SDS-PAGE的结果。

[0046] 图16A表示通过蛋白质印迹法得到的羰基蛋白质的检测结果，图16B表示通过光密度分析法测定的条带强度。

[0047] 图17表示血浆中过氧化脂质的测定结果。

[0048] 图18表示山竹果皮提取物的强制口服给药实验的日程。

[0049] 图19表示从皮肤组织中提取可溶性成分的提取步骤图。

[0050] 图20表示含水量。图20A是变化的曲线图，图20B是全部数据。

[0051] 图21A表示皮肤弹性。

[0052] 图21B表示R0：拉伸性。

[0053] 图21C表示R1：恢复至原来状态的力。

[0054] 图21D表示R2：整体的弹性。

[0055] 图21E表示R3。

[0056] 图21F表示R4。

[0057] 图21G表示R5。

[0058] 图21H表示R6。

[0059] 图21I表示R7。

[0060] 图21J表示R8。

[0061] 图22是用于说明皮肤组织标本的观察方法的图。(a)表示无UV照射的标本，(b)表示UV照射的标本。

[0062] 图23是背部皮肤HE染色病理的标本的照片。

[0063] 图24表示由HE染色标本算出的表皮厚度。

[0064] 图25表示用于检测I型胶原的SDS-PAGE及蛋白质印迹法的结果。图25A表示皮肤提取物的SDS-PAGE的结果，图25B表示蛋白质印迹法的结果，图25C表示通过光密度分析法测定的相对的条带强度。

[0065] 图26表示用于检测核心蛋白聚糖的SDS-PAGE及蛋白质印迹法的结果。图26A表示皮肤提取物的SDS-PAGE的结果，图26B表示蛋白质印迹法的结果，图26C表示通过光密度分析法测定的相对的条带强度。

[0066] 实施发明的最佳方式

[0067] 下面例举本发明的例子进行说明，但本发明的范围不限定于以下的例子。

[0068] 实施例1

[0069] 山竹果皮提取物的制备(引用PAM0712)

[0070] 山竹果皮提取物按照以下所述方法获得。即，将山竹的100g未干燥果皮粉碎，在1L的70％乙醇中于80℃搅拌提取1小时。将其过滤，用蒸发器将滤液减压干燥，得到27.4g提取物。

[0071] 实施例2

[0072] 通过掺入山竹果皮提取物的混饵的给药来确认皮肤病的改善效果

[0073] 实验材料及实验方法

[0074] 1.使用动物及饲育环境

[0075] 将54只6周龄的雄性Hos：HR-1系无毛小鼠预先饲育一周后，用于实验。使用以下所述的饲料，以自由摄入、自由饮水的条件在25℃的环境下进行饲育。此外，在进行皮肤含水量测定时用湿度计测定饲育室的湿度。实验全部是在东京农工大学动物实验委员会的许可(No.19-76)下进行。

[0076] 2.给药样品的制备方法

[0077] 给药饲料的制备委托东洋酵母株式会社(オリエンタル酵母株式会社)进行。使用了0.072％山竹果皮提取物混饵、0.15％山竹果皮提取物混饵，还使用0.24％葡糖胺混饵作为阳性对照，使用CRF-1饲料作为阴性对照。每1天的山竹果皮提取物摄入量的基准如下：0.072％组为120mg/kg体重，0.15％组为250mg/kg体重。

[0078] 3.饲育日程

[0079] 试验日程如图1所示。试验期间为8周，从2007年10月至12月实施。在预备饲育1周后，考虑到为了使得在皮肤含水量和粘弹性上没有偏差，将动物分成6组：无UV照射的CRF-1给药组(对照(-)组)、无UV照射的0.072％山竹果皮提取物混饵给药组(0.072％(-)组)、UV照射的CRF-1给药组(对照(+)组)、UV照射的0.072％山竹果皮提取物混饵给药组(0.072％(+)组)、UV照射的0.15％山竹果皮提取物混饵给药组(0.15％(+)组)、UV照射的0.24％葡糖胺(GlcN)混饵给药组(GlcN组)。分组后，对UV照射组每周进行3次UV照射。即，第1周进行1分钟的UV照射，第2周进行2分钟的UV照射，第3、4周进行3分钟的UV照射，从第4周至解剖完成时进行4分钟的UV照射。总照射量为1.35J。此外，每周进行2次含水量测定和食入量测定，每周进行1次体重测定。

[0080] 4.关于UV照射

[0081] 使用UVB灯GL20SE(三洋电气(SANKYO DENKI))，在照射强度为0.3mW/cm2的条件下进行UV照射。UVB灯的光谱分布如图2所示，放射波段为208nm～的光线，峰值波长为280nm。使用数字式紫外线强度计UV-340(亚苏旺(アズワン))调整照射强度。在照射时，将小鼠单独放在9cm×5cm×4cm的笼子内1个半小时，为了减小在各笼子内的照射强度的差异，每次照射都轮换笼子来进行。

[0082] 5.皮肤含水量的测定

[0083] 每周2次使用CORNEOMETER(注册商标)CM825(科瑞格+科扎卡电子有限公司(COURAGE+KHAZAKA electronic GMBH社)制)在UVB照射前将探针置于小鼠腰部进行测定。测定5次，以其平均值作为测定值。

[0084] 6.皮肤粘弹性的测定

[0085] 使用COTOMETER(注册商标)SEM575(科扎卡电子有限公司(KHAZAKA electronic GMBH社)制)，在分组时和解剖时进行测定。

[0086] 本机是通过光传感器以1/100mm为单位测定吸进探针吸引口的皮肤的高度的机械。通过测定，得到以下r0～r9的10个参数。在图3中示出各个值的定义。

[0087] r0＝e(a)：最初波形的振幅最大值(Uf)

[0088] r1＝e(a+b)：最初波形的振幅最小值，恢复到原来状态的能力(再变形能力)[0089] r2＝(e(a)-e(a+b))/e(a)：(Ua/Uf)

[0090] r3＝e((r×a)+((r-1)×b))：最大振幅和再变形能力的差(整体的弹性)[0091] r4＝e((a+b)×r)

[0092] r5＝(e(a)-e(a+0.1))/e(0.1)：不含粘性变形的皮肤整体的弹性(Ur/Ue)[0093] r6＝(e(a)-e(0.1))/e(0.1)：相对于弹性膨胀的粘性的比例(Uv/Ue)[0094] r7＝(e(a)-e(a+0.1)/e(0.1)：弹性的部分与整个波形(弹性100％)的比较值(Ur/Uf)

[0095] r8＝e(b)：表示负压解除后的复原力。

[0096] r9＝r3-r0：在指针点处的吸入的皮肤高度

[0097] 本试验中使用吸引口直径为2mm的探针，在300mbar的负压下吸引10秒后，迅速解除负压，立即在脱吸引时间10秒内进行测定。测定3次，以其平均值作为测定值。

[0098] 7.背部皮肤照片的拍摄

[0099] 为了观察小鼠背部皮肤的状态，用数码相机进行拍摄。在分组时和解剖前2次用异氟烷对小鼠实施气体麻醉后进行背部照片的拍摄。

[0100] 8.皮肤组织的采集法

[0101] 小鼠的解剖在饲育第57天实施，采血后进行皮肤组织的采集。使用8mm活体解剖穿孔器进行病理分析用的皮肤的采集后，采集背部全部的皮肤，并使用镰刀状解剖刀的背部将皮下组织除去。使用JFC-300型冷冻粉碎机(吉田制作所)将皮肤组织在液氮下冷冻粉碎，并保存于-80℃。

[0102] 9.组织学分析法

[0103] 将如上所述的采集的背部皮肤展平夹在滤纸中，并放入4cm的皿中，通过滴下数滴Mildform 10N(マイルドホルム10N)(和光纯药工业公司制)进行固定。然后，根据常规方法进行石蜡包埋、分割、切薄片，并实施HE染色，进行病理组织标本的制作。标本的制作委托株式会社札幌病理综合研究所(株式会社札幌病理総合研究所)进行。

[0104] 对这些标本进行全视野观察，并对各个体的代表部分(切片的中央附近、组织没有折皱的部分)实施照片拍摄。此外，使用HE标本对各标本的表皮厚度各测定10处，通过算出其平均值进行表皮厚度的测定。

[0105] 10.从皮肤组织提取蛋白质的方法

[0106] 用甲醇对皮肤冷冻粉碎物进行24小时脱脂后，适量加入含有蛋白酶抑制剂的PBS(-)，用旋转器搅拌并清洗2次，除去血清成分等。然后，添加皮肤组织湿重的10倍量的提取缓冲液(4M盐酸胍(GuHCl)/50mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)/0.1M氯化钠(NaCl)/5mM苄脒盐酸盐/10mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)/0.1M氨基己酸(アミノヘキサン酸)(pH7.4))，在4℃下振荡72小时进行提取。然后，在转速4000rpm下离心分离30分钟，对于上清液用RO水进行透析，透析完成后进行冷冻干燥。该试样用于胶原的检测。

[0107] 此外，加入相对于皮肤湿重的2倍量的另一蛋白质提取液(50mMTris-HCl/1％Trion X-100/75mM NaCl/10mM EDTA-2Na/5mM苄脒盐酸盐/0.1M氨基己酸)，进行提取。提取后，转速4000rpm下离心分离30分钟，将上清液过滤，供于羰基蛋白质的检测。

[0108] 11.通过SDS-PAGE及蛋白质印迹法的测定

[0109] SDS-PAGE按照Laemmli等的方法进行。基于Bradford法对冷冻干燥物进行蛋白质定量，使各样品的蛋白质浓度一致。在100℃下加热5分钟后，急冷，制备用于电泳的样品。电泳后，进行CBB染色。在检测胶原时使用6％丙烯酰胺凝胶进行电泳，在检测核心蛋白聚糖(实施例3)时使用7.5％丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳完成后，将凝胶和PVDF膜在印迹用缓冲液(25mMTris-HCl/190mM甘氨酸(Glycine)/0.04％十二烷基硫酸钠(SDS)/20％甲醇(Methanol))中平衡30分钟。冰冷下使用湿式的印迹装置(Bio-Rad公司制)，以0.05A通电18小时，将凝胶中的蛋白质转移到膜上。转移后，在室温下将PVDF膜在封闭溶液中振荡1小时。检测胶原时的封闭溶液使用5％脱脂乳/Tris缓冲盐溶液-吐温(TBS-Tween)，检测核心蛋白聚糖时的封闭溶液使用在5％脱脂乳/TBS-Tween中添加0.01U/ml比例的软骨素酶ABC(生化学工业公司制)的溶液。然后，在第一抗体溶液(第一抗体：5％脱脂乳/TBS-Tween＝1∶1000)中于室温下振荡1小时。接着，用TBS-Tween将膜洗净4次，每次洗5分钟，在第二抗体溶液中同样于室温下振荡1小时，并进行洗净。检测抗原时，使用利用了HRP反应的化学显色法。作为化学反应试剂，使用ECL试剂盒(安法玛西亚生物技术公司(Amersham-Pharmacia Biotech社)制)，在富士医学X射线胶片(FUJI MEDICAL X RAY FILM)(富士胶卷公司制)上曝光后，将胶片显影。显影后的胶片，用画像分析软件Scion Image(世恩公司(Scion Corporation)制)比较条带强度。

[0110] 另外，检测胶原时使用抗I型胶原(由猪皮获得)兔抗血清作为第一抗体，HRP标记的抗兔IgG抗体作为第二抗体。另外，检测核心蛋白聚糖时使用抗核心蛋白聚糖的核心蛋白质兔抗血清作为第一抗体，HRP标记的抗兔IgG抗体作为第二抗体。

[0111] 12.从皮肤组织提取糖胺聚糖(GAG)的方法

[0112] 冷冻粉碎的皮肤用乙醇于4℃进行脱脂1晚后，相对于湿重，添加30倍量的0.5M NaOH，通过用旋转器旋转的同时在4℃下使反应进行20小时，引发β消去反应使GAG从蛋白质中游离出来。然后，加入添加的NaOH的一半量的1M HCl，进行中和反应。用pH试纸确认有没有中和完全。在这里，加入NaOH的1.5倍量的2×conc.的链霉蛋白酶(日语：アクチナ一ゼ)缓冲液，在100℃进行10分钟热变性。当溶液温度回到50℃时，加入1片百里酚作为防腐剂，以相对于最初添加的NaOH的量为1％(w/v)的量加入链霉蛋白酶。使用振荡机在50℃下进行2天的分解反应。这时，自反应开始24小时后再次添加与最初加入时同样量的链霉蛋白酶。反应完成后，以最终浓度为10％的量添加三氯乙酸，在4℃下放置1小时，从而除去蛋白质。然后，在0℃和9000g的条件下离心分离15分钟，使用DISMIC(注册商标)(先进科技东洋有限公司(アドバンテツク東洋(株)社)制)将上清液过滤，进行透析。将透析完成后的液体冷冻干燥，并将冷冻干燥物溶于Milli-Q水中，用于醋酸纤维膜电泳。

[0113] 13.通过醋酸纤维膜电泳进行的GAG分析法

[0114] 为了鉴定无毛小鼠皮肤中的糖胺聚糖的组成，醋酸纤维膜电泳按照Hata等的方法进行。通过上述方法制得的GAG用相对于100mg用于提取的皮肤湿重为50μl的Milli-Q水溶解来制备用于电泳的试样。将0.5μl的样品点到醋酸纤维膜上，使用0.1M吡啶/0.47M甲酸缓冲液以每1cm膜宽为1mA的固定电流进行电泳。作为标准物质，将溶解浓度为1mg/ml的透明质酸(HA)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸软骨素(CS)各50ml混合后使用。电泳完成后，用阿尔新蓝染色液(0.5％阿尔新蓝/25％乙醇/10％乙酸)进行染色，并用10％乙酸进行脱色。

[0115] 得到的染点(日语：スポツト)用画像分析软件Scion Image(世恩公司(Scion Corporation))进行分析。

[0116] 14.使用TBA法的皮肤过氧化脂质测定法

[0117] TBA法被用作综合测定由脂质过氧化生成的几乎所有的成分、脂质过氧化物、丙二醛及其他的醛、醛和蛋白质等的反应产物的方法，是通过对由硫代巴比妥酸(TBA)和从试样游离出的硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS)的反应而生成的红色色素进行定量来测定脂质的过氧化度的方法。

[0118] 皮肤过氧化脂质度的测定按照Ohkawa等的方法进行。首先，向皮肤冷冻粉碎物中以湿重15％(w/v)的量添加1.15％KCl水溶液，并进行搅拌。相对于50mg组织匀浆，依次加入100μl的8.1％SDS溶液、0.75ml乙酸缓冲液、25μl的0.8％BHT乙酸溶液(抗氧化剂)、0.75ml的0.8％TBA水溶液、350μl的5mM FeCl3，并充分搅拌，在5℃下保持60分钟后，在沸水浴中加热60分钟。冷却后加入0.5ml的Milli-Q水、2.5ml的丁醇-吡啶混合液(15∶1，v/v)并振荡混合，然后以3000rpm的转速进行20分钟离心分离。测定上清液在532nm的吸光度，并根据校正曲线算出TBARS的量。这时，校正曲线的标准物质使用1，1，3，
3-四乙氧基丙烷(生化学用：和光纯药工业公司)，添加同量的KCl水溶液替代皮肤冷冻粉碎物来制作空白。

[0119] 15.皮肤组织中氧化蛋白质的测定法

[0120] 氧化蛋白质之一的羰基蛋白质是氧化应激的标记物。使用OxyblotTM的蛋白质氧化检测试剂盒(Protein Oxidation Detection Kit)(CHEMICON(注册商标)公司制)进行羰基蛋白质的评定。具体方法如下所述。

[0121] 通过BCA法对各组样品进行蛋白质定量，并将蛋白质浓度统一为1.1mg/ml。相对于5μl的蛋白质试样添加5μl的12％SDS，在这里，通过添加10μl的2，4-二硝基苯腙(DNPH)并在室温下孵育15分钟，将DNPH引入羰基中。然后，添加7.5μl中和溶液使反应终止。使用10％硅胶将DNPH衍生的样品供于SDS-PAGE，将蛋白质分离，并使用印迹装置对PVDF膜实施印迹印染。将转移后的膜在常温下浸入封闭缓冲液(5％脱脂乳/TBS-Tween)中1小时进行封闭后，使其在常温下与第一抗体反应1小时。反应后用TBS-Tween洗净4次，每次5分钟，再使其在常温下与第二抗体反应1小时。反应后，再次进行洗净4次，每次5分钟。检测抗原时，使用利用了HRP反应的化学显色法。作为化学反应试剂，使用ECL试剂盒(安法玛西亚生物技术公司(Amersham-Pharmacia Biotech)制)，在富士医学X射线胶片(FUJI MEDICAL X RAY FILM)(富士胶卷公司制)上曝光后，将胶片显影。显影后的胶片，用画像分析软件Scion Image(世恩公司(Scion Corporation))比较条带强度。

[0122] 16.血浆中过氧化脂质(LPO)的测定

[0123] 委托日研塞尔株式会社(日研ザイル)进行测定。

[0124] 17.统计处理

[0125] 对于所有的参数，首先确认是否具备正态性、是否具同方差性后，当呈正态分布且是同方差的情况下进行图基-克雷默检验(Tukey-kramer test)，否则进行席夫F检验(Scheffe’s F test)。

[0126] 结果

[0127] 1.基础数据

[0128] 为了调查UV照射及混饵给药对小鼠有无影响，进行了体重测定和食入量测定。体重测定每周进行一次。食入量测定每周进行2次，各笼分别进行测定。各自的体重测定的结果示于图4，食入量测定的结果示于图5中。在各组间，没有发现体重的差别。此外，关于食入量，第4周以后，发现GlcN(+)组的食入量比其他组多的倾向，但食入量的上升对体重没有产生影响。

[0129] 根据食入量测定算出的各组的有效成分平均摄入量如下：0.072％(-)组为129mg/kg/天，0.072％(+)组为124mg/kg/天，0.15％(+)组为269mg/kg体重/天，GlcN(+)组为434mg/kg/天(图5B)。

[0130] 2.皮肤含水量

[0131] 为了检验因UVB照射以及山竹果皮提取物的给药产生的对皮肤含水量的影响，使用CORNEOMETER CM 825对皮肤含水量进行了测量。结果示于图6。图6A表示含水量的经时变化和测定时的湿度，图6B表示第8周时的含水量。

[0132] 在UVB照射组，大致从第3周起开始发现有含水量减少的倾向。到第5周止皮肤含水量在各组间没有检测出显著差异，但从第6周以后至第8周持续确认到对照(+)组中相对于对照(-)组有显著减少，且0.072％(+)组相对于对照(+)组有显著增加(p＜0.05)。除此以外，在第7、8周还发现相对于对照(+)组，GlcN(+)组也有显著增加。第8周时的皮肤含水量如下：对照(-)组为66.52±3.44，对照(+)组为57.60±6.71，0.072％(+)组为
62.89±2.92，GlcN(+)组为62.96±2.78。

[0133] 3.皮肤弹性

[0134] 皮肤弹性使用CUTOMETER SEM575在分组时和试验完成时测定共2次。

[0135] 对每1个体进行3次测定，将其平均值作为测定值使用。关于R0的皮肤的拉伸，确认到相对于对照(-)组，对照(+)组有显著减少。即得到了由于UV照射，皮肤的拉伸有降低的结果。此外，关于R1的皮肤的恢复，没有发现显著差异，各组没有变化。关于反应这些数据的表示皮肤整体的弹性的R2的值，相对于对照(-)组，发现对照(+)组有显著减少。

[0136] 4.病理学分析

[0137] 为了调查对皱纹形成的影响，对小鼠背部皮肤的皱纹的状态进行了观察。用异氟烷实施气体麻醉后用数码相机拍摄的背部的照片部分示于图8。在对照(-)组中，确认有相对于脊椎平行走向的线条(图8A)，这些线条随小鼠的运动时隐时现。在对照(+)组中，出现了在与脊椎垂直的方向上的线条(图8B)，还存在可以确认有皮肤炎症的个体。此外，在0.15％(+)组中，无论是相对于脊椎平行走向的皱纹，还是在垂直方向上的皱纹都很浅。

[0138] 还制作了HE染色标本，测定了各组的表皮厚度。使用HE染色标本对各标本的表皮厚度各测定10处，算出各组的平均值。各组的HE染色标本的代表图示于图9，表皮厚度的测定结果示于图10。表皮厚度结果如下：对照(-)组为23.20±3.56μm，0.072％(-)组为21.88±5.17μm，对照(+)组为38.72±7.56μm，0.072％(+)组为43.17±8.60μm，0.15％(+)组为36.74±5.92μm，GlcN(+)组为39.46±9.56μm。相对于对照(-)组，对照(+)组、0.072％(+)组、0.15％(+)组、GlcN(+)组中的表皮厚度有显著增加，确认有增生。确认了由于UV照射，基底层的细胞内浮肿和细胞间浮肿增加，颗粒细胞变为晒伤细胞的情况。表皮增生特别是棘层部分有增生。在0.15％(+)组中可以观察到棘层的增生，但细胞的状态和无照射组接近，虽然观察到细胞内浮肿，可是与0.072％(+)相比较，细胞间浮肿得到了治疗。

[0139] 5.根据SDS-PAGE及蛋白质印迹法的I型胶原的定量

[0140] 以各组的皮肤提取物为试样、使用6％聚丙烯酰胺Tris-HCl凝胶作为分离凝胶、3％聚丙烯酰胺Tris-HCl凝胶作为浓缩凝胶，进行电泳，并通过CBB染色进行确认。对于标记物，使用预先染色的SDS-PAGE标准高量程(PrestainedSDS-PAGE Standards High Range)(Control 310001920)。结果示于图11。根据该结果，确认到各样品的蛋白质量相等。

[0141] 蛋白质印迹的结果示于图12A。发现在117kDa附近有推测是I型胶原α1链的条带，并在200kDa附近检测出认为是β链的条带。图12B是通过画像分析软件Scion Image将A的条带强度定量化的图表。条带结果如下所示：将对照(-)组定为1时，0.072％(-)为1.56，对照(+)组为2.29，0.15％(+)为2.17，0.072％(+)为1.28，GlcN(+)为1.25(用α链和β链的平均值表示)(图12B)。

[0142] 6.通过醋酸纤维膜电泳进行的GAG的鉴定

[0143] 为了鉴定无毛小鼠皮肤提取物中的GAG、特别是与皮肤的水分保持有关的透明质酸(HA)的量，进行了醋酸纤维膜电泳。结果示于图13A。使用画像分析软件Scion Image分析各染点浓度而得的结果示于图13B。HA的条带强度如下所示：将对照(-)组定为1时，0.072％(-)为1.03，对照(+)组为1.25，0.072％(+)为0.93，0.15％(+)为0.86，GlcN(+)为0.58。由于UV照射HA的量增加，但确认了皮肤含水量与对照(+)组相比有显著增加的
0.072％(+)山竹果皮提取物给药组几乎没有观察到HA的量的变化。关于硫酸软骨素(CS)并没有检测出来，与3种标准物质不同的染点存在于CS的下游，在对照(-)组中确认有较深的染点。该染点被认为可能是硫酸乙酰肝素(HS)，但尚未进行鉴定。

[0144] 7.皮肤中过氧化脂质的定量

[0145] 为了考察山竹果皮提取物对皮肤的抗氧化效果，通过TBA反应进行了过氧化脂质的测定。当生物体内产生氧化过激时，最容易受到损害的是含有高度不饱和脂肪酸的脂质。作为生物体的氧化过激的标记物，使用羟基过氧化脂质类和硫代巴比妥酸反应性物质(thiobarbituric acid-reactive substances：TBARS)，该方法被认为是综合测定脂质过氧化度的有用的方法。在Ohkawa法的反应中，通过添加EDTA和Fe离子，可以知道试样中的TBARS是何种物质。已知来源于链烯(日语：アルケナ一ル)类、链二烯(日语：アルカジエナ一ル)类的红色色素的生成被EDTA抑制，而通过添加Fe离子得到增强。

[0146] 在本试验中，没有添加任何物质的情况下，几乎没有发现显色，然而在添加Fe离子的情况下发现有显色，所以采用了添加Fe离子的方法。

[0147] 测定的结果如图14所示。TBARS测定的结果在各组间没有检测出显著差异。

[0148] 8.羰基蛋白质的定量

[0149] 蛋白质也是受氧化损伤影响的因素之一。在受到光老化的皮肤中，可以发现在真皮上部的蛋白质中有因ROS引起的损害的累积(Sander CS，2002)。蛋白质的氧化修饰是指醛或酮的侧链结构(羰基蛋白质)、酪氨酸的交联结构、氨基酸替换、氨基酸的氧化、肽键的断裂等。蛋白质的氧化损伤是指例如使酶活性发生变化、使结构蛋白质的机能失活、使对蛋白质分解的感受性发生变化(Shacter E，2000)。在氧化修饰的蛋白质中，经常使用作为代表物质的羰基蛋白质的定量。

[0150] 从各组的皮肤组织使用蛋白质提取液(1％Trion X-100/50mMTris-HCl/75mM NaCl/10mM EDTA-2Na/5mM苄脒盐酸盐/0.1M氨基己酸)得到提取物，将其作为试样进行电泳后，通过CBB染色确认各样品的蛋白质的量。使用10％聚丙烯酰胺Tris-HCl凝胶作为分离凝胶、3％聚丙烯酰胺Tris-HCl凝胶作为浓缩凝胶。对于标记物，使用预染色的SDS-PAGE标准高量程(Prestained SDS-PAGE Standards High Range)(Lot.No.Control310001920)。结果示于图15。根据该结果，确认到各试样的蛋白质的量相等。

[0151] 各样品的羰基蛋白质的评定按照上述的“皮肤组织中氧化蛋白质的测定法”实施。用该评定法得到的各样品的蛋白质印迹的结果示于图16A。使用兔抗DNP抗体(Rabbit Anti-DNP Antibody)作为第一抗体，使用山羊抗兔IgG(缀合HRP)(Goat Anti-Rabbit IgG(HRP-conjugated))作为第二抗体。在分子量为97.4kDa和68kDa附近检测出较深的条带。此外，使用图画像分析软件Scion Image对条带强度进行了深度的定量，并示出将对照(-)组作为1时的相对强度(图16B)。将对照(-)组定为1时，0.072％(-)为1.18，对照(+)组为3.18，0.072％(+)为1.33，0.15％(+)为1.86，GlcN(+)为1.63，0.072％(+)组中的条带强度约为对照(+)组的42％。

[0152] 9.血浆过氧化脂质的定量

[0153] 对血浆中的过氧化脂质浓度进行了测定，没有发现显著的差异(图17)。

[0154] 讨论

[0155] 如上所述，确认到由于UVB照射对照组中皮肤含水量和皮肤弹性下降，通过山竹果皮提取物给药皮肤含水量增加。

[0156] 已知山竹含有130种以上的有效成分。本发明中，通过多种成分的综合的、协同的作用发挥抗氧化作用，而且还协同抗氧化作用以外的效果，认为是显著地获得了皮肤病的治疗和/或预防效果。

[0157] Corneometer的测定范围是30～40μm，在用于无毛小鼠的情况下，认为测定的是角质层和表皮的一部分的含水量。根据病理学分析的结果可知，由于UV照射，表皮、特别是棘层有增生，且在基细胞和棘细胞出现了细胞内浮肿和细胞间浮肿。与0.072％山竹果皮提取物给药组相比较，在0.15％山竹果皮提取物给药组中可观察到浮肿状态的治疗效果，而且0.15％(+)组的增生度也较低。由此，暗示了山竹果皮提取物的口服摄入对表皮的病理学变化有治疗效果，并且显示出该效果在0.15％混饵组更为明显。然而，关于含水量，在0.072％混饵给药组发现有上升。

[0158] 作为与皮肤含水量相关的因子，对皮肤中的透明质酸(HA)、胶原进行了定量，在I型胶原的定量方面，与无UV照射对照组相比较，UV照射对照组中获得约2.1倍的条带强度。这被认为是在UV照射初期生物体内的防御机制发挥作用，趋于生产增加，因此胶原增加。通过山竹果皮提取物的给药，胶原的生产减少，这可认为是由于UV照射的损伤减轻，因而不再倾向于胶原的增加。

[0159] 从通过羰基蛋白质的检测来测定氧化应激标记物的结果来看，可得到氧化应激因UV照射而增加，通过山竹果皮提取物的摄入氧化应激会减少的结果，并暗示山竹果皮提取物的抗氧化作用与皮肤状态的治疗有密切关系。

[0160] 如上所述，在混饵给药实验中发现含水量通过口服摄入山竹果皮提取物而上升。根据氧化应激标记物之一的羰基蛋白质的检测结果，暗示氧化应激的抑制与因山竹果皮提取物的给药引起的含水量的上升有关。

[0161] 实施例3

[0162] 通过山竹果皮提取物的强制口服给药来确认皮肤病的改善效果

[0163] 1.给药样品的制备与口服给药

[0164] 给药样品使用山竹果皮制剂。即，使用山竹果皮提取物∶阿拉伯胶＝1∶1的制剂化药剂。作为对照仅使用阿拉伯胶，还使用胶原作为阳性对照。制备各种浓度的溶液，将0.1ml/10g体重的溶液使用胃管在饲育期间每天对小鼠口服给药。山竹果提取物溶液制备为高浓度(24mg/ml)和低浓度(12mg/ml)2种，阿拉伯胶溶液的浓度制为24mg/ml，胶原溶液的浓度制为20mg/ml。

[0165] 2.饲育日程

[0166] 试验日程如图18所示。在预备饲育1周后，基于皮肤含水量和粘弹性进行分组，将动物分成6组：无UV照射的阿拉伯胶给药组(对照(-)组)、无UV照射的山竹果皮提取物溶液(24mg/ml)给药组(高浓度(-)组)、UV照射的阿拉伯胶给药组(对照(+)组)、UV照射的山竹果皮提取物溶液(24mg/ml)给药组(高浓度(+)组)、UV照射的山竹果皮提取物溶液(12mg/ml)给药组(低浓度(+)组)、UV照射的胶原给药组(胶原(+)组)。每周进行3次UVB照射并且每天通过导管进行强制口服给药。试验期间为8周，从2007年5月至7月实施。

[0167] 3.关于UVB照射

[0168] 使用UVB灯GL20SE(三洋电气(SANKYO DENKI))在照射强度为0.3mW/cm2的条件下每周进行3次UVB照射。使用数字式紫外线强度计UV-340(亚苏旺(アズワン))调整照射强度。将小鼠单独放在9cm×5cm×4cm的笼子内1个半小时，为了减小在各笼子内的照射强度的差异，每次照射都轮换笼子来进行。

[0169] 照射时间如下：第1周进行1分钟的照射，第2周进行2分钟的照射，第3周增至3分钟，此后进行3分钟的照射。从第38天起提高照射强度，照射时间设为4分钟，但由于小鼠皮肤出现红斑，从第43天起改为进行3分30秒的照射。总照射量为1.224J。

[0170] 4.从皮肤组织提取蛋白质的方法

[0171] 与实施例2同样地采集的皮肤组织称量并且各组分别整理，用乙醇进行24小时脱脂，再用剪刀剪碎后，通过用含有蛋白酶抑制剂的PBS(-)(PBS(-)中溶有5mM苯脒盐酸盐/10mM EDTA-2Na/0.1M氨基己酸的溶液)洗净2次以除去血清成分等。然后，添加相对于皮肤组织湿重为10倍量的蛋白质提取液(4M盐酸胍/50mM Tris-HCl/0.1M NaCl/5mM苄脒盐酸盐/10mM EDTA-2Na/0.1M氨基己酸(pH7.4))，使用振荡机在4℃下振荡72小时。在4000rpm转速下离心分离20分钟，采集上清液，用7M尿素/50mM Tris-HCl/0.1M NaCl/5mM苄脒盐酸盐/10mM EDTA-2Na/0.1M氨基己酸缓冲液(pH7.4)进行透析。透析后，加入TOYOPEARL(注册商标)DEAE-650S(东曹株式会社(東ソ一社)制)，在4℃下振荡24小时，分为吸附组分(A)和未吸附组分(B)。

[0172] 对于A，添加洗脱缓冲液(7M尿素/50mM Tris-HCl/2M NaCl/5mM苄脒盐酸盐/10mM EDTA-2Na/0.1M氨基己酸(pH7.4))，在4℃下振荡72小时进行提取，其后相对于RO水实施透析。对于B，直接相对于RO水实施透析。在透析后，A、B都进行冷冻干燥，并作为SDS-PAGE和蛋白质印迹用的样品使用。A用于检测核心蛋白聚糖，B用于检测胶原。该步骤示于图19。

[0173] 5.其他的实验与实施例2相同。

[0174] 结果

[0175] 1.皮肤含水量

[0176] 为了检验因UVB照射以及山竹果皮提取物的给药产生的对皮肤含水量的影响，使用CORNEOMETER CM 825对皮肤含水量进行了测量。结果示于图20A及图20B。到第5周为止在各组间没有检测出差异。到第6周时，相对于对照(-)组，对照(+)组显示出含水量减少的倾向(p＜0.1)。此外，相对于对照(+)组，在高浓度(+)组发现有显著的上升。在第7周时，相对于对照(-)组，检测出在对照(+)组有显著的减少(p＜0.05)；相对于对照(+)组，检测出在高浓度(+)组有显著的增加。发现有显著差异的第7周时的皮肤含水量结果如下：对照(-)组为78.83±1.90，高浓度(-)组为82.49±4.89，对照(+)组为73.24±5.41，高浓度(+)组为77.43±3.86，低浓度(+)组为74.26±2.63，胶原(+)组为68.54±2.91。

[0177] 2.皮肤弹性

[0178] 使用CUTOMETER SEM575，对无毛小鼠腰部皮肤的弹性进行测定。结果如图21A～J所示，分组时，在各组间没有检测出显著差异。解剖时，作为皮肤的拉伸的参数的R0在各组间没有发现显著差异，但关于表示皮肤的恢复的R1，相对于对照(-)组，确认对照(+)组有显著的减少(p＜0.05)。此外，关于表示皮肤整体的弹性的R2，相对于对照(-)组，确认了在对照(+)组有显著的减少(p＜0.01)；相对于对照(+)组，确认了在高浓度(+)组有显著的增加(p＜0.05)。此外，相对于高浓度(-)组，确认在高浓度(+)组有显著的减少。

[0179] 3.病理学分析

[0180] 背部皮肤HE染色标本中应该注意的观察结果用图22进行说明。在图22的无UV照射标本(a)中，几乎没有发现基细胞层的细胞内浮肿，但在UV照射标本(b)中观察到了基细胞层的细胞内浮肿。确认了进一步受到损伤时，在细胞间也会发现有浮肿，并从基底层细胞扩散至棘细胞层，在颗粒细胞中也有晒伤化的细胞。即，具体而言，在HE染色标本中关注3点：(1)有没有发现颗粒细胞的晒伤化细胞，(2)在基细胞的细胞内及细胞间有无浮肿，(3)细胞间浮肿有没有延伸至棘层。关于浮肿，当损伤较小时只能观察到细胞内浮肿，但当损伤变得越大时会越多地出现细胞间浮肿，基底层的细胞间浮肿也会扩散至棘层。

[0181] 各组的病理分析的结果示于图23。图23表示各组的代表性标本。在对照(-)组中，可以观察到处处都有细胞内浮肿。在UV照射组中除了细胞内浮肿，细胞间浮肿扩散，有的标本中细胞间浮肿扩散到棘层。与对照(+)组相比，在高浓度(+)组中浮肿的状态明显有改善。另外，图23中由双线(二重線)圈起的地方表示颗粒细胞的晒伤化细胞，由单线(一重線)圈起的地方表示基细胞的细胞内浮肿，由虚线圈起的地方为基细胞的细胞间浮肿的病理观察结果。

[0182] 此外，表皮厚度的测定结果示于图24。这些值是对各标本各测定10处表皮厚度并计算出平均值而得的结果。表皮厚度的测定结果如下：对照(-)组为29.87±11.94μm，高浓度(-)组为21.03±2.46μm，对照(+)组为50.42±11.89μm，高浓度(+)组为39.63±6.63μm；相对于对照(-)组，在对照(+)组发现有表皮增生；相对于高浓度(-)组，在高浓度(+)组发现有表皮增生(图24)。

[0183] 此外，对于背部皮肤的皱纹形成的状态进行观察，确认了与对照(-)组相比，在对照(+)组形成了较深的皱纹。将高浓度(-)组与高浓度(+)组比较时也观察到了同样的状态。将对照(-)组与高浓度(-)组进行观察比较，在外观上没有观察到差异。将对照(+)组与高浓度(+)组比较时，虽然感觉上有一些差异，但并没有观察到可表示外观差别的差异。

[0184] 4.I型胶原的SDS-PAGE及蛋白质印迹

[0185] 使用6％聚丙烯酰胺凝胶作为分离凝胶、3％聚丙烯酰胺凝胶作为浓缩凝胶，并使用预染色的SDS-PAGE标准高量程(Prestained SDS-PAGE Standards High Range)(Control 310001920)作为标记物进行电泳，通过CBB染色，确认了各样品的蛋白质的量相等。蛋白质印迹的结果如图25A及B所示。在116kDa附近确认了认为是I型胶原α链的条带，将对照(-)组的条带强度定为1时，高浓度(-)组为1.60，对照(+)组为1.50，高浓度(+)组为2.86(图25C)。

[0186] 5.核心蛋白聚糖的SDS-PAGE及蛋白质印迹

[0187] 使用7.5％聚丙烯酰胺凝胶作为分离凝胶、3％聚丙烯酰胺凝胶作为浓缩凝胶，并使用预染色的SDS-PAGE标准高量程(Prestained SDS-PAGE Standards High Range)(Lot.No.Control 310001920)作为标记物进行SDS-PAGE，供于CBB染色，在确认各样品的蛋白质的量相等后，实施蛋白质印迹(图26A及B)。当将对照(-)组的条带强度定为1时，高浓度(-)组为1.15，对照(+)组为1.53，高浓度(+)组为1.28(图26C)。与无照射对照组相比，在UV照射对照组中核心蛋白聚糖的条带无论是在低分子侧还是在高分子侧都较宽，在高浓度(+)组中低分子侧的条带消失。

[0188] 讨论

[0189] 本实施例中得到以下结果：山竹果皮提取物的给药对于无毛小鼠改善了因UV照射而降低的皮肤含水量。因此，可认为山竹果皮提取物是对皮肤的水分保持有效果的物质。

[0190] 此外，作为导管试料的分散剂，使用认为无含水量改善效果的阿拉伯胶，但在对照组中仍发现含水量有增加的倾向。有报告(《药学国际杂志》第298卷第153页～263页，2005(International Journal of Pharmaceutics 298：153-263，2005))指出在简化的角质层的生物体外模型中阿拉伯胶可以抑制脂质的过氧化，暗示阿拉伯胶可能显示出阻碍因UVB照射产生的氧化过激的作用。

[0191] 此外，对于皮肤弹性，由于UV照射皮肤整体的弹性会有下降，但暗示山竹果皮提取物具有使降低的弹性恢复的效果。

[0192] 根据蛋白质印迹的结果，发现胶原的条带强度因UV照射而增加。有报告称在光老化模型的小鼠中，皮肤中的总胶原量不一定因紫外线照射而减少，该结果与那个报告一致。无论是无照射还是有照射，通过果皮提取物的给药，从发现以浮肿为代表的病理观察结果的恢复来看，可以推测给药与皮肤组织的恢复机制有某种关系，从而引起胶原产生的增加。

[0193] 从核心蛋白聚糖的蛋白质印迹结果来看，可得到以下结果：因UV照射产生的低分子·高分子量的核心蛋白聚糖会因果皮提取物的给药而减少。核心蛋白聚糖是具有约100kDa的分子量的蛋白聚糖，在约40kDa的核心蛋白质上共价结合1条硫酸软骨素链或者硫酸皮肤素链。核心蛋白质是具有富亮氨酸的8～10个氨基酸重复序列(LRR)的分子量较小的蛋白聚糖。核心蛋白聚糖与胶原或其他分子相互作用，在结缔组织的形成和机能上承担重要的作用。报告称核心蛋白聚糖基因缺损的小鼠与野生型相比，皮肤脆弱且弹性较差。
此外，还有报告称在纤维形成的调节上，向损伤的肌纤维进行局部的核心蛋白聚糖给药时，可以抑制过度的纤维形成并改善肌肉修复。这些报告显示出核心蛋白聚糖与细胞外基质的正常的构建有关。因UV照射增加的比平常的分子量低或高的核心蛋白聚糖主要与含水量、弹性中的皮肤的弹性降低有关，通过果皮提取物的给药核心蛋白聚糖的低分子测的条带消失，弹性也上升，从这些结果来看，可认为低分子核心蛋白聚糖的增加有使皮肤弹性减小的作用，而果皮提取物的给药有抑制低分子核心蛋白聚糖产生的作用。对于详细的机理，需要进一步的验证。

[0194] 从以上的结果来看，山竹果皮提取物的给药可以使皮肤含水量、皮肤弹性和表皮增生恢复。此外，可以改善因UV照射引起的病理学观察结果的恶化。其中，推测皮肤弹性的恢复与因UV照射引起的异常核心蛋白聚糖的抑制有关。

[0195] 实施例4

[0196] 使用山竹提取物的食品的制备

[0197] 用实施例1中制备的山竹果皮提取物按照如下所述制备口香糖。

[0198]

[0199] 用实施例1中制备的山竹果皮提取物按照如下所述制备糖果。

[0200]

[0201] 用实施例1中制备的山竹果皮提取物按照如下所述制备软糖。

[0202]

[0203]

[0204] 用实施例1中制备的山竹果皮提取物按照如下所述制备巧克力。

[0205]

[0206] 用实施例1中制备的山竹果皮提取物按照如下所述制备冰糕。

[0207]

[0208] 用实施例1中制备的山竹果皮提取物按照如下所述制备冰激凌。

[0209]

[0210]

[0211] 用实施例1中制备的山竹果皮提取物按照如下所述制备饼干。

[0212]

[0213] 用实施例1中制备的山竹果皮提取物按照如下所述制备糖片。

[0214]

[0215] 用实施例1中制备的山竹果皮提取物按照如下所述制备饮料。

[0216]

[0217]

[0218] 本申请主张基于2009年3月31日提出申请的日本专利申请号2009-085411的优先权，引用其内容作为本申请的一部分。