一种O型口蹄疫多表位疫苗转让专利
申请号 : CN201110195278.5
文献号 : CN102372766B
文献日 : 2013-12-25
发明人 : 李殿明 , 蒲勤 , 李毅 , 田春辉 , 赵明 , 齐春梅 , 顾富香 , 任百亮 , 张导春 , 牛纪涛 , 刘甜甜 , 刘祯
申请人 : 青岛红桥明勤生物科技有限公司
摘要 :
本发明涉及一种对OZK/93、OR/80MF8、OS/99MF8、OHK93等流行O型口蹄疫病毒具有交叉免疫保护效力的多表位疫苗的制备和应用。所述疫苗含有2段T细胞辅助抗原表位多肽，4～7段与不同口蹄疫毒株主要外膜蛋白VP1、VP2和VP3相关的抗原表位多肽。本发明还涉及该疫苗的制备方法和临床免疫应用方法。本疫苗生产制备工艺稳定，适合大规模生产，试验表明多表位疫苗使用安全，能够有效预防不同O型口蹄疫流行毒株的感染，有效抗体滴度可以维持至少7个月。
权利要求 :
1.一种O型口蹄疫多表位融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。
2.一种核酸分子，其编码权利要求1项所述多表位融合蛋白。
3.一种载体，其含有权利要求2所述的核酸分子。
4.一种宿主细胞，其含有权利要求3所述的载体。
5.权利要求2所述的核酸分子，其具体序列如下：
gaa ttc atc agc atc acc gag atc aaa ggt gtg att gtt cat cgc att gaa acc att ctg ttt ggt ggt gca aag ttcgtt gca gca tgg acc ctg aaa gca gca gca ggt gat atc cca ggt tgc aag tac agc gat gca cgt gtt agc aacgtt cgt ggt gat ctg cgt gtt ctt gca cag aaa gca gaa cgt gca ctt cca act tct ggt gca cgt cac aaa cagaag att gtt gca cca gcg aaa cag ttg ttg ggt tct ggt aag tac tct gat gca cgt gtt agc aac gtt cgt ggt gatctg caa gtt ctg gca cag aaa gca gaa cgt gca ttg cca acc agc ttc aac tat ggt gca atc aaa ggt tct ggtcgt cgt cag cat acc gac atc agc ttc att ctg gat cgt ttc gtg aaa gtt act ccg aaa gat cag atc aac gtt ctggat ctg atg cag att cca gca cat acc ttg gtt ggt ggt tct cca acc ttt ctg cac ttt gaa ggt gat gtt cca tactct ggt ggt gat tgg gtt acc tct gat agc ttt ggt cgt tgc agc att gac aaa cgt gaa gca gca tac aag tac aaagaa gcg aaa gaa tgg ttg taa aag ctt
6.一种用于预防O型口蹄疫的疫苗，其包含权利要求1所述的多表位融合蛋白以及药学上可接受的载体。
7.权利要求1所述的多表位融合蛋白在制备O型口蹄疫疫苗中的应用。
说明书 :
一种O型口蹄疫多表位疫苗
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种具有交叉免疫保护效力的O型口蹄疫多表位疫苗的制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将不同O型口蹄疫流行株的主要外膜蛋白VP1、VP2、VP3的多个B细胞抗原表位，杀伤性T细胞抗原表位以及多个T细胞辅助抗原表位串联，并连入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备，得到O型口蹄疫多表位疫苗以及该疫苗在预防口蹄疫疫病中的应用。
背景技术
[0002] 口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、发热性、高度接触性传染病。易感动物主要包括牛、水牛、绵羊、山羊、骆驼和猪等20个科的70多种家养和野生哺乳动物，危害性很大，由于口蹄疫的高度传染性和对农业经济的重大影响，国际兽医局(OIE)将其列为A类传染病之首。在各种畜牧动物中，牛、羊、猪都敏感，其中牛最易感，猪和牛的临床表现最严重，羊只表现亚临床感染。该病的发病率几乎达100％，犊牛及仔猪呈恶性病型，死亡率可达50～70％。口蹄疫病毒属于RNA病毒，共七种不同的免疫原型：A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和亚洲1型。
[0003] 口蹄疫在全世界的分布范围之广，危害性之大，使得消灭和控制口蹄疫成为各国政府共同关注的问题。至今免疫接种仍是疫病流行地区主要的口蹄疫控制手段。理想的疫苗必须安全、有效，同时还应具备价廉、易于推广等优点。目前世界范围内普遍使用的仍旧是灭活苗，即在BHK-21细胞系上扩增病毒，收集浓缩，化学灭活。作为传统疫苗，虽然FMDV灭活疫苗具有良好的免疫原性，但是由于大规模生产中灭活不彻底，活毒从生产车间逃逸等原因，造成其生产、流通和使用上存在生物安全隐患(Doel TR，2003)，不能减少持续感染的发生，并且给检疫和流行病学研究带来混乱；此外，灭活疫苗只能提供短期保护，对七种血清型具有型特异性。化学合成肽疫苗安全高效，但是该苗的生产成本昂贵。基因工程疫苗具有安全性高，同时可以根据需要制备同一病毒多个成分或多价病毒疫苗，大幅度节约生产成本等优点，成为FMD研究的热点之一。1981年6月18日，世界上第一个基因工程疫苗在美国诞生。
[0004] 口蹄疫病毒含有4种主要多肽，VP1～VP4，VP1～VP3是组成衣壳蛋白的亚单位。人们做了大量的具体工作确认了这些蛋白的抗原位点以期开发更加有效的疫苗(Mateu M G,1995)。VP1～VP3主要形成了5个已知的O型口蹄疫病毒B细胞抗原位点(Kitson J D A,1990；Growther J R,1993；)。以往，FMDV的重要抗原位点的设计主要集中在140～
160位氨基酸和VP1碳末端(Bittle J K，1988；PfaffE,1988)。但大量的研究表明VP2和VP3氨基酸侧链也是暴露在病毒粒子的表面(Morrell D J，1987)，这两种蛋白也含有重要的抗原表位(Saiz J C,1991；Baxt B,1989；Bolwell C,1989；Thomas AA,1988)。βG.βH环和VP1碳末端促成位点1，临界氨基酸残基为144，148，154和208氨基酸，位点1组成了VP1的两个表位141～160和200～213位氨基酸残基。VP2的31，70～73，75和77位氨基酸促成了位点2，位点3则部分由VP1的βB-βC环上43和44位氨基酸组成，位点4仅发现了VP3的58位氨基酸。位点5由VP1的149位氨基酸和环区的其他表面氨基酸组成。
位点1呈线性且对胰蛋白酶敏感，而其他位点的均呈现不同的空间构象且抗胰蛋白酶。与中和抗体和抗感染有关的主要是VP1，其中21～40位氨基酸肽段是一重要的T细胞抗原表位(collen T，1991)，141～160或141～158，200～213位氨基酸肽段是重要的B细胞表位，能够保护动物抵抗病毒攻击(Bittle J L,1982)，40～60位氨基酸肽段具有调节
141～160、200～213位氨基酸两个B细胞抗原表位的功能，同时也是重要的B细胞抗原表位(ParryN R，1990)。
160位氨基酸和VP1碳末端(Bittle J K，1988；PfaffE,1988)。但大量的研究表明VP2和VP3氨基酸侧链也是暴露在病毒粒子的表面(Morrell D J，1987)，这两种蛋白也含有重要的抗原表位(Saiz J C,1991；Baxt B,1989；Bolwell C,1989；Thomas AA,1988)。βG.βH环和VP1碳末端促成位点1，临界氨基酸残基为144，148，154和208氨基酸，位点1组成了VP1的两个表位141～160和200～213位氨基酸残基。VP2的31，70～73，75和77位氨基酸促成了位点2，位点3则部分由VP1的βB-βC环上43和44位氨基酸组成，位点4仅发现了VP3的58位氨基酸。位点5由VP1的149位氨基酸和环区的其他表面氨基酸组成。
位点1呈线性且对胰蛋白酶敏感，而其他位点的均呈现不同的空间构象且抗胰蛋白酶。与中和抗体和抗感染有关的主要是VP1，其中21～40位氨基酸肽段是一重要的T细胞抗原表位(collen T，1991)，141～160或141～158，200～213位氨基酸肽段是重要的B细胞表位，能够保护动物抵抗病毒攻击(Bittle J L,1982)，40～60位氨基酸肽段具有调节
141～160、200～213位氨基酸两个B细胞抗原表位的功能，同时也是重要的B细胞抗原表位(ParryN R，1990)。
[0005] 多年来，研究人员开发了大肠杆菌、转基因植物、酵母、痘病毒、腺病毒载体等多种表达系统(Kleid DG，1981；Dus Santos MJ，2005；Balamurugan V，2005；Mayr GA，2001；Pacheco JM，2005；Abrams CC，1995)，用于表达口蹄疫抗原制备亚单位疫苗。但是，这些方法也有免疫原性弱和护效力低的问题。已知的腺病毒疫苗具有较好的保护效果，但是由于此方法存在安全性问题和保存困难，人们一直未能接受。作为一种有价值的表达类病毒粒子的表达系统，杆状病毒表达系统已经成功表达了多种病毒空衣壳蛋白(Maranga L，2002；
Noad R，2003)，(MortolaE，2004；Belliot G，2001)，该系统也表达了口蹄疫的空衣壳蛋白疫苗，且动物攻毒试验保护率为80％，PD50为6.3，符合OIE规定的3PD50标准(Z.Li，2008)。
Noad R，2003)，(MortolaE，2004；Belliot G，2001)，该系统也表达了口蹄疫的空衣壳蛋白疫苗，且动物攻毒试验保护率为80％，PD50为6.3，符合OIE规定的3PD50标准(Z.Li，2008)。
发明内容
[0006] 本发明根据目前主要O型口蹄疫流行株的主要外膜蛋白VP1、VP2和VP3氨基酸序列，利用DNASTAR和ANTHEPROT软件对O型口蹄疫流行毒株主要外膜蛋白的亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Gamier-Robson的二级结构进行分析，再根据表位位置和氨基酸序列的相似设计寡核苷酸片段，将各核苷酸片段串联后在大肠杆菌中表达，经过发酵、纯化、乳化的工艺，获得具有理想免疫原性的O型口蹄疫多表位疫苗抗原多肽。利用本发明制备的疫苗可以有效预防多种O型口蹄疫病毒的感染。
[0007] 本发明的目的之一在于提供了一种新的能用于预防多种流行性O型口蹄疫毒株感染的基因工程重组多表位疫苗多肽及其疫苗组合物。
[0008] 本发明的目的之二在于提供了所述多表位疫苗多肽表达载体的构建及获得方法。
[0009] 本发明的目的之三在于提供了能够表达所述口蹄疫多表位疫苗的基因工程菌株。
[0010] 本发明的目的之四在于提供了所述口蹄疫多表位疫苗的制备方法。
[0011] 本发明的目的之五在于提供了所述多表位疫苗在预防多种流行性口蹄疫疫病中的用途。
[0012] 在第一方面，本发明提供了一种用于预防多种O型口蹄疫疫病的基因重组多表位疫苗多肽及其组合物。其含有4～7个主要O型口蹄疫流行毒株OZK93、OR80、OS99、OHK93毒株等主要外膜蛋白VP1、VP2、VP3B细胞表位与杀伤性T细胞表位，1～2T细胞辅助免疫抗原表位。B细胞表位、杀伤性T细胞是指具有免疫原性的O型口蹄疫病毒主要外膜蛋白中的一部分多肽或其具有基本相同免疫原性功能的等价物。所述T细胞抗原表位是指能够增强Thelper细胞活性的抗原表位。所述多表位疫苗是指多个抗原表位串联到一起所形成的蛋白或多肽。串联可以通过遗传工程方法进行，多表位疫苗中除了含有主要外膜蛋白VP1、VP2和VP3抗原表位和Thelper细胞抗原表位外，还包含非免疫活性物质。所述非免疫活性物质为各多肽的连接部分，不具有VP1、VP2和VP3抗原表位以及Thelper细胞抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。
[0013] 优选在本发明第一方面的多表位疫苗多肽中所述的主要外膜蛋白抗原表位序列分别选自VP1蛋白B细胞抗原表位氨基酸序列分别位于蛋白C端第135～162位氨基酸(OZK93毒株)，第199～213位氨基酸(OZK93、OS99和OR80毒株)，第135～169位氨基酸(OS99和OR80)肽段内，B细胞与杀伤性T细胞联合抗原表位氨基酸序列位于蛋白C端第26～62位氨基酸(OHK93、OS99、OR80和OZK93等)肽段内；VP2蛋白B细胞抗原表位氨基酸序列蛋白C端第68～78位以及131～136位氨基酸(OHK93、OS99、OR80和OZK93等)肽段内，主要外膜VP3蛋白抗原表位氨基酸序列位于蛋白C端第52～63位氨基酸(OHK93、OS99、OR80和OZK93等)肽段内。
[0014] 另外优选，本发明第一方面所述多表位疫苗多肽的氨基酸序列如下：
[0015] (1)VP1B细胞抗原表位135～162位氨基酸序列为Be1(SIQ ID No.8)：KYSDARVSNVRGDLRVLAQKAERALPTS；
[0016] (2)VP1B细胞抗原表位199～213位氨基酸序列为Be2(SIQ ID No.10)：ARHKQKIVAPAKQLL；
[0017] (3)VP1B细胞抗原表位135～169位氨基酸序列为Be3(SIQ ID No.12)：KYSDARVSNVRGDLQVLAQKAERALPTSFNYGAIK；
[0018] (4)VP1B细胞与杀伤性T细胞联合抗原表位26～62位氨基酸序列为Be-Tc4(SIQ ID No.14)：RRQHTDISFILDRFVKVTPKDQINVLDLMQIPAHTLV；
[0019] (5)VP3B细胞抗原表位52～63位氨基酸序列为Be5(SIQ ID No.16)：PTFLHFEG DVPY；
[0020] (6)VP2B细胞抗原表位68～78位和131～136位氨基酸序列为Be6(SIQ ID No.18和SIQ ID No.20)：DWVTSDSFGRCSIDKRE；
[0021] (7)杀伤性T细胞表位氨基酸序列为Tce7(SIQ ID No.22)：KYKEAKEWL；
[0022] (8)T细胞辅助抗原表位为通用Thelper表位(SIQ ID No.4和SIQ ID No.6)：The1：ISITEIKGVIV HRIETILF和The2：AKFVAAWTLKAAA。
[0023] 另外优选，在第一方面所述的多肽片段包含5～7个主要优势外膜蛋白B细胞表位及杀伤性T细胞表位。进一步为一个杀伤性T细胞表位Tee7，一个B细胞与杀伤性T细胞联合表位Be-Tc4，一个VP3蛋白B细胞表位Be5，一个VP2蛋白B细胞表位Be6，VP1蛋白B细胞表位Be1或Be2或Be3任意组合。此外含有Thelper细胞抗原表位The1或The2任意组合。
[0024] 上述不同的外膜蛋白B细胞和杀伤性T细胞抗原表位以及T细胞辅助抗原表位的排列组合方式在理论上有几十万种，基于疫苗激发免疫反应机理和疫苗本身生物化学特性考虑，优选如下次序：
[0025] 较佳地，多肽片段组合次序为：The1-Be1—Be2-Be3-Be-Tc4-Be5-Be6-Tce7-The2，The1-The2-Be1-Be2-Be3-Be-Tc4-Be5-Be6-Tce7，Be1-Be2-Be3-Be-Tc4-Be5-Be6-Tce7-The1-The2，更佳地，多肽片段组合次序为：The1-The2-Be1-Be2-Be3-Be-Tc4-Be5-Be6-Tce7。
[0026] 在第二方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的O型口蹄疫多表位疫苗多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通过人工合成方式合成，然后克隆入载体，转化入大肠杆菌，发酵、纯化后获得多表位疫苗多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切、琼脂糖凝胶电泳、转化、DNA提取等。优选本发明中的核苷酸序列如下：
[0027] gaa ttc atc agc atc acc gag atc aaa ggt gtg attgtt cat cgc att gaa acc att ctg ttt ggt ggt gca aag ttc gtt gca gca tgg acc ctg aaa gca gca gca ggt gat atc cca ggt tgc aag tac agc gat gca cgt gtt agc aac gtt cgt ggt gat ctg cgt gtt ctt gca cag aaa gca gaa cgt gca ctt cca act tct ggt gca cgt cac aaa cag aag att gtt gca cca gcg aaa cag ttg ttg ggt tct ggt aag tac tct gat gca cgt gtt agc aac gtt cgt ggt gat ctg caa gtt ctg gca cag aaa gca gaa cgt gca ttg cca acc agc ttc aac tat ggt gca atc aaa ggt tct ggt cgt cgt cag cat acc gac atc agc ttc att ctg gat cgt ttc gtg aaa gtt act ccg aaa gat cag atc aac gtt ctg gat ctg atg cag att c6a gca cat acc ttg gtt ggt ggt tct cca acc ttt ctg cac ttt gaa ggt gat gtt cca tac tct ggt ggt gat tgg gtt acc tct gat agc ttt ggt cgt tgc agc att gac aaa cgt gaa gca gca tac aag tac aaa gaa gcg aaa gaa tgg ttg taa aag ctt
[0028] 在第三方面，本发明提供了一种载体，其除了含有本发明第二方面所述的核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、增强子，选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。在一优选实施方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。
[0029] 在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的载体。宿主细胞转化或转染含有本发明所述编码蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的O型口蹄疫多表位疫苗多肽。
[0030] 在第五方面，本发明提供了一种制备具有交叉免疫原性的O型多表位疫苗的方法，其包括以下步骤：工程菌发酵表达多表位疫苗多肽，经过粗纯化与精细纯化工艺以及后续乳化工艺，获得所需要的多表位疫苗。其中涉及的方法包括但不限制于菌体超声破碎、包涵体洗涤、离心、变性、亲和层析、疏水层析、阴离子交换色谱、反相色谱、复性、乳化等。本发明中涉及的制备方法为本领域技术人员所熟知。
[0031] 在第六方面，本发明提供了一种用于预防多种O型口蹄疫流行毒株感染的基因重组多表位疫苗，其包括本发明第一方面所述的多肽以及药学上可接受的载体。所述口蹄疫疫苗能够预防OHK93、OS99、OR80、OZK93等O型口蹄疫流行毒株的侵染。本发明所述的药学上可接受的载体为免疫增强剂或免疫佐剂，优选免疫佐剂为油佐剂：进口白矿物油DUOPRIME(医药级)。
[0032] 在第七方面，本发明提供了第六方面所述的基因重组O型口蹄疫多表位疫苗的应用。在本发明的实施方案中，通过对疫苗进行靶动物攻毒试验、对不同毒株交叉免疫保护试验、PD50试验及最小免疫剂量测定试验、免疫持续期与抗体校长规律研究试验、实验室安全性试验等，表明本发明所述的多表位疫苗是安全的，并且能够激发持久免疫力，保护动物免受O型口蹄疫病毒感染。
[0033] 另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有实质性特点的方面对本领域的普通技术人来说是显而易见的。此外，本发明亦使用了公开文献，他们的全文内容均纳入本文进行参考。
附图说明
[0034] 下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书说界定的本发明范围。
[0035] 图1为含有O型口蹄疫多表位疫苗多肽编码基因的表达载体pPRSETB-NFO示意图。
[0036] 图2为NFO蛋白编码核酸限制性内切酶琼脂糖凝胶电泳图，第一泳道为DNA分子量标准，自上而下为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；第二泳道为未经酶切的重组pPRSETB-NFO；第三泳道为经过EcoR／和HindIII双酶切质粒。
[0037] 图3为菌种诱导表达SDS-PAGE分析结果，从左至右依次为：未诱导表达、阳性克隆小量诱导表达、生产种子菌筛选诱导表达、分子量标准、发酵诱导表达、未诱导表达。蛋白分子量从上至下依次为：97.2KD、66.4KD、44.3KD、29KD、20.1KD、14.3KD。
[0038] 图4为变性、纯化、复性SDS-PAGE分析结果，从左至右依次为：分子量标准、变性粗纯蛋白、精细纯化NFO蛋白一步、精细纯化NFO蛋白二步、复性蛋白。蛋白分子量从上至下依次为：97.2KD、66.4KD、44.3KD、29KD、20.1KD、14.3KD。
[0039] 图5为纯化蛋白WESTERNBLOT印记结果，从左至右依次为：预染蛋白marker、筛选阳性克隆纯化NFO样品、阴性对照、发酵纯化NFO样品。分子量从上至下依次为：116KD、97.2KD、66.4KD、44.3KD、29KD、20.1KD、14.3KD。
[0040] 图6为重组猪O型口蹄疫多表位疫苗免疫后抗体消长规律结果。
具体实施方式
[0041] 实施例中所述的具体实验／试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐述本发明，但并不构成对本发明范围的限制，依据本说明书的许多变化为本领域的技术人员所熟知。
[0042] 实施例一O型口蹄疫多表位疫苗多肽编码蛋白的设计思路
[0043] 综合国内多株O型口蹄疫病毒流行株OZK93、OR80、OS99、OHK93等毒株的基因组序列，抗原结构、流行病学研究进展，对重组猪O型口蹄疫多表位疫苗进行了优化设计。本发明利用DNAStar及ANTHEPROT软件对其主要外膜蛋白VP1、VP2、VP3进行的亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Gamier-Robson的二级结构进行分析，预测可能的B细胞抗原表位以及杀伤性T细胞表位的基础上，根据表位位置和氨基酸序列的相似性，分析多种毒株的共有及特异性抗原表位，并参考GenBank中的序列信息，对预测的抗原表位进行比对，进一步分析抗原表位在不同病毒株中的保守性，从而确定与流行毒株相关的B细胞优势抗原表位多肽5段，杀伤性T细胞优势抗原表位1段，B细胞与杀伤性T细胞联合抗原表位多肽1段，T细胞辅助抗原表位的确定方法与外膜蛋白相同，最终确定优势抗原表位2段。该疫苗的总体结构为：
[0044] The1-The2-Be1-Be2-Be3-Be-Tc4-Be5-Be6-Tce7
[0045] 实施例二大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建
[0046] 将实施例一中设计好的多肽编码核苷酸送上海英俊生物技术公司合成，并在片段两端分别设计厂EcoRI(5’端)和HindIII(3’端)限制性酶切位点，然后将合成片段克隆到pMD18T载体上。序列测定证实插入基因片段与设计序列一致(见序列表)。利用限制性内切酶EcoRI和HindIII,将O型口蹄疫疫苗基因从载体中切出，电泳回收。大肠杆菌表达载体选用pharmacia biotech公司的pRSETB质粒，亦使用限制性内切酶EcoRI和HindIII处理，酶切条件：10μl反应体系，体系内加入2μl质粒，限制性内切酶为5个活性单位(New England biolabs)，加入10×缓冲液1μ1，去离子水补齐，37℃酶切1.5小时。酶切结束后加入1μl200mM EDTA终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。紫外灯下将2.85kb pRSETB质粒、636bp的NFO片段切下，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段＝1：2～3的比例将目的基因片段和表达载体混合，反应体系
15μl，由T4DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，所得重组质粒命名为pRSETB-NFO(见图
1)，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。
15μl，由T4DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，所得重组质粒命名为pRSETB-NFO(见图
1)，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。
[0047] 转化：pRSETB-NFO置冰上融化，加入2μl链接反应液，再次混匀，冰水浴30分钟，42℃30秒，然后迅速放回冰浴1.5分钟，加入1ml LB培养液，37℃，静置培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200μlLB培养基重悬菌体；将菌液均匀涂布于含有100μg／mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板上，倒置于37℃恒温箱中培养12-16小时，直至克隆形成。
[0048] 鉴定：挑取平板上的单克隆至LB培养基中，37℃，180rpm震荡培养12小时，提取质粒，EcoR／和Hind III双酶切，可以切出相应猪O型口蹄疫疫苗基因大小片段的克隆，可初步确定为阳性克隆(见图2)；阳性克隆进行DNA序列测定进一步验证其正确性。
[0049] 诱导表达：即将阳性克隆过夜培养，次日早上按1：100转接，培养3小时后，加入0.5mMIPTG，继续培养3小时，制备样品；常规SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况——在29KD分子量处(见图3)，见到特异性条带为正确克隆；取正确克隆，放大培养，SDS-PAGE证实表达正确后，使用常规Western-blot进一步证实其表达准确性(见图5)；将扩大培养的菌体进行纯化并测定重组猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗的生物学活性(见图4)，以具有生物学活性为最终判定指标。经过上述构建及鉴定程序后，可将挑选的阳性克隆作为工程菌进行原始种子库的建立及菌种保藏，菌种命名为pRSETB-NFO／BL21(DE3，Plys)。
[0050] 生物学活性检测：将纯化的目标的蛋白分别作系列稀释，稀释度为1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256，分别包被96孔板，4℃过夜；PBST洗涤4次；1％BSA，37℃封闭2小时；PBST洗涤4次；FMDV高免血清稀释50倍，37℃作用两个小时；PBST洗涤4次；
羊抗猪HRP抗体以1：10000稀释，37℃作用1小时；洗涤：PBST洗涤6次；加入底物A和B，室温显色10分钟；终止，450nm读数。重组O型口蹄疫多表位疫苗活性为28。
羊抗猪HRP抗体以1：10000稀释，37℃作用1小时；洗涤：PBST洗涤6次；加入底物A和B，室温显色10分钟；终止，450nm读数。重组O型口蹄疫多表位疫苗活性为28。
[0051] 实施例三工程菌的发酵、纯化与乳化
[0052] 发酵取生产菌种，接种于2ml LB液体培养基中(含100μg／ml氨苄青霉素)，37℃，180rpm振荡培养12小时活化菌种。再以1：100的接种量接入摇瓶，37℃振荡培养至OD600＝3，可按10％比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素。校正溶氧和pH值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37.0℃时，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0±0.1℃，溶氧控制在20％左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体OD600＝1.0～1.2时流加补料
500ml，补料后1小时加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导表达，连续诱导6个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检定表达情况(见图3)。
500ml，补料后1小时加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导表达，连续诱导6个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检定表达情况(见图3)。
[0053] 纯化将收集到的菌体，用包含体洗液I(1％Triton X-100，20mMTris-cl PH8.0)混悬后进行超声，2000W超声裂解1小时。4℃，12000rpm离心收集包含体，并用包含体洗液II(1％DOC，4M尿素，20mMTris-cl PH8.0)混悬二次超声洗涤包含体，二次低温离心收集包含体。包含体沉淀用8M尿素，0.3％β-ME，20mM Tris-cl(pH＝8.00)混匀，室温搅拌4小时，8000rpm低温离心30min，弃去沉淀。变性蛋白1：100稀释，复性液用Tris(PH8.0)缓冲体系，加入0.3M精氨酸，4℃搅拌复性24小时。复性液用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，0.5M咪唑洗脱；再用1.5M(NH4)2SO4、100mM EDTA、pH＝8.5的10mM Na2HPO4平衡上疏水层析柱，再平衡，用pH＝8.5的10mM Na2HPO4洗脱，即得重组口蹄疫疫苗半成品原液。做SDS-PAGE以及WESTERNBLOT印记检定纯化产物是否为目标蛋白(见图4、图5)。
[0054] 乳化将纯化的半成品用灭菌的PBS稀释至200μg／ml。取进口白矿物油佐剂DUOPRIME(医药级)经121℃，灭菌15分钟，备用。按油相：水相＝50：50的比例配制，先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以80-100r／min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水相，加完后再搅拌2min，然后以5500r／min高速循环乳化9min，制成油包水单相疫苗。
[0055] 实施例四抗原有效浓度的研究
[0056] 材料
[0057] 疫苗重组猪O型口蹄疫多表位疫苗由青岛宝麦德生物医药科技有限公司研发中心提供，批号为20090603、20090605和20090608。
[0058] 实验动物选用体重30kg左右，经乳鼠中和试验检测无O型口蹄疫抗体的健康猪130头。
[0059] 种毒OR80
[0060] 攻毒用毒株为OR80和OZK93均由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司提供，-5 -6 -7 -8PBS(PH7.6～7.8，0.04M)将种毒稀释为10 、10 、10 、10 ，每滴度注2ml颈部肌肉注射架子猪4头，观察10日，发现发病猪后要及时隔离。试验结束后，计算种毒对猪的半数感染量-7 -75
ID50，OR80为10 ／2ml，OZK93为10 ／2ml。
ID50，OR80为10 ／2ml，OZK93为10 ／2ml。
[0061] 方法
[0062] 将120头动物分两大组，每大组再分为4小组，不同批号组和对照组，每个批号再分为4个剂量组，对照组注射生理盐水乳化液。疫苗稀释方法、注射剂量、免疫方法、攻毒方法和结果判定方法等参照表1进行。
[0063] 结果
[0064] 各批次不同含量组疫苗免疫猪后，3个批次疫苗在50μg／ml，75μg／ml时都能保持良好的免疫效果，对免疫动物的保护数为60／60。随着疫苗中含量的下降，对靶动物的保护力也在降低，攻毒后保护数处于2／5～3／5。疫苗中抗原浓度增加并未对免疫形成积极的正面效应，反而使保护力降低了，只有20090603组对OZK93的保护数为4／5，其余各组保护数均为3／5。对照组全部发病。详细结果参见表2。
[0065] 表1最佳有效抗原浓度研究方法一览表
[0066]
[0067] 表2不同抗原浓度对靶动物的保护数
[0068]
[0069] 分析与讨论
[0070] 由表2结果可以看出，在疫苗免疫过程中，并非抗原浓度越高越好。抗原浓度适当才能达到最佳的免疫效果。100μg／ml免疫后的保护数反而明显低于50μg／ml和75μg／ml的免疫保护数，说明在高浓度疫苗抗原提呈过程中产生了免疫耐受或免疫抑制。50μg／ml和75μg／ml中等抗原浓度可以为免疫动物提供完全保护(60／60)，从成本上考虑，我们选择50μg/ml为疫苗的最佳有效剂量。最小免疫剂量及PD50试验也表明，我们确定的有效剂量是可靠的，切实可行的，且符合OIE制定的有关口蹄疫的质量标准的要求。
[0071] 实施例五多表位疫苗的效力试验
[0072] 材料
[0073] 重组O型口蹄疫多表位疫苗由宝麦德生物研发中心提供20090603，20090605，20090608多肽疫苗由申联生物医药(上海)有限公司提供，批号为20090521，灭活苗由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司提供，批号为20090308。
[0074] 试验动物挑选品种、来源一致，35日龄左右，经乳鼠中和试验为阴性的健康架子猪，54头由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司试验动物基地提供。-5
[0075] 毒种攻毒用毒株为OR80和OZK93，用PBS(PH7.6-7.8，0.04M)将种毒稀释为10 、-6 -7 -810 10 、10 ，每滴度注2ml颈部肌肉注射架子猪4头，观察10日，发现发病猪后要及时隔离试验结束后，计算种毒对猪的半数感染量ID50。
[0076] 方法
[0077] 重组猪O型口蹄疫多表位疫苗、上海申联多肽合成疫苗以及灭活苗均采用一次免疫方法。
[0078] 将供试的54头猪，分成两大组，OZK93和OR80强毒组，每组再分为6小组，5个免疫组和阴性对照组，免疫组每组5头，阴性对照组每组2头。免疫后观察各组免疫靶动物是否会出现体温波动、食欲异常、焦躁不安、呼吸加快、肌肉震颤、口角出现白沫、鼻腔出血等临床表现。免疫28天后，每头用1000ID50剂量的OR80和OZK93强毒攻击，攻毒方法为耳后肌肉注射；攻毒14天后，观察受试动物临床反应，记录试验结果。同时设阴性对照攻毒组。
[0079] 结果
[0080] 免疫效力接种免疫后，5个批次疫苗免疫组，保护率均为100％，对照组全部发病，表现为典型的口蹄疫病毒感染症状，结果见表3。
[0081] 表3多表位疫苗、多肽疫苗、灭活苗实验室猪体免疫效力
[0082]
[0083] 免疫后观察结果表明，三种疫苗，合成多肽疫苗和多表位疫苗的安全性较好，未发现猪只发热和饮食异常，灭活疫苗有一头猪只出现体温升高，其余免疫动物均未出现体温升高、食欲异常、焦躁不安、呼吸加快、肌肉震颤、口角出现白沫、鼻腔出血等不良临床表现，三组疫苗均未引起动物死亡。
[0084] 讨论
[0085] 理想的疫苗必须安全、有效，同时还应具备价廉、易于推广等优点。虽然FMDV灭活疫苗具有良好的免疫原性，但潜在的不安全性影响了其使用；合成肽疫苗克服了灭活疫苗具有潜在病毒扩散风险的缺点，但是由于是化学合成生产工艺，疫苗的生产成本比灭活苗要高，同时应对病毒变异的灵活性差。而基因工程疫苗具有安全性高，同时可以根据需要制备同一病毒多个成分或多价病毒疫苗，大幅度节约生产成本等优点。因此，FMDV基因工程疫苗是未来的发展方向。公司研发中心根据这种趋势研发出了可以大规模生产的具有高免疫原性的多表位口蹄疫疫苗，它既具有灭活苗的免疫效力，又具有多肽疫苗的安全性。
[0086] 目前，根据2005年版《中国兽药典》《猪O型口蹄疫灭活疫苗质量标准(修改版)》猪O型口蹄疫灭活疫苗能抵抗1000ID50／头同型猪源强毒的攻击即可认为是合格产品。从本试验结果可以看出，重组猪O型口蹄疫多表位疫苗能抵抗1000ID50／头OR80和OZK93强毒的攻击，所有免疫猪对O型强毒攻击的保护数为30／30，而佐剂对照猪4／4发病。
[0087] 多表位疫苗和合成肽疫苗是针对病毒最重要的抗原位点设计，其特异性强，能诱发有效的免疫应答，其有效抗原非常稳定，在生产疫苗的过程中抗原能够准确定量，注射1毫升可以保证动物体产生坚强的保护力。
[0088] 实施例六实验室安全性试验
[0089] 材料
[0090] 疫苗重组猪O型口蹄疫多表位疫苗，批号20090603、20090605、20090608。
[0091] 试验动物(1)体重350～450g豚鼠17只，18～22g小白鼠17只。(2)经乳鼠中和试验检测血清呈O型口蹄疫抗体阴性的35日龄左右健康仔猪34头、临产前30天左右的妊娠母猪12头。
[0092] 方法
[0093] 疫苗对小白鼠的安全性
[0094] 皮下注射小白鼠，每只注射0.5ml，每批疫苗注射5只，共注射15只小白鼠。同时设定2只阴性对照，每只皮下注射生理盐水乳化液0.5ml。连续观察10天，观测小白鼠的健康状况。
[0095] 疫苗对豚鼠的安全性
[0096] 皮下注射试验用豚鼠，每只注射2ml，每批疫苗注射5只，共注射15只。同时各设定2只阴性对照，每只皮下注射生理盐水乳化液2ml。连续观察10天，观测豚鼠的健康状况。
[0097] 疫苗对断奶仔猪的安全性
[0098] (1)一次超剂量免疫
[0099] 经乳鼠中和试验检测血清呈O型口蹄疫抗体阴性的35日龄左右的断奶仔猪17头。其中15头用于注射中心所提供的重组猪O型口蹄疫多表位疫苗，每批疫苗注射5头仔猪，每头耳后肌肉注射2ml疫苗。同时设立阴性对照2头，每头注射生理盐水乳化液2ml，临床观察14天。
[0100] (2)单剂量重复免疫
[0101] 经乳鼠中和试验检测血清呈O型口蹄疫抗体阴性的35日龄左右的断奶仔猪17头。其中15头用于研发中心所提供的重组猪O型口蹄疫多表位疫苗，每批疫苗注射5头仔猪，每头耳后肌肉注射1ml疫苗。同时设立阴性对照2头，每头注射生理盐水乳化液1ml，临床观察14天后，以同样方法再次免疫仔猪，继续观察14天。
[0102] 疫苗对产前4周妊娠母猪安全性
[0103] 每批疫苗耳后肌肉注射母猪3头剂量为2ml。同时设立阴性对照3头，注射50V2佐剂2ml。注射疫苗和生理盐水乳化液后，每天观察母猪的精神、食欲、体温变化情况、流产情况以及生产是否有弱胎、畸形胎儿、死胎和木乃伊胎等情况，连续观察4天。
[0104] 结果
[0105] 疫苗对小白鼠的安全性试验
[0106] 结果见表4，免疫组所有动物的精神、活动、食欲和健康状况无异常，与对照组一致，无死亡发生，可见重组猪O型口蹄疫多表位疫苗对小白鼠是安全的。
[0107] 表4疫苗对小白鼠的安全性试验结果
[0108]组别 动物数量精神 活动 食欲 健康状况 死亡数量
20090603 5 正常 正常 正常 健康状况良好 0
20090605 5 正常 正常 正常 健康状况良好 0
20090608 5 正常 正常 正常 健康状况良好 0
对照组 2 正常 正常 正常 健康状况良好 0
20090603 5 正常 正常 正常 健康状况良好 0
20090605 5 正常 正常 正常 健康状况良好 0
20090608 5 正常 正常 正常 健康状况良好 0
对照组 2 正常 正常 正常 健康状况良好 0
[0109] 疫苗对豚鼠的安全性试验
[0110] 结果见表5，免疫动物精神、活动、食欲和健康状况与对照组一致，无死亡。
[0111] 表5疫苗对豚鼠的安全性试验结果
[0112]组别 动物数量 精神 活动 食欲 健康状况 死亡数量
20090603 5 正常 正常 正常 健康状况良好 0
20090605 5 正常 正常 正常 健康状况良好 0
20090608 5 正常 正常 正常 健康状况良好 0
对照组 2 正常 正常 正常 健康状况良好 0
20090603 5 正常 正常 正常 健康状况良好 0
20090605 5 正常 正常 正常 健康状况良好 0
20090608 5 正常 正常 正常 健康状况良好 0
对照组 2 正常 正常 正常 健康状况良好 0
[0113] 疫苗对断奶仔猪的安全性试验
[0114] 结果见表6和表7，整个试验观察期28天内，所有免疫的共30头断奶仔猪，体温和食欲均正常，没有出现任何临床异常现象，试验结束后，30头仔猪均健活。对照组的4头猪也没有任何不良反应。这说明，无论是一次超剂量免疫还是单剂量重复免疫，重组猪O型口蹄疫多表位疫苗对断奶仔猪是安全的。
[0115] 表6疫苗对断奶仔猪一次超剂量免疫安全性试验结果
[0116]组别 动物数量 体温 食欲 异常状况 死亡数量
20090603 5 正常 正常 无 0
20090605 5 正常 正常 无 0
20090608 5 正常 正常 无 0
对照组 2 正常 正常 无 0
20090603 5 正常 正常 无 0
20090605 5 正常 正常 无 0
20090608 5 正常 正常 无 0
对照组 2 正常 正常 无 0
[0117] 疫苗对产前4周妊娠母猪安全性试验
[0118] 结果见表8和表9，疫苗接种以后对妊娠母猪的体温几乎没有影响，而且各免疫组的体温变化与对照组相比，没有显著性升高(P＞0.05)。各免疫猪在免疫前后变化不明显。
[0119] 表7疫苗对断奶仔猪单剂量重复免疫安全性试验结果
[0120]组别 动物数量 体温 食欲 异常状况 死亡数量
20090603 5 正常 正常 无 0
20090605 5 正常 正常 无 0
20090608 5 正常 正常 无 0
对照组 2 正常 正常 无 0
20090603 5 正常 正常 无 0
20090605 5 正常 正常 无 0
20090608 5 正常 正常 无 0
对照组 2 正常 正常 无 0
[0121] 免疫对妊娠母猪的健康状况和妊娠几乎没有影响，没有引起流产、早产情况，对产仔成绩也几乎没有影响，所产137只仔猪均健康正常。说明疫苗对妊娠母猪是安全的。
[0122] 表8疫苗对妊娠母猪体温的影响
[0123]
[0124] 表9妊娠母猪接种后的身体状况和产仔情况
[0125]
[0126] 讨论
[0127] 重组猪O型口蹄疫多表位疫苗的生产过程中无需接触任何口蹄疫活毒，而且也不用病毒灭活剂，因此安全可靠。同时，所采用的佐剂副作用小，能增强机体对多表位的特异性免疫应答。试验证明，所生产的重组猪O型口蹄疫多表位疫苗对小白鼠、豚鼠、仔猪和妊娠母猪都安全，具有使用的安全性。
[0128] 实施例七对不同毒株交叉免疫保护试验
[0129] 材料
[0130] 疫苗重组猪O型口蹄疫多表位疫苗由宝麦德生物研发中心提供，批号为：20090603，20090605，20090608。
[0131] 试验动物新疆天康畜牧生物技术股份有限公司动物试验基地提供，体重约40kg的长约品种健康架子猪68头，经乳鼠中和试验检测均无O型口蹄疫抗体。
[0132] 试验毒株
[0133] 试验攻毒用毒株为OGD95、OS99、OR80和OZK93均由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司提供，PBS(PH7.6-7.8，0.04M)将种毒稀释为10-5、10-6、10-7、10-8，每滴度注2ml颈部肌肉注射架子猪4头，观察10日，发现发病猪后要及时隔离。试验结束后，计算种毒对猪的半数感染量ID50
[0134] 方法
[0135] 将试验用60头猪随机分为3个批号组，每个批号组再分4个免疫组，每组5头。每头猪用本研发中心提供的猪口蹄疫O型多表位疫苗耳后肌肉注射免疫，免疫剂量为1ml／头(50μg)，免疫28天后攻毒。
[0136] 第一免疫组：在35平方米的猪舍内放入两头用1000ID50OR80毒株攻毒并出现典型口蹄疫症状的猪。同时在猪群中放入两头健康的试验猪作为空白对照组，一起饲养14天，观察发病情况并记录。
[0137] 第二、三、四免疫组：用1000ID50／头OGD95、OS99、OZK93毒株在耳后肌肉注射攻毒，攻毒14天后观察并记录发病情况。并设立2头空白攻毒对照组。
[0138] 结果
[0139] 三个批次多表位疫苗组免疫猪均无死亡等严重临床不良反应，空白对照组全部发病，表现典型的口蹄疫病毒感染临床症状。所有免疫猪既没有出现食欲减退、呕吐、体温升高等传统口蹄疫疫苗免疫后的副反应，所有猪只也没有焦躁不安，呼吸加快等临床表现的过敏反应。
[0140] 对四种病毒的保护数强毒株OGD95、OS99、OR80和OZK93的攻毒保护数均达到了15／15，可见，重组多表位疫苗能够对不同毒株提供交叉保护(见表10)。
[0141] 表10重组猪O犁口蹄疫多表位疫苗攻毒交叉保护试验结果
[0142]
[0143] 讨论
[0144] 目前猪口蹄疫I型疫苗和II型疫苗的生产所使用的毒株OR80、OZK93、OGD95和OS99分别是1980年、1993年、1995年和1999年分离出来的，随时间推移，在近几年口蹄疫爆发流行期间，由于病毒可能发生变异，导致现有疫苗的免疫效果不理想。从表10我们可以看出，研发中心所提供的猪口蹄疫O型多表位疫苗分别对OR80、OZK93、OGD95和OS99具有很好的交叉保护效果。从OR80毒株的同居感染结果可以看出，本中心所提供的疫苗能抵抗强毒的同居感染(15／15)，对照2／2发病；综合实验结果表明重组猪O型口蹄疫多表位疫苗具有很好的保护效力，能够抵抗不同O型流行毒株的攻击。
[0145] 实施例八PD50试验及最小免疫剂量测定试验
[0146] 材料
[0147] 疫苗重组猪O型口蹄疫多表位疫苗由青岛宝麦德生物医药科技有限公司研发中心提供，批号为20090603，20090605，20090608。
[0148] 试验动物挑选体重30kg左右，经豚鼠中和试验无O型口蹄疫抗体的健康猪188头。
[0149] 毒种攻毒用毒株为OR80和OZK93均由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司提供，-5 -6 -7 -8PBS(PH7.6～7.8，0.04M)将种毒稀释为10 、10 、10 、10 ，每滴度注2ml颈部肌肉注射架子猪4头，观察10日，发现发病猪后要及时隔离。试验结束后，计算种毒OR80和OZK93对猪的半数感染量ID50。
[0150] 试验方法
[0151] 第一次动物试验方法
[0152] 94只试验动物共分为两大组，OZK93组和OR80组，每组再分为10小组，每小组动物分组方法，疫苗稀释方法、注射剂量、免疫方法、攻毒方法和结果判定见表11。
[0153] 表11初次试验方法一览表
[0154]
[0155] 第二次试验方法
[0156] 在第一次试验结果的基础上，挑选90头猪用于重复试验。将猪分为两大组，OZK93组和OR80组，每大组再分为三个批次组，每个批次组再分为3个剂量组，0.33ml疫苗组，0.11ml疫苗组，0.037ml疫苗组。同时每个大组设阴性对照2头。免疫方法、攻毒方法和结果判定方法同上。
[0157] PD50计算方法用Reed--Muench法计算PD50值。
[0158] 结果
[0159] ID50检测结果强毒株OR80对猪的半数感染量ID50为10-7／2ml，OZK93对猪的半-7.5数感染量ID50为10 ／2ml。
[0160] 第一次试验结果
[0161] 各批号组疫苗免疫猪后，重组多表位疫苗原倍剂量时能保持良好的免疫效果，随着疫苗的稀释，保护力逐渐下降。通过Reed-Muench计算方法，我们算出针对两种强毒OZK93和OR80的PD50，重组多表位疫苗20090603组与20090608组的1个PD50值为0.19，而20090605组对OR80的PD50值为0.145，含重组VP1蛋白7.5μg。保护情况和PD50详细见表12。
[0162] 第二次试验结果
[0163] 依据第一次测定的试验结果，我们在设计本试验时，直接从1：3倍稀释度的疫苗开始免疫，通过Reed—Muench计算方法，算出针对两种强毒OZK93和OR80，多表位疫苗的1个PD50值仍为0.19ml(含VP1蛋白9.5μg)，与第一次试验结果一致，保护情况和PD50详细结果
[0164] 见表13。
[0165] 表12初次测定PD50试验结果
[0166]
[0167] 表13第二次测定PD50试验结果
[0168]
[0169] 讨论
[0170] 由表12结果可知，在正常使用剂量的情况下，重组猪O口蹄疫多表位疫苗所提供的免疫保护数达到了5／5。口蹄疫灭活疫苗的质量标准规定，疫苗的免疫效力为能抵抗1000ID50／头OR80和OZK93强毒的攻击。从试验结果可以看出，多表位疫苗不仅仅能抵抗
1000ID50／头OR80和OZK93强毒攻击，而且其PD50值比国家规定的灭活疫苗基本要大2.25个PD50。表3同时可以看出，多表位疫苗在注射剂量为0.33ml时，仍具有良好的保护力(4／
5)，因为本疫苗中每毫升的多表位疫苗蛋白含量为50μg。因此，在每头猪注射16.7μg的蛋白时也能提供理想的保护。
1000ID50／头OR80和OZK93强毒攻击，而且其PD50值比国家规定的灭活疫苗基本要大2.25个PD50。表3同时可以看出，多表位疫苗在注射剂量为0.33ml时，仍具有良好的保护力(4／
5)，因为本疫苗中每毫升的多表位疫苗蛋白含量为50μg。因此，在每头猪注射16.7μg的蛋白时也能提供理想的保护。
[0171] 表12和表13的试验结果表明，两次试验的PD50测定结果一致，除20090605批次对OR80为0.145ml／头(7.5μg的VP1蛋白)，均为0.19ml(含多表位疫苗9.5μg)。两次试验的PD50值都远大于OIE规定的3个PD50。依照OIE的标准，以及试验数据，可以看出重组多表位疫苗的最小免疫剂量为每头份的疫苗中至少含有28.5μg的VP1蛋白。本公司生产的疫苗抗原含量为50μg／ml，完全能够满足OIE对口蹄疫疫苗3个PD50的要求。
[0172] 实施例九免疫持续期与抗体消长规律研究试验
[0173] 材料
[0174] 疫苗重组猪O型口蹄疫多表位疫苗由宝麦德生物研发中心提供，批号为20090603、20090605、20090608。
[0175] 试验动物选用品种、来源相同，35目龄左右，经乳鼠中和试验检测O型口蹄疫抗体呈阴性的健康断奶仔猪，240头。
[0176] 试验毒株攻毒用毒株为OR80和OZK93均由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司-5 -6 -7 -8提供，PBS(PH7.6～7.8，0.04M)将种毒稀释为10 、10 、10 、10 ，每滴度注2ml颈部肌肉注射架子猪4头，观察10日，发现发病猪后要及时隔离。试验结束后，计算种毒对猪的半数-7 -7.5
感染量ID50，OR80为10 ／2ml，OZK93为10 ／2ml。
感染量ID50，OR80为10 ／2ml，OZK93为10 ／2ml。
[0177] 方法
[0178] 分组将试验动物随机分为2大组，OZK93组和OR80组，每组105头，每大组再分为3小组，不同批号组，每组35头，每大组设空白攻毒对照组15头，每次攻毒随机抽取2头作为空白攻毒猪。
[0179] 免疫接种免疫接种前对试验猪进行血清学检测，抗体检测为阴性时进行接种。首免后28天进行二免，接种剂量为1ml／头／次，接种方法为耳后肌肉注射，对照用疫苗为合成肽疫苗，接种量为1ml／头。
[0180] 血清抗体检测分别于免疫前、首免后1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、12周、16周、20周、24周和28周随机挑选3～5头免疫动物，采集血清，液相阻断试剂盒检测抗体水平。
[0181] 攻毒首免后4周、8周、12周、16周、20周、24周和28周测定抗体效价后，随机抽取5头按照1000ID50／头强毒OR80和OZK93攻毒。
[0182] 临床观察攻毒后观察试验猪只是否出现典型的口蹄疫感染症状，体温、精神、活动、粪便等是否正常，是否发生死亡等严重临床症状，并统计疫苗的保护数。
[0183] 结果
[0184] 抗体消长规律研究
[0185] 先将不同时期采集的血清按1：4稀释，用液相阻断试剂盒定性检测这些血清，然后根据血清吸光度值(OD值)和临界值与吸光度值的比值(CV／S)(表14和图6)来描绘抗体的变化规律。结果表明，受试动物经过两次免疫后，抗体水平一直呈上升趋势，免疫后7周抗体水平最高。此后，抗体水平开始下降，免疫后7个月，抗体水平已经比较低，但仍可以使多数免疫动物得到保护(见表14)。
[0186] 表14不同时间采集血清的OD值和S／C值
[0187]
[0188] 表15重组猪O型口蹄疫多表位疫苗免疫持续期及攻毒保护数结果
[0189]
[0190] 重组猪O型口蹄疫多表位疫苗两次免疫6个月以后对猪依然具有很好的保护效力(见表15)，第二个月到第7个月，免疫猪的VP1抗体水平处于下降通道(见表14和图6)，至第6个月对OR80攻毒猪的保护数仍为15／15，至第7个月对OR80攻毒猪的平均保护效力明显下降为14／15，对OZK93攻毒猪的保护数至第6个月已经明显开始下降(见表15)。多表位疫苗的攻毒试验结果基本与目前该疫苗的免疫持续期相吻合，到免疫后的第7个月对免疫猪依然有较好的保护效力(见表15)。
[0191] 讨论
[0192] 本次试验用重组猪O型口蹄疫多表位疫苗共免疫包括实验组120头商品猪在内的240头猪，除了首免后24周有一头，28周攻毒的3头试验猪只出现了典型的口蹄疫感染临床症状外，其他免疫攻毒动物均无临床不良反应，既没有出现食欲减退、呕吐、体温升高等传统口蹄疫疫苗免疫后的副反应，所有猪只也没有焦躁不安、呼吸加快、可视黏膜发绀，肌肉震颤，口角出现白沫，鼻腔出血等临床表现的过敏反应，阴性对照组全部发病。
[0193] 从抗体效价检测结果看，重组猪O型口蹄疫多表位疫苗免疫接种后用液相阻断试剂盒检测，两周检测结果为抗体为阴性，三周后抗体水平明显上升，部分呈阳性，第三周40％抗体水平呈阳性。从第四周开始至试验结束抗体检测均为阳性，对供试猪的保护数均＞12／15，并且攻毒的猪只均未表现明显的临床症状及任何严重不良免疫反应。
[0194] 有效抗体滴度可以维持至少7个月，二免后抗体水平迅速增加，二免后三周抗体滴度达到顶峰，此后抗体水平慢慢下降。首免后28周抗体，各批次仍可以对靶动物提供4／5以上的攻毒保护数。
[0195] 为了在田间使用过程中保证本疫苗在田间能抵抗强毒力的流行毒的攻击，使猪群处于最佳免疫状态，我们将免疫持续期定为6个月是可靠、客观和准确的。加强免疫是符合实际需要的，也是符合免疫学原理的。