昆虫抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白及其在植物抗病中的应用

摘要

本发明公开了昆虫抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白及其在植物抗病中的应用。本发明所提供的昆虫抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由1)衍生的蛋白质。抗病性检测的结果显示，ChtSP-Thanatin(S)转基因植物对白粉病菌(Golovinomyces cichoracearum和Erysiphe graminis)、灰霉菌(Botrytis cinerea)及丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)皆具有明显的抗性。证明Thanatin(S)在控制植物真菌和细菌病害方面效果显著，具有一定应用前景。

权利要求

1.一种融合蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列1。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。

5.含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。

6.含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。

8.根据权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在pGWB11载体的att R位点插入了权利要求2或3所述编码基因得到的重组表达载体。

9.根据权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在pAHC25载体的SmaI和SacI酶切位点间插入了权利要求2或3所述编码基因得到的重组表达载体。

10.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入目的植物中，得到与所述目的植物相比，抗病菌能力提高的转基因植物；所述目的植物为拟南芥或小麦；所述抗病菌能力为对拟南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)、灰霉菌(Botrytis cinerea)、丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)和/或小麦白粉菌(Erysiphe graminis)的抵抗力。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求7-9中任一所述的重组表达载体导入目的植物中的。

说明书

昆虫抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白及其在植物抗病中的应

用

技术领域

[0001] 本发明涉及昆虫抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白及其在植物抗病中的应用。

背景技术

[0002] 植物在完成其生活史的过程中，随时面临着环境病原微生物的威胁。在全球范围内，由细菌、真菌和病毒引起的植物病害所造成农作物产量的损失每年高达300-500亿美元。化学药剂防治仍是控制农作物病害的一项重要策略，但这一策略给人类健康和环境保护带来明显的威胁。传统育种方法对抗病品种选育做出了最为重要的贡献，但由于植物本身抗病基因有限和单个抗病基因所介导的抗病性具有高度专化性，抗病谱较窄，只能抗有限的小种，以致病原菌群体发生变化时，就面临抗性丧失的风险，从而无法满足农作物病害防治的需要。如何将当今各种生物基因组的丰富资源和高效的基因操作技术，系统地应用于农作物抗性的改良，是当今转基因工程的一个热点和焦点问题。更为重要的是，植物基因工程可以在不改变植物已有优异基因型的情况下引入抗病性表型，为获得新的抗病品种提供了更为强大的手段，成为农业可持续性发展的重要策略之一。

[0003] 植物本身可产生多种抗菌肽，但研究发现植物来源的抗菌肽基因的表达只对病原菌产生中等程度抗性，这是由于经过长期的病原与寄主的相互作用和进化，植物病原菌已经对这些植物抗菌肽产生了耐受性。因此，非植物来源的抗菌肽基因在植物抗病领域的应用越来越受到重视。

[0004] 昆虫抗菌肽对细菌、真菌、病毒等表现广谱抗性，抗菌性强、抗菌效果快。据Shai-Matsuzaki-Huanf模型，多数抗菌肽的作用机制都是基于多肽与磷脂相互作用引起细胞膜破裂而导致细胞损伤。由于抗菌肽作用于磷脂类而非酶类，因此，很少有病原对抗菌肽产生抗性。这些特点使得抗菌肽在培育抗性作物方面具有诱人的潜力。

[0005] 目前已发现昆虫抗菌肽可以抑制许多农业生产中非常重要的植物病原真菌和细菌，如白粉病菌、稻瘟病菌、灰葡萄孢等真菌和丁香假单孢菌、胡萝卜软腐欧氏杆菌、水稻白叶枯病菌等细菌。通过转基因技术将抗菌肽导入植物中表达，可使作物对植物病原细菌和真菌产生有效抗性。在我国，已有将抗菌肽基因在马铃薯、烟草、水稻、辣椒、番茄等植物中成功表达并获得抗病株系的报道。然而，目前应用于转基因植物中的昆虫抗菌肽主要是天蚕素基因，而其他绝大多数抗菌肽在转基因植物中的抗病功能还没有测试。

[0006] Thanatin是目前发现的最小的抗菌肽，仅含有21个氨基酸残基，它来自于半翅目昆虫刺肩蝽(Podisus maculiventris)。Thanatin具有广谱的抗菌活性，对真菌、G+和G-均表现出抗菌活性(Fehlbaum P P，Bulet et al.(1994).″Insect immunity.Septic injury of Drosophila induces the synthesis of a potent antifungal peptide with sequence homology to plant antifungal peptides.″J Biol Chem 269(52)：33159-63.)。其氨基酸序列为GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM，前三个氨基酸对抗菌活性影响不大，而后六个氨基酸(C端疏水区)形成一个环，对抗菌活性影响较大；对不同的菌具有浓度效应。可能作用于细菌的脂多糖，形成沉淀。将T换成S或去除，活性增强(Wu，G.Q.，J.X.Ding，et al.，2009)。没有溶血性，对人和动物没有毒性。目前，对于Thanatin在植物病害控制方面研究的较少。

[0007] 拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科，基因组很小，但其2.5万基因在功能类别上却和其他开花植物大致相似；拟南芥生命周期很短，从播种到种子收获仅需要6～8周；拟南芥个体较小，适合于实验室内种植；这些特点使得拟南芥成为一种理想的植物遗传学和分子生物学研究材料。此外，拟南芥在接种条件下可以被多种不同的植物病原细菌、真菌及病毒等侵染，这非常有利于研究植物与病原菌互作。小麦是重要的粮食作物，对其进行基因工程操作以提高其抗病能力将对小麦的抗病育种起到较大的推动作用。

发明内容

[0008] 本发明的一个目的是提供一种昆虫抗菌肽thanatin(S)融合蛋白。

[0009] 本发明所提供的融合蛋白，名称为ChtSP-Thanatin(S)，是如下1)或2)的蛋白质：

[0010] 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0011] 2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由1)衍生的蛋白质。

[0012] 本发明的另一个目的是提供所述融合蛋白的编码基因。

[0013] 本发明所提供的所述融合蛋白的编码基因(命名为ChtSP-Thanatin(S))，为如下1)-3)中任一所述的基因：

[0014] 1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

[0015] 2)在严格条件下与1)的基因杂交且编码所述融合蛋白的基因；

[0016] 3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述融合蛋白的基因。

[0017] 上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

[0018] 序列表中的序列1由123个碱基组成，自5’端第1位-60位为水稻几丁质酶Cht-1的信号肽的编码序列，第61位-123位为昆虫抗菌肽thanatin(S)的编码序列。

[0019] 含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

[0020] 所述重组表达载体为在pGWB11载体的attR位点插入了所述编码基因得到的重组表达载体。

[0021] 所述重组表达载体为在pAHC25载体的SmaI和SacI酶切位点间插入了所述编码基因得到的重组表达载体。

[0022] 本发明的又一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

[0023] 本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将所述编码基因转入目的植物中，得到与所述目的植物相比，抗病菌能力提高的转基因植物。

[0024] 所述编码基因是通过权所述重组表达载体导入目的植物中的。

[0025] 所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥；所述单子叶植物为小麦。

[0026] 所述病菌为拟南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)、灰霉菌(Botrytis cinerea)、丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syrmgae pv.tomato)和/或小麦白粉菌(Erysiphe grammis)。

[0027] 将水稻几丁质酶Cht-1的信号肽连接到thanatin(S)的N端，并对这一融合结构进行密码子优化，使其有利于在植物中高表达，随后，将其构建到Gateway载体系列的pGWB11(C端连FLAG标签)以及小麦转化载体pAHC25中。抗病性检测的结果显示，ChtSP-Thanatin(S)转基因植物对白粉病菌(Golovinomyces cichoracearum和Erysiphe grammis)、灰霉菌(Botrytis cinerea)及丁香假单胞菌(Pseudomonas syrmgae)皆具有明显的抗性。证明thanatin(S)在控制植物真菌和细菌病害方面效果显著，具有一定应用前景。

[0028] 本发明采用转基因技术将序列表中序列1所示的融合基因转入植物提高植物的抗病性，这是传统育种技术所无法做到的。本发明利用植物源外的基因来提高植物的抗病性，为植物病害控制提供了一条新途径，若将其融入到作物育种程序将有广阔的前景。

附图说明

[0029] 图1为ChtSP-Thanatin(S)融合基因在转基因拟南芥中的表达分析结果；其中，图1中A为重组载体pGWB11：ChtSP-Thanatin(S)的部分结构示意图；图1中B为对转基因拟南芥植株T1的15个株系用PCR检测Thanatin(S)基因整合到基因组上的结果；图1中C为对转基因拟南芥植株T2的7个株系用real-time PCR检测Thanatin(S)基因转录水平的结果；图1中D为选择转录水平较高的3个株系用western blot技术检测ChtSP-Thanatin(S)-FLAG的蛋白水平表达结果。

[0030] 图2为ChtSP-Thanatin(S)转基因拟南芥对白粉菌抗性的检测结果；其中，图2中A为接种后12天转基因拟南芥line 1、line 6和line 7和野生型Col-0感染白粉菌的表型结果；图2中B为接种后6天拟南芥叶片上的原始单孢子；图2中C为拟南芥叶片上单孢所产生的孢子数统计结果。

[0031] 图3为ChtSP-Thanatin(S)转基因拟南芥对灰霉菌的抗性检测结果；其中，图3中A为转基因拟南芥line 1、line 6和line 7以及野生型对照Col-0的表型，图3中B为转基因拟南芥line 1、line 6和line 7以及野生型对照Col-0的病斑面积的统计分析结果。

[0032] 图4ChtSP-Thanatin(S)转基因拟南芥对丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000的抗性检测结果；其中，图4中A为转基因拟南芥line 1、line 6和line 7以及野生型对照Col-0的叶片接种后2天的表型，图4中B为转基因拟南芥line 1、line 6和line 7以及野生型对照Col-0叶片接种后2天化学发光光子数的测定结果。

[0033] 图5为重组载体p AHC25：ChtSP-Thanatin(S)-FLAG的部分结构示意图。

[0034] 图6转ChtSP-Thanatin(S)-FLAG融合基因的小麦接种小麦白粉菌(Erysiphe grammis)7天后的抗病表型。

具体实施方式

[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0037] 实施例一、转基因拟南芥的获得及其检测

[0038] 一、ChtSP-Thanatin(S)融合基因在转基因拟南芥中的表达分析

[0039] 1、遗传转化载体的构建

[0040] 采用的农杆菌转化载体为gateway系列中的pGWB11载体(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Nakagawa，T.，Kurose，T.，Hino，T.，Tanaka，K.，Kawamukai，M.，Niwa，Y.，Toyooka，K.，Matsuoka，K.，Jinbo，T.and Kimura，T.(2007)Development of series of gateway binary vectors，pGWBs，for realizing efficient construction of fusion genes for plant transformation.J.Biosci.Bioeng.104，34-41.)，该载体携带能够组成型表达的花椰菜花叶病毒启动子(CaM35S promoter)，能够组成型表达目标基因。转化所用农杆菌为GV3101菌株(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Van Larebeke N，Engler G，Holsters M，Van den Elsacker S，Zaenen I，Schilperoort RA，Schell J(1974)Large plasmid in Agrobacterium tumefaciens essential for crown gall-inducing ability.Nature 252：169-170.)。

[0041] 先将经过密码子在线软件http://www.jcat.de/和http://miracle.igib.res.in/dynavac/优化过的ChtSP-Thanatin(S)基因融合序列委托genescript公司合成，此序列被连接到pUC57载体(购自南京金斯瑞生物科技有限公司，产品目录号为SD1176)上。以pUC57：ChtSP-Thanatin(S)为模板，用以下引物经过PCR扩增，上游引物：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTGCTCTAGAGCCACCATGAGAGCGCTC-3’和下游引物：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCGGCTGTACACATTCTTTGACATTTTC-3’，扩增产物在华大基因公司进行测序。测序结果表明，获得的融合基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，编码具有序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的融合蛋白，序列表中序列2由41个氨基酸残基组成。序列表中序列1自5’端第1位-60位为水稻几丁质酶Cht-1的信号肽的编码序列，第61位-123位为昆虫抗菌肽thanatin(S)的编码序列。将该融合基因命名为ChtSP-Thanatin(S)，将其编码的融合蛋白命名为ChtSP-Thanatin(S)。

[0042] 将测序正确的PCR产物与pDONR207载体(购自Invitrogen，产品目录号为12213013)以及Gateway BP Clonase酶混合物(购自Invitrogen，产品目录号为11789-021)于25℃共同孵育，得到重组载体pDONR207：ChtSP-Thanatin(S)。将该重组载体转化感受态大肠杆菌DH10B(购自北京百泰克生物技术有限公司，产品目录号为DP77)，卡纳霉素平板筛选获得阳性克隆，扩繁，提取质粒。再将pDONR207：ChtSP-Thanatin(S)、pGWB
11和Gateway LR Clonase酶混合物(购自Invitrogen，产品目录号为11791-043)于25℃共同孵育，获得重组表达载体pGWB11：ChtSP-Thanatin(S)。将该重组表达载体转化大肠杆菌DH10B(购自北京百泰克生物技术有限公司，产品目录号为DP77)，潮霉素平板筛选阳性克隆，扩繁，提取质粒并送华大基因公司测序。测序结果表明，在pGWB11载体的attR位点插入了序列表中序列1所示的编码基因，证明重组质粒构建正确(图1中A)。

[0043] 将pGWB11：ChtSP-Thanatin(S)转化农杆菌GV3101感受态，潮霉素平板筛选并通过菌落PCR反应鉴定(引物同上文所述)阳性克隆，扩繁，用于转化野生型拟南芥Col-0。

[0044] 2、遗传转化和T1代转化植株的分析

[0045] 采用花序浸泡法将GV3101携带的pGWB11：ChtSP-Thanatin(S)转化拟南芥生态型Col-0(购自美国俄亥俄州立大学的生物资源中心(ABRC)，产品目录号为CS39005)。

[0046] 花序浸泡法具体步骤为：将花序在OD600＝0.6～0.8的农杆菌悬液(0.5％蔗糖，0.02～0.05％Sliwet L-77)中浸泡30秒左右，转化后的植株用黑色塑料袋避光保湿放置
16-24小时，然后在9小时光照/15小时黑暗、温度为22℃的植物生长间进行培养，直到种子成熟。收获的种子播种于含潮霉素的平板上，筛选获得阳性转化株。

[0047] 同时，用上述方法得到转空载体pGWB 11对照拟南芥植株。设未转化的拟南芥Col-0为野生型对照拟南芥植株。

[0048] 对获得的pGWB11：ChtSP-Thanatin(S)转化获得的拟南芥T1代中的15个株系(Line1-15)的基因组DNA进行Thanatin(S)的PCR检测。PCR检测所用的引物序列为：5’-ATCTAAAAAACCTGTTC-3’和5’-CATTCTTTGACATTTTCCAG-3’。

[0049] 结果：被检测的pGWB11：ChtSP-Thanatin(S)独立转化植株中除了株系5(L5)外，其余14个株系均能扩增出目的条带；野生型对照拟南芥Col-0植株未扩增出目的条带(图1中B)。

[0050] 为了 解Thanatin(S)在 转 基因 拟 南芥 中是 否 转录 表 达，对PGWB11：ChtSP-Thanatin (S)独立转化植株T2中的7株进行了Real-time PCR检测，所用的引物序列如下：5’-ATCTAAAAAACCTGTTC-3’和5’-CATTCTTTGACATTTTCCAG-3’。

[0051] 结果表明目的基因在转基因植物L1-L8中均能转录表达，而在野生型对照拟南芥植株Col-0中不能转录表达(图1中C)。

[0052] 为了进一步研究ChtSP-Thanatin(S)融合蛋白在转基因拟南芥中的翻译表达情况，对转录水平较高的株系1(L1)、株系6(L6)和株系7(L7)进行了western blot检测，抗体为鼠抗FLAG抗体(购自sigma公司，F1804)。

[0053] 结果显示，ChtSP-Thanatin(S)融合蛋白在转基因拟南芥L1、L6和L7中均能翻译表达，而在野生型对照拟南芥植株Col-0中不能翻译表达(图1中D)。

[0054] 二、ChtSP-Thanatin(S)转基因拟南芥对白粉菌的抗性分析

[0055] 对ChtSP-Thanatin(S)融合蛋白在转基因拟南芥中翻译表达较高的株系1(line 1))、株系6(line 6)和株系7(line 7)接种拟南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Yiping Wang，Marc T.Nishimura，Ting Zhao，Dingzhong Tang.2011.ATG2，an autophagy-related protein，negatively affects powdery mildew resistance and mildew-induced cell death in Arabidopsis.The Plant Journal，68，10：74-87)。接种方法为：用吹风机将白粉菌孢子吹进高1米左右的密闭容器内，静置1小时以上，孢子可以均匀散落于密闭容器内的拟南芥叶片上。接种后6天取叶片用trypan blue染色(图2中B，红色箭头所指的是原始单孢子)，在显微镜下观察单孢所产生的孢子数，计数并进行统计分析，结果见图2中C，结果表明ChtSP-Thanatin(S)转基因拟南芥line 1、line 6和line
7与野生型Col-0相比对白粉菌具有显著的抗性。接种后12天，拍摄Col-0、line 1、line
6和line 7感染白粉菌的表型照片，见图2中A，从图中可见，ChtSP-Thanatin(S)转基因拟南芥line 1、line 6和line 7较野生型对照Col-0具有明显的抗性。转空载体对照植株与野生型对照植株的表型一致。

[0056] 三、ChtSP-Thanatin(S)转基因拟南芥对灰霉菌的抗性分析

[0057] 对ChtSP-Thanatin(S)融合蛋白在转基因拟南芥中翻译表达较高的株系1(line1)、株系6(line6)和株系7(line7)接种灰霉菌(Botrytis cinerea)(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Yiping Wang，Marc T.Nishimura，Ting Zhao，Dingzhong Tang.2011.ATG2，an autophagy-related protein，negaively affects powdery mildew resistance and mildew-induced cell death in Arabidopsis.The Plant Journal，68，(10)：74-87)。接种方法为：取叶片平铺于0.8％琼
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脂平板上，将浓度为5×10spores/ml的灰霉菌孢子悬浮液10μL滴至叶片中央。22℃保湿3天后观察表型，拍照并测量病斑直径和进行统计分析。结果见图3，图3中A为转基因拟南芥line 1、line 6和line 7以及野生型对照Col-0的叶片病斑表型，图3中B为转基因拟南芥line 1、line 6和line 7以及野生型对照Col-0的病斑直径的统计分析结果。
结果表明Thanatin(S)转基因拟南芥的三个株系line 1、line 6和line 7较野生型对照Col-0对灰霉菌具有显著的抗性。转空载体对照植株与野生型对照植株的表型一致。

[0058] 四、ChtSP-Thanatin(S)转基因拟南芥对丁香假单胞杆菌番茄致病变种的抗性分析

[0059] 所用菌株为带有化学发光报告基因的丁香假单胞杆菌番茄致病变种菌株DC3000(luxCDABE-tagged Pseudomonas syrmgae pv.tomato DC3000)(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Jun Fan，Casey Crooks，Chris Lamb.2008.High-throughput quantitative luminescence assay of the growth in planta of Pseudomonas syrmgae chromosomally tagged with Photorhabdus luminescens luxCDABE.The Plant Journal，53，(2)：393-399，January 2008)。用1ml无针头注射器将浓度为OD600＝0.002的菌悬液注射接种Thanatin(S)转基因拟南芥株系和野生型的叶片，2天后取叶片，拍照并测定菌量。菌量的测定方法如下：用打孔器取3枚面积为0.6cm2的叶片置于1.5ml离心管，加入200ul 10mM MgCl2溶液，将叶片研磨成均匀的悬液，直接放入FB12 luminometer(Berthold Detection Systems，http://www.berthold-ds.com/)测定光子数。结果如图4所示，图4中A为转基因拟南芥line 1、line 6和line 7以及野生型对照Col-0的叶片接种后2天的表型，图4中B为转基因拟南芥line 1、line
6和line 7以及野生型对照Col-0叶片接种后2天化学发光光子数的测定(请说明图4中B纵坐标所示的荧光量的计算公式)，结果显示，ChtSP-Thanatin(S)转基因拟南芥的三个株系line 1、line 6和line 7比野生型对照Col-0对丁香假单胞杆菌番茄致病变种具有明显的抗性。转空载体对照植株与野生型对照植株的表型一致。

[0060] 实施例2、Thanatin(S)转基因小麦的获得及其对小麦白粉菌的抗性分析[0061] 一、遗传转化载体的构建

[0062] 转化小麦采用的载体为pAHC25(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Christensen AH，Quail PH.1996.Ubiquitine promoter-based vectors for highlevel expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants.Transgenic Research 5：213-218.)。首先采用限制性内切酶SmaI和SacI双酶切，将pAHC25中的GUS序列去除，回收载体大片段；以pGWB11：ChtSP-Thanatin(S)为模板，PCR扩增为ChtSP-Thanatin(S)-FLAG融合基因序列，扩增产物也用SmaI和SacI双酶切，PCR扩增所用引物为：5’-TATCCCCCGGGAACAAGTTTG-3’和5’-TACGAGCTCCTAAGCCTTGTC-3’。然后将酶切后的PCR产物与回收的载体大片段用T4连接酶链接，即获得含有目的基因的重组转化载体pAHC25：ChtSP-Thanatin(S)-FLAG。将该重组载体转化大肠杆菌DH10B(购自北京百泰克生物技术有限公司，产品目录号为DP77)，氨苄平板筛选阳性克隆，扩繁，提取质粒并送华大基因公司测序。测序结果表明，在pAHC25载体的SmaI和SacI酶切位点间插入了序列正确的序列表中序列1所示的编码基因(图5中A)。

[0063] 将载体pAHC25：ChtSP-Thanatin(S)-FLAG用基因枪法转化小麦品种科农199(KN199)(国审麦2006017，良种繁育阶段)(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：李俊明，张相岐，张爱民，王志国，安调过，纪军，王静，2007，高产广适小麦新品种--科农199.麦类作物学报，27(2)：368)，最终获得
14个转基因株系，PCR方法检测证明有8个株系为阳性(图5中B)，所用的引物序列为：
5’-ATCTAAAAAACCTGTTC-3’和5’-CATTCTTTGACATTTTCCAG-3’。

[0064] 同时，用上述方法得到转空载体pAHC25对照小麦植株。设未转化的小麦科农199为野生型对照小麦植株。

[0065] 二、ChtSP-Thanatin(S)转基因小麦T0对小麦白粉菌的抗性分析

[0066] 将T0代的5个株系(L5、L8、L10、L11、L13)的转基因小麦苗和对照KN199采用离体叶段法接种小麦白粉菌(Erysiphe grammis)(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：万平，令利军，周文娟，张文俊，凌宏清，朱立煌，张相岐。2004.小麦锌指蛋白基因的克隆、序列与表达分析。遗传学报，Vol 31，(9)：895-900)。首先制备含50mg/L苯并咪唑的0.5％琼脂平板切除中部3cm宽的部分，剪取4cm左右的待接种叶片，两端插入琼脂切面，将白粉菌孢子均匀抖落至叶片上，于17℃、85％相对湿度、2000lx光照强度培养，7天后，观察抗病表型并拍照。有5个株系(L5、L8、L10、L11、L13)的叶片，对小麦白粉菌的抗性显著高于对照KN199，结果如图6所示。转空载体对照植株与对照KN199植株的表型一致。