靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA799及其应用

摘要

本发明公开了一种靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA799及其应用。PPP2R5C-siRNA799的正义链为5’-GCAUAGCAGAGUUACUGGAAAUAUU-3’；反义链为5’-AAUAUUUCCAGUAACUCUGCUAUGC-3’。PPP2R5C-siRNA799能高效抑制PPP2R5C基因的表达，mRNA的下调程度达到2～4倍，蛋白表达明显得到抑制；同时其能有效抑制肿瘤性T细胞的增殖。本发明所提供的siRNA对于开发新的抗T细胞肿瘤基因药物和提高T细胞肿瘤的治疗效果有重要的意义，具有很大的应用前景和经济价值。

权利要求

1.一种靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA799，其特征在于：其核糖核酸序列如下：正义链：5’- GCAUAGCAGAGUUACUGGAAAUAUU -3’；

反义链：5’- AAUAUUUCCAGUAACUCUGCUAUGC -3’。

2.权利要求1所述靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA799的应用，其特征在于：所述的PPP2R5C-siRNA799用于制备抑制PPP2R5C基因表达的制剂。

3.权利要求1所述靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA799的应用，其特征在于：所述的PPP2R5C-siRNA799用于制备治疗T细胞白血病的药物。

说明书

靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的

PPP2R5C-siRNA799及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种siRNA，特别涉及一种靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA799及其应用。

背景技术

[0002] 血液肿瘤是发病率较高的恶性肿瘤之一，每年全国约有10万初发病人，严重危害人们、尤其是青少年的健康。T细胞肿瘤是血液肿瘤的一种主要类型，主要由于T细胞恶性克隆增殖而形成，包括多种类型的T细胞白血病和淋巴瘤，多数恶性程度高，治疗效果差，预后不良。临床治疗上一直存在难治疗、耐药和易复发等难题，因此寻找更有效和特异的治疗方案一直是研究者的一个重要目标。随着对肿瘤细胞分子特点的逐渐明确，不断发现肿瘤T细胞特异的分子，设计和研制有效的靶向治疗药物，成为提高T细胞肿瘤治疗效果的一个重要手段。

[0003] PPP2R5C基因是在1996年被发现并克隆出来的。是蛋白磷酸酶2A(PP2A)的一个亚单位，在调节细胞增殖、分化和转化等过程中具有重要作用，目前研究认为其属于一种抑癌基因。近期研究提示其表达模式的改变与细胞恶性转化相关，我们的前期研究也发现PPP2R5C在T细胞肿瘤中有异常高表达情况。

[0004] 近年来，利用RNA干扰技术，将化学合成的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转导至特定的细胞，沉默相关基因的表达，是研究基因功能最有效的手段之一，也是靶向基因治疗最有吸引力的方法之一。选择特异性的靶基因合成有效的siRNA，并且选择合适转染方式，使其在宿主细胞中高效作用，是实施这一靶向治疗措施的重点。靶向针对PPP2R5C基因的siRNA序列对于开发新的抗T细胞肿瘤基因药物和提高T细胞肿瘤的治疗效果有重要的意义，具有很大的应用前景和经济价值。

发明内容

[0005] 本发明的首要目的在于提供一种靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的siRNA，名称为PPP2R5C-siRNA799。

[0006] 本发明的另一目的在于提供上述PPP2R5C-siRNA799的应用。

[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA799，核糖核苷酸序列如下所示：

[0008] 正义链：5’-GCAUAGCAGAGUUACUGGAAAUAUU-3’；

[0009] 反义链：5’-AAUAUUUCCAGUAACUCUGCUAUGC-3’。

[0010] 所述的靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA799用于制备抑制PPP2R5C基因表达的制剂。

[0011] 所述靶向抑制PPP2R5C基因表达的siRNA应用于制备治疗T细胞肿瘤的药物。

[0012] 所述T细胞肿瘤为T细胞白血病。

[0013] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0014] 1、本发明所提供的PPP2R5C-siRNA799能高效抑制PPP2R5C基因的表达，mRNA的下调程度达到2～4倍，蛋白表达明显得到抑制，如图2和图3所示。

[0015] 2、本发明所提供的PPP2R5C-siRNA799能有效抑制肿瘤性T细胞的增殖，如图4所示。

[0016] 3、本发明所提供的PPP2R5C-siRNA799对于开发新的抗T细胞肿瘤基因药物和提高T细胞肿瘤的治疗效果有重要的意义，其具有很大的应用前景和经济价值。

附图说明

[0017] 图1是实施例1中通过流式细胞仪检测Molt-4细胞转染效率图，其中：

[0018] A为转染Alexa Red Oligo的柱形图；

[0019] B为对照组的柱形图。

[0020] 图2是实施例2的实验组和对照组的实时定量PCR结果图。

[0021] 图3是实施例2的实验组和对照组的Western Blot图(RNA干扰后48h)。

[0022] 图4是通过Annexin V/PI双染后流式细胞仪得到的实验组和对照组的细胞凋亡图。

具体实施方式

[0023] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0024] 实施例1

[0025] siRNA的合成和转染T淋巴细胞白血病细胞株(Molt-4)(购自中科院上海细胞所)细胞条件的稳定，具体步骤如下：

[0026] (1)设计和得到siRNA

[0027] 在GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)里 查 找PPP2R5C 基因序列(ACCESSION NM 178587)，然后根据Invitrogen公司(www.invitrogen.com)提TM供的Stealth RNAi设计法则，在线设计针对PPP2R5C的siRNA。本发明所涉及的靶向抑制PPP2R5C基因表达的siRNA是从PPP2R5C基因序列799bp开始的25nt siRNA(称为siRNA-799)，同时设计与目的基因序列无同源性的无关序列siRNA(non-silencing scrambled control，SC，25nt)为对照组，siRNA均由美国Invitrogen公司化学合成。

[0028] siRNA-799的序列如下：

[0029] 正义链序列：5’-GCAUAGCAGAGUUACUGGAAAUAUU-3’；

[0030] 反义链序列：5’-AAUAUUUCCAGUAACUCUGCUAUGC-3’。

[0031] 无关序列siRNA的序列如下：

[0032] 正义链序列：5’-UAGUCUACCUAGCUUAACCCAGUAA-3’；

[0033] 反义链序列：5’-UUACUGGGUUAAGCUAGGUAGACUA-3’。

[0034] (2)准备处于对数生长期的Molt-4细胞

[0035] 将Molt-4细胞接种于含体积分数10％新生牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI1640培养基中，在含体积百分数5％CO2的培养箱37℃连续培养，2～3天传代一次，得到处于对数生长期的Molt-4细胞。

[0036] (3)PPP2R5C-siRNA799转染Molt-4细胞

[0037] A、收集2.5×106个Molt-4细胞，200g离心10min，完全去除上清；

[0038] B、用100μl预热至室温的NucleofectorTM Solution和Supplement混合液(Amaxa，德国)悬浮细胞；

[0039] C、加入100nM Alexa Red Oligo(Invitrogen，美国)，混匀后加入核转杯(Amaxa，德国)，启动Molt-4特异性程序C-005；同时设置对照组，对照组与转染Alexa Red Oligo的步骤相同，但是没有加入Alexa Red Oligo；

[0040] D、程序完成后立刻用核转染试剂盒(Amaxa，德国)里配套的移液器将转染后的细胞液接种于培养瓶中，终体积为5ml；

[0041] E、放入培养箱10小时后利用荧光显微镜和流式细胞仪检测荧光值，分析转染效率。

[0042] 通过荧光显微镜和流式细胞仪检测的结果如图1所示，可见通过上述转染方法的转染效率稳定在56.2±14.14％。

[0043] 实施例2

[0044] 将siRNA-799转染Molt-4细胞后，检测PPP2R5C基因在mRNA和蛋白水平的表达，明确其干扰效应。

[0045] (1)实验分组：实验组为转染siRNA-799，对照组分别为无关序列对照组(SC)、转染条件对照组(MOCK)和空白对照组(NC)，实验方法同实施例1步骤(3)，各组的siRNA量均为3μg。转染条件对照组系不加入siRNA，其余处理条件同实验组，空白对照组是未经任何实验处理的细胞。

[0046] (2)荧光实时定量PCR检测：分别收集各组转染后24h、48h和72h的细胞，按照TRIZol试剂盒(invitrogen，USA)说明书操作步骤提取RNA，并使用AMMLV(promega，USA)和OLIGO dT合成cDNA(根据AMMLV的说明书操作)。应用于荧光实时定量PCR的引物序列见表1，以β2M基因作为内参照。总反应体积为20μl，包括Real Master Mix 9μL，上、下游引物的终浓度分别为0.5μmol/L以及1μlcDNA。在95℃、3min变性后，共进行40循环-ΔCt扩增，每一循环包括95℃、10s和62℃、30s。采用相对定量法(2 ×100％，ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因)计算PPP2R5C mRNA的相对表达量。结果显示，转染后24h、48h和72h，与各对照组相比，siRNA-799组PPP2R5C的mRNA表达水平均明显下调，下调倍数约为2～4倍不等(如表2和图2所示)。

[0047] 表1应用于实时定量PCR的引物序列

[0048]

[0049] 表2：实时定量PCR检测转染后PPP2R5C基因mRNA水平变化

[0050]

[0051] *：P＜0.05 siRNA-799 VS 其余各组

[0052] (3)蛋白水平检测：分别收集转染后48h和72h的细胞，应用蛋白裂解液试剂盒，提取总蛋白，Western blot ECL发光法显影成像、分析转染后各组PPP2R5C蛋白水平的表达情况。具体方法如下：6

[0053] A、收集各组不同时间段的细胞，数目为1×10 个，用RIPA蛋白提取试剂盒(碧云天，上海)提取总蛋白；

[0054] B、SDS-PAGE电泳：将各组样品按常规方法定量并变性后加样于10％的SDS-PAGE胶中(每孔加样量约为30μg)，恒压80V，30min后改为100V，60min；

[0055] C、转膜：将切好的PVDF膜(PALL，美国)和脱脂棉预先泡在转膜液中15～30min，用半干转仪(Bio-Rad，美国)按照安全盖+电转盖+脱脂棉+SDS-PAGE胶+PVDF膜+脱脂棉+电机板的顺序从上向下排列，恒压10V，25min；

[0056] D、封膜：用浓度为30g/L脱脂奶粉作为Blocking Reagent(封闭试剂)封膜2h后用0.05％PBST洗涤液{500μl吐温-20(SIGMA，USA)+1L PBS，PBS的浓度为0.01mol/L、pH值为7.4}洗涤3次，每次5min。

[0057] E、一抗、二抗的孵育：将PVDF膜按所需要的蛋白分子量大小(β-actin为42kD，PPP2R5C蛋白为61kD)和预染Marker的位置剪成两条，分别放入体积比1∶500的小鼠抗人β-actin一抗(武汉博士德公司)和体积比1∶200的兔抗人PPP2R5C一抗(Santa，美国)4℃过夜，或37℃1h后用0.05％PBST洗涤液洗涤3次，每次5min。再分别放入体积比1∶500的羊抗小鼠和羊抗兔二抗(eBioscience，美国)37℃孵育1h，用0.05％PBST洗涤液洗涤3次，每次5min；

[0058] F、ECL显色：通过ECL显色试剂盒显色(碧云天，上海)，经化学发光后观察内参β-actin和目的蛋白PPP2R5C的表达量，最后利用UVI Alliance 4.7凝胶成像仪(UVI，UK)进行拍照，根据实验结果调整曝光时间。

[0059] Western blot结果(见图3)显示，与各对照组相比，转染后48h后siRNA-799组PPP2R5C蛋白水平表达均明显下调，与SC组相比，蛋白表达明显得到抑制即本发明提供的靶向抑制PPP2R5C基因表达的siRNA能有效下调Molt-4细胞中PPP2R5C基因的表达。

[0060] 实施例3

[0061] 此实施例表明了siRNA-799下调Molt-4细胞PPP2R5C表达后所产生的生物学效应。包括形态学变化、细胞增殖和凋亡和细胞周期的变化等。4

[0062] (1)形态学变化：各组取约1×10 细胞，按Hoechst 33258试剂盒(碧云天，上海)操作步骤进行核染色，染色后用荧光显微镜观察细胞形态。结果显示siRNA-799组细胞呈明显的细胞凋亡形态学改变：细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，而其余各对照组细胞核呈正常的蓝色。

[0063] (2)CCK-8法检测细胞增殖情况：转染结束立即取各组细胞约1×104个，每组平行取3孔，放入培养箱中72h后加入10μl的CCK-8溶液(同仁化学研究所，日本)，37℃孵育2h后于450nm(SYNERGY4全自动酶标仪，Bio-TEK，USA)处检测各组OD值，计算抑制率。结果显示，与各对照组相比，siRNA-799组可以明显抑制细胞的增殖(如表3所示)。

[0064] 表3：CCK-8法检测转染72h后对Molt-4细胞增殖的影响

[0065]

[0066] *：P＜0.05 siRNA-799 VS 其余各组

[0067] (3)流式细胞仪检测细胞凋亡情况：转染72h后取各组细胞约1×105个，用4℃预冷的PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤细胞2次，1ml Annexin V-FITC结合缓冲液洗细胞2次，1000rpm离心5min去上清，加入200μl Annexin V-FITC结合缓冲液，重悬细胞后，分别加入10μl Annexin V和5μl PI溶液，轻轻混匀，避光反应30min，立即上机检测，Winmdi软件分析结果。结果显示，与各对照组相比，siRNA-799组细胞早期和中晚期凋亡均有所增加(图4)。

[0068] 上述实验结果说明了本发明提供的靶向抑制PPP2R5C基因表达的siRNA具有明显的抑制T淋巴肿瘤细胞增殖、同时也有一定的诱导T淋巴肿瘤细胞凋亡的功能。

[0069] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。