一种柠檬酸的制备方法

摘要

柠檬酸的制备方法，该方法包括将黑曲霉接种至发酵液中并发酵产生柠檬酸，其中，在黑曲霉呼吸商的上升阶段的发酵温度为35-45℃，在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度为30-40℃，在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的发酵温度为30-40℃，在黑曲霉呼吸商的回升阶段的发酵温度为35-45℃；且在黑曲霉呼吸商的上升阶段的发酵温度高于在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度，在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度高于在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的发酵温度，在黑曲霉呼吸商的回升阶段的发酵温度高于在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度以及在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的发酵温度。本发明的方法能够有效提高发酵效率，缩短发酵周期。

权利要求

1.一种柠檬酸的制备方法，该方法包括将黑曲霉接种至发酵液中并发酵产生柠檬酸，其特征在于，发酵产生柠檬酸的过程包括黑曲霉呼吸商的上升阶段、黑曲霉呼吸商的下降阶段、黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段和黑曲霉呼吸商的回升阶段，在黑曲霉呼吸商的上升阶段的发酵温度为37-41℃，在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度为35-39℃，在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的发酵温度为35-39℃，在黑曲霉呼吸商的回升阶段的发酵温度为37-41℃；且在黑曲霉呼吸商的上升阶段的发酵温度高于在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度，在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度高于在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的发酵温度，在黑曲霉呼吸商的回升阶段的发酵温度高于在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度以及在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的发酵温度；

其中，将黑曲霉接种至发酵液中后黑曲霉的呼吸商的初始值为0.1-0.5，黑曲霉的呼吸商在经过上升阶段后处于0.8-1.5的范围内，在经过下降阶段后处于0.1-0.4的范围内，在低水平维持阶段处于0.1-0.4的范围内，在经过回升阶段后处于0.4以上；

在黑曲霉呼吸商的上升阶段的发酵温度比在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度高

1-3℃，在黑曲霉呼吸商的回升阶段的发酵温度比在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度以及在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的发酵温度高1-3℃；

在黑曲霉呼吸商的上升阶段发酵液中溶解氧的量为标定值的20-40%，在黑曲霉呼吸商的下降阶段发酵液中溶解氧的量为标定值的30-50%，在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段发酵液中溶解氧的量为标定值的40-70%，在黑曲霉呼吸商的回升阶段发酵液中溶解氧的量为标定值的40-70%；且在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段和回升阶段的溶解氧的量高于在黑曲霉呼吸商的上升阶段和下降阶段的溶解氧的量，在黑曲霉呼吸商的下降阶段的溶解氧的量高于在黑曲霉呼吸商的上升阶段的溶解氧的量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括多次检测发酵过程中黑曲霉的呼吸商，根据相邻两次黑曲霉呼吸商的值判断黑曲霉呼吸商所处的阶段。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，相邻两次检测的时间间隔不大于20分钟。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，相邻两次检测的时间间隔为2-5分钟。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，以每克发酵液为基准，黑曲霉的接种量为

4 5

5×10-2.5×10 个菌落形成单位。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，在被接种至发酵液中之前，所述黑曲霉还经过种子培养处理，该种子培养处理的方法包括：将黑曲霉接种在黑曲霉培养液中进行培养，所述培养的条件使黑曲霉的呼吸商为0.8-1.5，并在该呼吸商下保持2-8小时。

说明书

一种柠檬酸的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种柠檬酸的制备方法。

背景技术

[0002] 柠檬酸是广泛应用于饮料、食品及医药等行业的一种有机酸，我国是柠檬酸的生产大国，有20余家生产厂，产量已超过80万吨。

[0003] 目前，在生产柠檬酸的发酵过程中，当将黑曲霉种子液培养成熟并移入发酵罐后，通常在发酵的整个过程中采取同一控制条件，而导致黑曲霉菌体不能发挥其最佳效应，而导致发酵效率较低。因此，迫切需要开发一种能使黑曲霉发挥其最大效应以提高柠檬酸发酵效率的方法。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的柠檬酸发酵效率较低的缺陷，提供一种能够有效提高柠檬酸发酵效率的柠檬酸的制备方法。

[0005] 本发明的发明人发现，在生产柠檬酸的发酵过程中，通常需要对生产柠檬酸的黑曲霉发酵过程采取相应的参数控制，以使黑曲霉在发酵过程中始终处于最佳的状态中。但是，现有技术中在发酵的整个过程中采取同一控制条件，并不能够真实地反映黑曲霉的各个不同时期的特征，并根据黑曲霉菌体在发酵过程中的不同生长时期的特征配以与其状态相适应的环境参数。

[0006] 本发明的发明人经过研究后判断出黑曲霉所处不同生长时期的参数特征，并在发酵过程中，根据黑曲霉不同生长时期的参数特征对与其状态相适应的环境参数进行调整，以使黑曲霉在其不同时期都能处于最佳的状态并发挥其最大效应而使黑曲霉在发酵过程中具有较高的发酵效率。

[0007] 本发明提供了一种柠檬酸的制备方法，该方法包括将黑曲霉接种至发酵液中并发酵产生柠檬酸，其中，发酵产生柠檬酸的过程包括黑曲霉呼吸商的上升阶段、黑曲霉呼吸商的下降阶段、黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段和黑曲霉呼吸商的回升阶段，在黑曲霉呼吸商的上升阶段的发酵温度为35-45℃，在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度为30-40℃，在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的发酵温度为30-40℃，在黑曲霉呼吸商的回升阶段的发酵温度为35-45℃；且在黑曲霉呼吸商的上升阶段的发酵温度高于在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度，在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度高于在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的发酵温度，在黑曲霉呼吸商的回升阶段的发酵温度高于在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度以及在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的发酵温度。

[0008] 本发明的方法通过根据生产柠檬酸的发酵过程中黑曲霉的呼吸商的变化趋势来判断黑曲霉的生理状态，在黑曲霉的不同生理状态下对发酵温度进行控制，从而使黑曲霉在发酵过程中的生长和产酸阶段都处于最适环境中，有效发挥其最佳效用，而达到提高发酵效率，缩短发酵周期的目的。

具体实施方式

[0009] 按照本发明，所述柠檬酸的制备方法包括将黑曲霉接种至发酵液中并发酵产生柠檬酸，所述发酵液含有淀粉质原料酶解产物，其中，发酵产生柠檬酸的过程包括黑曲霉呼吸商的上升阶段、黑曲霉呼吸商的下降阶段、黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段和黑曲霉呼吸商的回升阶段，在黑曲霉呼吸商的上升阶段的发酵温度为35-45℃，优选为37-41℃；在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度为30-40℃，优选为35-39℃；在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的发酵温度为30-40℃，优选为35-39℃；在黑曲霉呼吸商的回升阶段的发酵温度为35-45℃，优选为37-41℃；且在黑曲霉呼吸商的上升阶段的发酵温度高于在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度，在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度高于在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的发酵温度，在黑曲霉呼吸商的回升阶段的发酵温度高于在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度以及在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的发酵温度。

[0010] 优选情况下，为了进一步控制黑曲霉呼吸商所处的阶段的发酵温度，以更好的达到提高发酵效率，缩短发酵周期的目的，在黑曲霉呼吸商的上升阶段的发酵温度比在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度高0.5-5℃，更优选高1-3℃；在黑曲霉呼吸商的回升阶段的发酵温度比在黑曲霉呼吸商的下降阶段的发酵温度以及在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的发酵温度高0.5-5℃，更优选高1-3℃。

[0011] 本发明的发明人发现，发酵产生柠檬酸的过程包括黑曲霉呼吸商的上升阶段、黑曲霉呼吸商的下降阶段、黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段和黑曲霉呼吸商的回升阶段，且可以通过根据生产柠檬酸的发酵过程中黑曲霉的呼吸商的变化趋势来判断黑曲霉的生理状态，即，其呼吸商的各个阶段的变化分别对应黑曲霉的不同生理阶段，即为黑曲霉的快速生长期、生长向产酸转型期、快速产酸期和衰亡期。本发明的发明人正是根据在发酵过程中黑曲霉呼吸商的变化特征在其不同的生理阶段采用不同的最适宜的发酵温度，从而使黑曲霉在发酵过程中的生长和产酸阶段都处于最适环境中，特别有利于菌体的快速生长发育，并能够有效发挥其最佳效用，而缩短了发酵周期，提高了发酵效率。因此，为了判断黑曲霉呼吸商所处的阶段，该方法还可以包括多次检测发酵过程中黑曲霉的呼吸商，根据相邻两次黑曲霉呼吸商的值判断黑曲霉呼吸商所处的阶段。在判断出黑曲霉呼吸商所处的阶段后，来相应调整发酵过程主要控制参数，即发酵温度。所述多次检测可以为间歇式的检测，例如，相邻两次检测的时间间隔没有特别限定，一般不大于20分钟，优选情况下，为了更准确的判断黑曲霉呼吸商所处的阶段，相邻两次检测的时间间隔为1-10分钟，更优选情况下，相邻两次检测的时间间隔为2-5分钟；也可以采用在线实时监控的方法对发酵过程中黑曲霉的呼吸商实时进行检测。

[0012] 术语“呼吸商”是指二氧化碳释放速率与氧消耗速率的比值。呼吸商是各种碳源在发酵过程中代谢状况的指示值，表征的是基质利用情况及其代谢途径状况。

[0013] 所述呼吸商的检测方法可以为各种能够检测微生物呼吸商的方法，例如，利用质谱仪或尾气分析仪检测培养过程中的尾气成分，计算二氧化碳释放速率和氧消耗速率，然后计算得出呼吸商。

[0014] 按照本发明，黑曲霉在其不同生理阶段的呼吸商的变化范围较宽，优选情况下，为了更易于发酵条件的控制，将黑曲霉接种至发酵液中后黑曲霉的呼吸商的初始值为0.1-0.5，所述黑曲霉的呼吸商在经过上升阶段后处于0.8-1.5的范围内，在经过下降阶段后处于0.1-0.4的范围内，在低水平维持阶段处于0.1-0.4的范围内，在经过回升阶段后处于0.4以上；更优选情况下，黑曲霉的呼吸商在经过上升阶段后处于0.85-1.2的范围内，在经过下降阶段后处于0.1-0.3的范围内，在低水平维持阶段处于0.1-0.3的范围内，在经过回升阶段后处于0.4-0.7的范围内。

[0015] 按照本发明，通气量使在发酵液中的溶解氧能够满足本发明的要求前提下，并防止通气量对发酵过程的影响，进一步提高发酵效率，优选情况下，在黑曲霉呼吸商的上升阶段发酵液中溶解氧的量为标定值的20-40％，更优选为标定值的25-35％；在黑曲霉呼吸商的下降阶段发酵液中溶解氧的量为标定值的30-50％，更优选为标定值的35-45％；在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段发酵液中溶解氧的量为标定值的40-70％，更优选为标定值的45-60％；在黑曲霉呼吸商的回升阶段发酵液中溶解氧的量为标定值的40-70％，更优选为标定值的40-60％；且在黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段和回升阶段的溶解氧的量高于在黑曲霉呼吸商的上升阶段和下降阶段的溶解氧的量，在黑曲霉呼吸商的下降阶段的溶解氧的量高于在黑曲霉呼吸商的上升阶段的溶解氧的量。

[0016] 按照本发明，所述标定值指的是将罐压调整到0.05MPa，在搅拌转速为100rpm，通风量为1∶0.5时对溶氧仪进行标定，溶氧仪标定显示值为100，即，此时溶解氧的量为10毫克/升。

[0017] 按照本发明，所述溶解氧的量受通气量和罐压等因素的影响。在本发明中，所述罐压一般可以衡定在0.03-0.05MPa之间。等条件的控制，上述条件只要能够满足所述溶解氧的量的要求即可，所述通气量的可调节范围较宽，为了更适于满足处于不同生理阶段的黑曲霉的需要，以配合发酵液中溶解氧的量的需要而进一步提高发酵效率，黑曲霉呼吸商的上升阶段的通气量为1∶(0.3-0.5)，黑曲霉呼吸商的下降阶段的通气量为1∶(0.4-0.7)，黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的通气量为1∶(0.6-1)，黑曲霉呼吸商的回升阶段的通气量为1∶(0.4-0.7)；更优选情况下，黑曲霉呼吸商的上升阶段的通气量为1∶(0.4-0.5)，黑曲霉呼吸商的下降阶段的通气量为1∶(0.5-0.7)，黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的通气量为1∶(0.7-0.9)，黑曲霉呼吸商的回升阶段的通气量为
1∶(0.4-0.7)。

[0018] 术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液(发酵液)的空气体积比来表示(V/V·min)，例如通气比为1∶0.1-1，简称通气量为0.01-1体积∶体积·分钟。

[0019] 按照本发明，黑曲霉呼吸商的变化时间是根据黑曲霉的生理阶段的变化有关，在本发明的条件下，能够保证黑曲霉在各个生理阶段的生长效率得到提高，因而缩短了发酵周期，提高了发酵效率，因此，黑曲霉呼吸商的上升阶段的维持时间可以为2-10小时，黑曲霉呼吸商的下降阶段的维持时间可以为2-10小时，黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的维持时间可以为30-38小时，黑曲霉呼吸商的回升阶段的维持时间可以为5-12小时。更优选情况下，黑曲霉呼吸商的上升阶段的维持时间为4-8小时，黑曲霉呼吸商的下降阶段的维持时间为3-7小时，黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段的维持时间为30-36小时，黑曲霉呼吸商的回升阶段的维持时间为5-10小时。

[0020] 根据本发明，所述发酵液可以为本领域常规的用于生产柠檬酸的发酵液，例如，所述发酵液含有淀粉质原料酶解产物，所述淀粉质原料酶解产物含有淀粉质原料酶解残渣和淀粉质原料酶解清液，为了更易于发酵的进行，以酶解产物的总重量为基准，所述淀粉质原料酶解清液的含量为80-95重量％，所述淀粉质原料酶解残渣的含量为5-20重量％。所述淀粉质原料酶解残渣的含水量可以在很大范围内改变，优选情况下，所述淀粉质原料酶解残渣的固含量为5-60重量％，更优选为20-40重量％。

[0021] 根据本发明，所述发酵液中各组分的含量可以在很大范围内改变，优选情况下，还可以根据需要向所述发酵液中添加补充氮源，所述补充氮源的含量可以为发酵液总重量的0.1-2重量％。根据本发明，所述补充氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，所述补充氮源可以为尿素、硫酸铵和硝酸铵中的一种或几种。此外，还可以根据发酵液液位的要求向发酵液中补充适量的水，水的量的可选择范围较宽，可以根据实际需要而定。

[0022] 按照本发明，所述无机氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，所述氮源可以为尿素、硫酸铵和硝酸铵中的一种或多种。

[0023] 按照本发明，所述发酵液的制备方法没有特别的限制，只要能够适于发酵生产柠檬酸即可。例如，将淀粉质原料进行粉碎，将淀粉质原料的粉碎产物与产酶微生物和/或酶混合，在产酶微生物的生长温度和/或酶有活力的温度下保温完成酶解得到酶解产物，并将酶解产物进行固液分离得到淀粉质原料酶解固相残渣和淀粉质原料酶解清液。并优选根据上述比例配制发酵液。

[0024] 其中，所述产酶微生物为能够分泌淀粉酶的产酶微生物。所述酶包括淀粉酶。

[0025] 由于微生物生长会产生副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克粉碎后的粉碎产物的干重计，所述淀粉酶的用量为15-50个酶活力单位。

[0026] 本发明所述酶的酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。

[0027] 所述酶解的温度可以在很大范围内改变，优选为70-105℃，更优选为80-95℃。所述酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选所述酶解的时间为90-150分钟，更优选为100-120分钟。所述酶解的pH值可以在很大范围内改变，优选为5.0-7.0，更优选pH值为5.4-5.7。

[0028] 淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。

[0029] α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。

[0030] β-淀粉酶又称淀粉1，4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1，4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。

[0031] 糖化酶又称淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非还原性末端，以葡萄糖为单位，依次作用于淀粉分子中的α-1，4-糖苷键，生成葡萄糖。糖化酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1，6-糖苷键的寡糖；作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。此酶产生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、拟内孢霉、红曲霉。

[0032] 异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将枝链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。此酶产生菌主要是嫌气杆菌、芽孢杆菌及某些假单孢杆菌等细菌。

[0033] 根据本发明，优选使用α-淀粉酶和/或异淀粉酶。

[0034] 按照本发明，所述淀粉质原料可以为本领公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或几种。

[0035] 按照本发明，所述黑曲霉的接种量可以在很大范围内改变，优选情况下，以每克发4 5 5 5
酵液为基准，黑曲霉的接种量为5×10-2.5×10 个菌落形成单位，更优选1×10-1.5×10个菌落形成单位。

[0036] 所述菌落形成单位的定义为将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在培养基平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。即每毫升菌液中含有的单细胞的数目。

[0037] 所述菌落形成单位可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数。

[0038] 本发明发酵所使用的黑曲霉可以为商购的黑曲霉固体制剂或黑曲霉菌种，例如，黑曲霉Co827(上海工业微生物研究所)和黑曲霉T01(天津工业微生物所)。

[0039] 所述黑曲霉可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至发酵液中之前，将所述黑曲霉经过种子培养处理，之后将得到的种子液加入到发酵液中。黑曲霉种子培养的程度可以通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0-2.5、酸度0.5-2.0％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时停止培养。

[0040] 优选情况下，所述种子培养处理的方法包括：将黑曲霉接种在黑曲霉培养液中进行培养，所述培养的条件使黑曲霉菌体的呼吸商为0.8-1.5，并在该呼吸商下保持2-8小时。

[0041] 一方面，所述培养的条件使黑曲霉的呼吸商为0.8-1.5，优选为0.85-1.2；在此范围内的呼吸商能够使培养的黑曲霉更适合于后续的发酵，使其发酵效率更为理想。另一方面，所述保持的时间为2-8小时，优选为3-5小时，能够进一步地提高黑曲霉在后续发酵中的效率，从而使其处于更适于发酵的状态。

[0042] 根据本发明，所述黑曲霉培养液的制备方法没有特别的限制，只要得到的培养液能够适用于黑曲霉的培养即可，例如，所述黑曲霉培养液的制备方法可以包括：在淀粉浆液中加入淀粉酶，以20-150℃/每小时的速度升温至90-100℃并在该温度下进行一次喷射，5-30分钟之后进行闪蒸，待温度降至80-95℃时在该温度下酶解淀粉90-140分钟，得到液化液并稀释至总糖为5-20重量％，之后加入氮源并灭菌。术语总糖是指酶解液化液中所含糖的总含量。

[0043] 根据本发明，所述淀粉浆液中，淀粉和水的含量以及浆液的pH可以在很大范围内改变，优选情况下，所述淀粉的含量为10-25重量％，水的含量为75-90重量％，所述淀粉浆液的pH值为5-7。

[0044] 所述淀粉酶的种类在上文中已经介绍，在此不再赘述。

[0045] 根据本发明，所述氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，所述氮源可以为尿素、硫酸铵和硝酸铵中的一种或多种，所述氮源的加入量可以在很大范围内改变，优选情况下，以所述黑曲霉培养液的总重量为基准，所述氮源的加入量为0.05-0.5重量％。

[0046] 本发明中，所述黑曲霉的接种量可以在很大范围内改变，优选情况下，以每克黑曲5
霉培养液为基准，黑曲霉的接种量为1-3×10 个菌落形成单位。

[0047] 根据本发明，所述种子培养的条件可以在很大范围内改变，例如所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为25-45℃，pH值可以为2-7，通气量可以为0.1-1体积∶体积·分钟，培养的时间可以为45-65小时；更优选的情况下，所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为30-40℃，pH值可以为2.5-6.5，通气量可以为0.2-0.8体积∶体积·分钟，所述培养的时间可以为50-60小时。

[0048] 所述培养的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐进行培养。

[0049] 按照本发明的方法制备得到的发酵产物柠檬酸可以用常规的方法，根据不同工业产品的要求分离并精制，比如中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装。

[0050] 下面将通过具体实施例对本发明进行进一步的详细描述。

[0051] 在下述实施例中，采用质谱仪MAX300-LG检测培养过程中的尾气成分，计算二氧化碳释放速率和氧消耗速率，然后计算得出呼吸商；发酵液中溶解氧的量的测定方法为采用在线溶氧电极(梅特勒)检测。

[0052] 实施例1

[0053] 本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸的制备方法。

[0054] (1)将收获的100重量份玉米(水分含量为14重量％)进行粉碎，得到平均粒子直径为400微米的粉碎产物。

[0055] (2)将粉碎后的产物按25重量％的浓度与水混合后调浆，相对于每克粉碎产物的干重，加入20个酶活力单位的淀粉酶(诺维信公司，a-淀粉酶)，进入喷射器，在85℃、pH为5.5的条件下酶解100分钟，得到酶解产物A1。其中，将80％的A1酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液和酶解固相残渣。

[0056] (3)使用步骤(2)得到的酶解产物及分离出来的酶解清液配置发酵液，具体组成为90重量份的酶解清液和10重量份的酶解固相残渣(固含量为15重量％)灭菌后加入到发酵罐中，得到发酵液B1。

[0057] (4)步骤(2)得到的酶解产物A1，加水稀释至总糖的10重量％，并投入种子罐，加入尿素，尿素的加入量为种子罐培养液总重量的0.35％，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，接种量为：每克酶解清5
液10 个菌落形成单位)，在36℃、0.4体积∶体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0、酸度1％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。

[0058] (5)将步骤(4)培养黑曲霉菌种加入到步骤(1)中的发酵罐中进行发酵，并检测4
发酵液中的总糖，接种量为：每克发酵液5×10 个菌落形成单位，将发酵尾气接入质谱仪对发酵过程中黑曲霉的呼吸商(呼吸商用RQ表示)进行多次测定，根据相邻两次黑曲霉呼吸商的值判断黑曲霉呼吸商所处的阶段(第0小时至第6小时，每隔18分钟检测一次，第6小时以后至第10小时，每隔2分钟检测一次，第10小时以后至第15小时，每隔10分钟检测一次，第15小时以后至第18小时，每隔1分钟检测一次，第18小时以后至第48小时，每隔15分钟检测一次，从第48小时以后至发酵结束，每隔2分钟检测一次)，将罐压调整到
0.05MPa，在搅拌转速为100rpm，通风量为1∶0.5时对溶氧仪进行标定，溶氧仪标定显示值为100，即，此时溶解氧的量为10毫克/升。发酵第0小时RQ为0.31，发酵温度控制为
39.5℃、通风量为1∶0.4，到发酵第8.7小时时RQ达到1.21(在该黑曲霉呼吸商的上升阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的30％)，然后RQ开始下降；调整发酵温度为38℃、通风量为1∶0.5，到第16.9小时时RQ为0.3(在该黑曲霉呼吸商的下降阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的40％)，然后调整发酵温度为37℃、通风量为1∶0.6，直到发酵第50小时，RQ都基本维持在0.2-0.3之间(在该黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的50％)；从发酵第50小时以后，RQ开始从0.3上升(上升后处于0.65)，此时提高发酵温度为39.5℃、通风量为1∶0.4通风，直到发酵到第56小时发酵结束(在该黑曲霉呼吸商的回升阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的45％)。

[0059] 实施例2

[0060] 本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸的制备方法。

[0061] 按照实施例1的方法制备柠檬酸，不同的是：使用实施例1中得到的酶解产物A1配置发酵液，具体组成为85重量份的酶解液化清液、14.8重量份的酶解固相残渣(固含量为30重量％)和0.2重量份尿素灭菌后加入到发酵罐中，得到发酵液B2。

[0062] 将实施例1中得到的酶解液化清液，加水稀释至总糖10重量％投入种子罐，加入尿素，尿素的加入量为种子罐培养液总重量的0.35％，加热到120℃消毒，维持20分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，接种量为：每克酶解液化5
清液10 个菌落形成单位)，在36℃、0.4体积∶体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0、酸度1％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。

[0063] 将上述培养黑曲霉菌种加入到发酵罐中进行发酵，并检测发酵液中的总糖，接种5
量为：每克发酵液10 个菌落形成单位，将发酵尾气接入质谱仪对发酵过程中黑曲霉的呼吸商(呼吸商用RQ表示)进行多次测定，根据相邻两次黑曲霉呼吸商的值判断黑曲霉呼吸商所处的阶段(第0小时至第6小时，每隔16分钟检测一次，第6小时以后至第10小时，每隔1.5分钟检测一次，第10小时以后至第14小时，每隔5分钟检测一次，第14小时以后至第17小时，每隔2分钟检测一次，第17小时以后至第46小时，每隔18分钟检测一次，从第
46小时以后至发酵结束，每隔1分钟检测一次)；发酵第0小时RQ为0.36，发酵温度控制为39.5℃、通风量为1∶0.4，到发酵第8小时时RQ达到1.21(在该黑曲霉呼吸商的上升阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的28％)，然后RQ开始下降；调整发酵温度为38℃、通风量为1∶0.6，到发酵第15.7小时时RQ为0.3(在该黑曲霉呼吸商的下降阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的36％)，然后调整发酵温度为37℃、通风量为1∶0.8，直到发酵到第49小时后，RQ都基本维持在0.2-0.3之间(在该黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的46％)；从发酵第49小时以后，RQ开始从0.3上升(上升后处于0.7)，此时提高发酵温度为39℃、通风量为1∶0.4通风，直到发酵到第55小时发酵结束(在该黑曲霉呼吸商的回升阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的44％)。

[0064] 实施例3

[0065] 本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸的制备方法。

[0066] 按照实施例1的方法制备柠檬酸，不同的是：使用实施例1中得到的酶解产物A1配置发酵液，具体组成为90重量份的酶解液化清液和5重量份(固含量为30重量％)的酶解固相残渣和0.1重量份尿素、4.9重量份的水灭菌后加入到发酵罐中，得到发酵液B3。

[0067] 将实施例1中得到的酶解液化清液，加水稀释至总糖10重量％投入种子罐，加入尿素，尿素的加入量为种子罐培养液总重量的0.35％，加热到120℃消毒，维持20分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，接种量为：每克酶解液5
化清液2×10 个菌落形成单位)，在36℃、0.4体积∶体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0、酸度
1％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。

[0068] 将上述培养黑曲霉菌种加入到发酵罐中进行发酵，并检测发酵液中的总糖，接种5
量为：每克发酵液1.5×10 个菌落形成单位，将发酵尾气接入质谱仪对发酵过程中黑曲霉的呼吸商(呼吸商用RQ表示)进行在线实时监测；发酵第0小时RQ为0.27，发酵温度控制为37.5℃、通风量为1∶0.5，到发酵第7.1小时时RQ达到1.14(在该黑曲霉呼吸商的上升阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的35％)，然后RQ开始下降；调整发酵温度为35.5℃、通风量为1∶0.6，到发酵第14.3小时时RQ为0.25(在该黑曲霉呼吸商的下降阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的45％)，然后调整发酵温度为35℃、通风量为1∶0.8，直到发酵到第48.2小时后，RQ都基本维持在0.15-0.25之间(在该黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的55％)；从发酵第48.2小时以后，RQ开始从0.25上升(上升后处于0.58)，此时提高发酵温度为38℃、通风量为1∶0.4通风，直到发酵到第54小时发酵结束(在该黑曲霉呼吸商的回升阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的49％)。

[0069] 实施例4

[0070] 本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸的制备方法。

[0071] 按照实施例1的方法制备柠檬酸，不同的是，在步骤(5)中，将步骤(4)培养黑曲霉菌种加入到步骤(1)中的发酵罐中进行发酵，并检测发酵液中的总糖，接种量为：每克发4
酵液5×10 个菌落形成单位，将发酵尾气接入质谱仪对发酵过程中黑曲霉的呼吸商(呼吸商用RQ表示)进行在线实时监测；发酵第0小时RQ为0.22，发酵温度控制为41℃、通风量为1∶0.3，到发酵第6.6小时时RQ达到0.95(在该黑曲霉呼吸商的上升阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的30％)，然后RQ开始下降；调整发酵温度为39℃、通风量为1∶0.65，到第14小时RQ为0.2(在该黑曲霉呼吸商的下降阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的
37％)，然后调整发酵温度为38℃、通风量为1∶0.9，直到发酵第49小时，RQ都基本维持在0.2-0.3之间(在该黑曲霉呼吸商的低水平维持阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的
48％)；从发酵第49小时以后，RQ开始从0.2上升(上升后处于0.62)，此时提高发酵温度为40.5℃、通风量为1∶0.6通风，直到发酵到第56小时发酵结束(在该黑曲霉呼吸商的回升阶段，发酵液中溶解氧的量为标定值的43％)。

[0072] 实施例5

[0073] 本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸的制备方法。

[0074] 根据与实施例2相同的方法进行发酵，不同的是，通过以下方法控制黑曲霉的培养：在培养过程中将培养尾气接入质谱仪，在线记录二氧化碳释放速率和氧消耗速率，并在线计算呼吸商，在呼吸商为0.75下维持7小时。

[0075] 实施例6