1,3-噻唑-4-酮在制药中的应用

摘要

本发明公开了一种5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮在制备抑制血管内皮细胞衰老和凋亡药物中的应用；其中：能有效抑制凋亡、核片段化和DNA凝缩的5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮的浓度是20μM～30μM。本发明为制备抑制血管内皮细胞衰老和凋亡药物和治疗心血管疾病又提供了一条开发和应用的途径。

权利要求

1.5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1,3-噻唑-4-酮在制备抑制血管内皮细胞衰老药物中的应用。

说明书

1,3-噻唑-4-酮在制药中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及噻唑烷酮类化合物在抑制血管内皮细胞衰老和凋亡中的应用；尤其涉及5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮在制备抑制血管内皮细胞衰老和凋亡药物中的应用。

背景技术

[0002] 噻唑烷酮类化合物是一类重要的杂环类化合物。以往人们对它的研究主要集中于2、4、5位含有羰基的噻唑烷酮类化合物，研究发现此类化合物具有抗菌抗感染抗病毒抗炎症等多种生物效应，其中以4-噻唑烷酮在抗肿瘤方面的研究较为广泛。早期的研究报道，
4-噻唑环核心结构的化合物具有明显的选择性杀死耐药性癌细胞尤其是肺癌细胞，并诱导细胞凋亡，而对正常细胞无抑制损伤作用。然而，尽管已有研究结果表明噻唑烷酮有广谱抗癌性，但未见噻唑烷酮类化合物中5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮在血管内皮细胞衰老及凋亡方面的作用以及相关的药理学的研究与应用的报道。

发明内容

[0003] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮在制备抑制血管内皮细胞衰老和凋亡药物中的应用。

[0004] 本发明所述的5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮在制备抑制血管内皮细胞衰老和凋亡药物中的应用；其中：能有效抑制凋亡、核片段化和DNA凝缩的5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，
3-噻唑-4-酮的浓度是20μM～30μM。

[0005] 为了更好地理解本发明的实质及本发明所述化合物的作用效果，下面结合5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮的药理实验及结果，来进一步阐述其在抑制血管内皮细胞衰老和凋亡中的作用。

[0006] 血管内皮细胞的制备：以常规方法培养血管内皮细胞，选取生长状态良好的、且处于对数生长期的血管内皮细胞，备用。

[0007] 观察5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮对抑制去除血清和生长因子的血管内皮细胞衰老和凋亡的影响。

[0008] 1、显微镜观察细胞形态学变化：

[0009] 将所培养的细胞分为正常组细胞、对照组细胞和处理组细胞。

[0010] 正常组细胞用含有血清和生长因子的M199培养液培养；对照组细胞去处血清和生长因子培养；处理组是将血管内皮细胞去除血清和生长因子后，分别加5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮，处理24小时和48小时。然后，光镜下直接观察血管内皮细胞凋亡的形态学变化和凋亡小体的形成。 [0011] 结果发现：5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理血管内皮细胞24和48小时，较之对照组可明显抑制凋亡小体的形成以及凋亡的形态学变化(见图1)。

[0012] 2、荧光显微镜观察细胞核凝缩及核碎裂情况：

[0013] 将所培养的细胞分为正常组细胞、对照组细胞和处理组细胞。

[0014] 正常组细胞用含有血清和生长因子的M199培养液培养；对照组细胞去处血清和生长因子培养；处理组是将血管内皮细胞去除血清和生长因子后，加5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理24小时。然后对各组进行AO染色，在荧光显微镜下观察血管内皮细胞凋亡时，细胞核DNA的凝缩及核碎裂情况。 [0015] 结果显示：处理组中细胞核DNA凝缩及碎裂较对照组减少(见图2)。 [0016] 3、用MTT法检测细胞琥珀酸脱氢酶的活性，以判断血管内皮细胞生长情况： [0017] 将血管内皮细胞接种于96孔培养板中，经不同浓度(10μM，20μM，30μM)5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理后，在24小时和48小时分别用MTT法测琥珀酸脱氢酶活性，计算存活率，存活细胞％＝(处理组OD值/对照组OD值)×100％(以不含细胞的培养液为空白组调零)。

[0018] 结果表明：处理组细胞存活率较对照组显著升高且呈剂量依赖性。 [0019] 5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮对细胞生长的影响结果见下表：

[0020]

[0021] 4、Tunel染色标记凋亡细胞：

[0022] 将所培养的细胞分为正常组细胞、对照组细胞和处理组细胞。

[0023] 正常组细胞用含有血清和生长因子的M199培养液培养；对照组细胞去处血清和生长因子培养；处理组是将血管内皮细胞去除血清和生长因子后，加5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理24小时。然后，用福尔马林固定25分钟，0.2％Triton X-100处理5分钟，每孔加入50μl rTdr孵育液，37℃下孵育1小时，SSC终止反应，检测标记凋亡细胞。分别计数正常组细胞、对照组细胞、处理组细胞，计算其阳性率。

[0024] 结果显示(见图3)：

[0025] 正常组细胞，用含有血清和生长因子的M199培养液培养24小时几乎无阳性细胞；

[0026] 对照组细胞，去除血清和生长因子24小时，阳性细胞较多；

[0027] 处理组细胞，用5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理24小时，阳性细胞较对照组显著降低。

[0028] 提示：5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮可抑制血管内皮细胞凋亡。

[0029] 5、衰老相关的β-半乳糖苷酶染色，以判断细胞衰老情况：

[0030] 将所培养的细胞分为正常组细胞、对照组细胞和处理组细胞。

[0031] 正常组细胞用含有血清和生长因子的M199培养液培养；对照组细胞去处血清和生长因子培养；处理组是将血管内皮细胞去除血清和生长因子后，加5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理24小时。然后，用β-半乳糖染液染色后观察。随机选取正常组细胞、对照组细胞和处理组细胞中的各10个视野，计数细胞总数和阳性细胞数，计算阳性率。

[0032] 结果显示：

[0033] 正常组细胞，含有血清和生长因子的M199培养液培养24小时，阳性率较低； [0034] 对照组细胞，去处血清和生长因子阳性率较正常细胞组阳性率上升； [0035] 处理组细胞，去处血清和生长因子用5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理24小时，阳性率下降。

[0036] 提示：5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮降低了阳性细胞比率，能抑制血管内皮细胞衰老。

[0037] 6、5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮对膜整联蛋白β4表达的影响：

[0038] 将所培养的细胞分为正常组细胞、对照组细胞和处理组细胞。

[0039] 对正常组细胞、对照组细胞和处理组三组细胞膜整联蛋白β4的表达进行荧光定量分析，结果：

[0040] 正常组细胞，含有血清和生长因子的M199培养液培养24小时，膜整联蛋白β4表达较低；

[0041] 对照组细胞，去除血清和生长因子后，膜整联蛋白β4表达表达升高； [0042] 处理组细胞，去除血清和生长因子后用5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理24小时，膜整联蛋白β4表达表达下降。 [0043] 提示：加入5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮可以降低膜整联蛋白β4在去除血清和生长因子培养细胞中的表达，抑制血管内皮细胞衰老。

[0044] 7、5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮对活性氧水平的影响：

[0045] 将所培养的细胞分为正常组细胞、对照组细胞和处理组细胞。

[0046] 对正常组细胞、对照组细胞和处理组三组细胞活性氧水平进行荧光定量分析，显微镜下结果见图4。

[0047] 正常组细胞，含有血清和生长因子的M199培养液培养24小时，活性氧水平表达较低；

[0048] 对照组细胞，去除血清和生长因子24小时，活性氧水平比正常组显著升高； [0049] 处理组细胞，用5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理细胞24小时后，活性氧表达水平比对照组有所降低但是无明显区别。 [0050] 结果表明：加入5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，
3-噻唑-4-酮可以降低活性氧水平但不显著，一定程度上能抑制血管内皮细胞衰老。 [0051] 通过上述实验及其结果，可以得出如下结论：

[0052] 5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮浓度在20μM～30μM时，能有效抑制血管内皮细胞衰老和凋亡，预示-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮在制备抑制血管内皮细胞衰老和凋亡药物以及治疗心血管疾病药物中有很大的开发应用前景。

附图说明

[0053] 图1：5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理血管内皮细胞的显微镜下结果。

[0054] 其中：A：示正常组(48小时)；B：示对照组(48小时)；C：示经5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理后的血管内皮细胞(48小时)。

[0055] 图2：荧光显微镜下所示5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理24小时后的血管内皮细胞中核凝缩及核碎裂的结果。 [0056] 其中：A为正常组；B为对照组；C为5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理组。

[0057] 图3：显示Tunel染色标记凋亡细胞。

[0058] 其中：A为正常组(24小时)；B为对照组(24小时)；C为5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理组(24小时)。

[0059] 图4：显微镜下示5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮对活性氧水平影响的结果。

[0060] 其中：A为正常组(24小时)；B为对照组(24小时)；C为5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理组(24小时)。

具体实施方式

[0061] 实施例1

[0062] 5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮的制备

[0063]

[0064] 在250mL的圆底烧瓶中，将异硫氢酸苯酯12.1mL(100.0mmol)加入到100mL无水THF中，将乙醇胺10.2mL(200.0mmol)溶于25mL THF中，逐滴加入到烧瓶中，室温下搅拌10分钟。然后，油浴加热回流三十分钟，减压蒸馏去除溶剂，蒸馏残液溶于乙酸乙酯中，用10％的盐酸溶液萃取。萃取的有机相合并，用饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除乙酸乙酯，得到粗产物1-乙醇基-3-苯基硫脲，纯度大于90％。

[0065] 将1-乙醇基-3-苯基硫脲1178mg(6.0mmol)，无水乙酸钠2479mg(30mmol)溶于20mL乙醇中，搅拌条件下，加入氯代乙酸乙酯1.28mL(12mmol)，然后在60℃下加热6个小时，TLC检测反应，反应结束后减压蒸馏去除溶剂，蒸馏残液用乙酸乙酯和水进行萃取，有机相合并， 用饱和食盐水洗涤，然后将有机相减压蒸馏，得到粗产物3-乙醇基-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮。

[0066] 将3-乙醇基-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮118mg(0.5mmol)和4-N，N-甲基苯甲醛89.4mg(0.6mmol)溶于3mL乙醇中，然后加入50μL哌啶，振荡，60℃条件下反应12小时，反应通过TLC监测，反应完毕后冷却到室温，在反应过程中有大量沉淀生成，经过分析表征，沉淀即为产物5-(4-(N，N二甲基)苯亚甲基)-3-羟基乙基-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮。过滤，用乙酸乙酯、乙醇和石油醚依次进行洗涤，若没有沉淀生成，将溶剂蒸干，按1∶2配比加入乙醇(乙酸乙酯)或者石油醚，振荡，则大部分出现沉淀，过滤，滤渣用大量乙酸乙酯、乙醇和石油醚依次进行洗涤。仍旧没有沉淀产生的通过硅胶柱层析进行分离，展开液由不同比例的乙酸乙酯和石油醚组成。

[0067] 5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮产物为黄色粉末，收率71.0％。

[0068] 核磁共振数据如下：

[0069] 1H NMR(400MHz，MeOD)：δ(ppm) ＝ 7.52(s，1H)，7.26(m，4H)，7.08(t，1H，J ＝7.5)，6.91(t，2H，J＝9.6)，6.64(d，2H，J＝9.0)，4.02(t，2H，J＝6.0)，3.78(t，2H，J＝+
5.9)，2.92(d，6H，J＝10.0)；ESI-MS：m/z 368.7(M+1)。

[0070] 实施例2

[0071] 将所培养的细胞分为正常组细胞、对照组细胞和处理组细胞。

[0072] 正常组细胞用含有血清和生长因子的M199培养液培养；对照组细胞去处血清和生长因子培养；处理组细胞去除血清和生长因子后用20μM或30μM浓度的5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理。三组细胞培养24小时后均用2％的甲醛、0.5％戊二醛固定5分钟，之后用不带β-半乳糖染液洗一次，加入含β-半乳糖的染液在37℃无二氧化碳条件下孵育18-24小时。PBS清洗后观察。对上述三组细胞随机各选取10个视野，计数细胞总数和阳性细胞数，计算阳性率。 [0073] 结果显示，正常组细胞阳性率较低；对照组细胞阳性率较正常组有显著上升；5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理24小时后的处理组细胞其阳性率显著下降。

[0074] 提示：5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮降低了阳性细胞比率，表明5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮能抑制血管内皮细胞衰老。

[0075] 实施例3

[0076] 将所培养的细胞分为正常组细胞、对照组细胞和处理组细胞。

[0077] 正常组细胞用含有血清和生长因子的M199培养液培养；对照组细胞去处血清和生长因子培养；处理组细胞去除血清和生长因子后用10μM～30μM浓度的5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理。三组细胞培养24小时后，弃去培养液，用4％的多聚甲醛固定15分钟。用0.1M PBS清洗后，加入正常血清封闭液。弃封闭液，加一抗，弃一抗加二抗，37℃下30分钟，弃去二抗，用0.1M PBS清洗后观察。

[0078] 对上述三组细胞膜整联蛋白β4的表达进行荧光定量分析。

[0079] 结果显示，正常组细胞膜整联蛋白β4表达较低；对照组细胞β4表达升高；处理组细胞用5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理24小时，β4表达表达显著下降。

[0080] 提示：5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮可以降低膜整联蛋白β4在去除血清和生长因子培养细胞中的表达，抑制血管内皮细胞衰老。

[0081] 实施例4

[0082] 将所培养的细胞分为正常组细胞、对照组细胞和处理组细胞。

[0083] 正常组细胞用含有血清和生长因子的M199培养液培养；对照组细胞去处血清和生长因子培养；处理组是将5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮配制成5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM等浓度，分别加入以去除血清和生长因子的血管内皮细胞中，处理24小时。

[0084] 在倒置显微镜下每4小时观察一次细胞的生长变化，结果看到：对照组细胞不断地脱离培养板底面而漂浮于培养液中，然后细胞逐渐形成凋亡小体，即发生典型的细胞凋亡，24小时后仅有55％的细胞存活，β-半乳糖苷酶染色细胞阳性率较高达39％；而5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理组细胞则较少发生凋亡，核片段化和DNA凝缩均受到抑制，此时的存活率为67～77％，β-半乳糖苷酶染色细胞阳性率下降至21％。说明5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮在所述实验浓度下，均呈现出抑制血管内皮细胞凋亡和衰老的现象，特别是5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，
3-噻唑-4-酮在20μM～50μM浓度时，能有效抑制血管内皮细胞凋亡和衰老；20μM～
30μM浓度时更为经济。

[0085] 实施例5

[0086] 5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮对活性氧水平的影响：

[0087] 将所培养的细胞分为正常组细胞、对照组细胞和处理组细胞。

[0088] 对正常组细胞、对照组细胞和处理组三组细胞活性氧水平进行荧光定量分析，显微镜下结果见图4。

[0089] 正常组细胞，含有血清和生长因子的M199培养液培养24小时，活性氧水平表达较低；

[0090] 对照组细胞，去除血清和生长因子24小时，活性氧水平比正常组显著升高； [0091] 处理组细胞，用5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，3-噻唑-4-酮处理细胞24小时后，活性氧表达水平比对照组有所降低但是无明显区别。 [0092] 结果表明：加入5-(4-二甲基胺基苯亚甲基)-3-(2-羟乙基)-2-苯基亚胺基-1，
3-噻唑-4-酮可以降低活性氧水平但不显著，一定程度上能抑制血管内皮细胞衰老。