一种选择性损伤培养细胞的方法

摘要

本发明提供一种选择性损伤培养细胞的方法。本发明所提供选择性损伤培养细胞的方法包括以下步骤：1)制备培养细胞的装置，所述装置包括：a)基底；和b)具有至少一个微凹槽单元的聚二甲基硅氧烷印章，其贴附于基底，分别形成多条微流通道；2)制备细胞悬浮溶液；3)将步骤2)所制备的细胞悬浮溶液分别通入步骤1)制备的装置中的微流通道内，经培养后，往某个微流通道内注入药物或纯水处理一定时间后，再揭掉聚二甲基硅氧烷印章，继续培养，实现选择性损伤培养细胞。通过本发明所提供方法建立的选择性损伤细胞模型，可以用于伤口愈合过程研究或药物筛选。

权利要求

1.一种选择性损伤培养细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）制备培养细胞的装置，所述装置包括：a）基底；和b）具有至少一个微凹槽单元的聚二甲基硅氧烷印章，其贴附于基底，分别形成多条微流通道；

2）制备细胞悬浮溶液；

3）将步骤2）所制备的细胞悬浮溶液分别通入步骤1）制备的装置中的微流通道内，经培养后，往某个微流通道内注入药物或纯水处理一定时间后，再揭掉聚二甲基硅氧烷印章，继续培养，实现选择性损伤培养细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）的装置中，所述聚二甲基硅氧烷印章的一个微凹槽单元包括：一条位于中间的直线型中间凹槽，和至少一条位于所述直线型中间凹槽的左侧和/或右侧的直线型侧凹槽，且所述直线型中间凹槽与直线型侧凹槽的中间段不相交，所述直线型侧凹槽中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凹槽的方向倾斜。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述各个凹槽的槽端处分别设有与相应凹槽相通的通孔。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述各个凹槽的长度为1200～2000微米，宽度为50～2000微米，两相邻凹槽槽壁之间的间距为50～1000微米。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤1）的装置中，所述基底为细胞可以粘附的基底。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1）的装置中，所述基底选自培养皿、玻璃、修饰了自组装单层膜的表面、修饰了促细胞粘附分子的表面，或高分子材料。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述自组装单层膜为甲基结尾的硫醇分子。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述促细胞粘附分子选自胶原，纤维蛋白和透明质酸钠。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述高分子材料为细胞可贴壁的材料。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞可贴壁的材料选自聚酯类、聚酸酐和聚丁二烯酸异丙酯。

11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述玻璃为蒸镀有金层的玻璃。

12.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基底为培养皿。

13.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中制备的细胞悬浮溶液为同种细胞悬浮液，或者不同种细胞悬浮溶液。

14.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中制备的细胞

5 7

悬浮溶液中的细胞密度为10 ～10 个/mL。

15.采用权利要求1至14中任一项所述方法建立的选择性损伤细胞模型。

16.根据权利要求15所述的模型，其特征在于，所述模型为正常细胞-损伤细胞-正常细胞排列的模拟伤口愈合模型。

17.权利要求15或16所述的选择性损伤细胞模型在伤口愈合过程研究或药物筛选中的用途。

18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述伤口愈合过程研究包括炎症阶段或上皮再生阶段的信号通路和细胞迁移、分化、增殖过程。

说明书

一种选择性损伤培养细胞的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及将微流控技术应用于生物医学领域，具体涉及一种选择性损伤培养细胞的方法，特别涉及将细胞粘附于同一基底并对其进行选择性损伤的方法及由此建立的细胞选择性损伤模型。

背景技术

[0002] 伤口愈合作为一个基本的生理过程，对于组织的平衡具有重要作用。伤口愈合功能的失调，会导致某些疾病和病理情况的产生。

[0003] 细胞迁移是组织修复中的重要行为，为了研究伤口愈合中的细胞迁移信号转导及细胞相互作用，传统的生物学方法主要有基于2D的细胞划痕实验(wound healing assay)和3D的动物活体损伤。划痕实验，即用枪头在培养好的完整的细胞层上划过，使局部的细胞被损伤并脱落产生一定的空间，继续培养后，剩余的细胞向新的空间迁移，此时加入各种诱导因子来研究其对细胞迁移的影响。在这种方法处理下，剩余的边缘细胞除了受到诱导因子的作用，还会被划痕过程中的机械牵拉影响，而这两种因素又是通过不同的信号途径来发生作用的，这些多种因素的共同作用无法使研究的问题简单化。动物活体损伤的办法也是如此，器官组织的多细胞复杂环境下，无法对某种细胞的反应做出对应的研究。

[0004] 因此，在体外模拟可控的多细胞损伤环境，对于组织修复具有重要意义。

发明内容

[0005] 因此，本发明的目的是，提供一种选择性损伤培养细胞的方法。

[0006] 本发明的另一个目的是，提供一种由上述方法建立的选择性损伤细胞模型。

[0007] 本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种选择性损伤培养细胞的方法，所述方法包括以下步骤：1)制备培养细胞的装置，所述装置包括：a)基底；和b)具有至少一个微凹槽单元的聚二甲基硅氧烷印章，其贴附于基底，分别形成多条微流通道；2)制备细胞悬浮溶液；3)将步骤2)所制备的细胞悬浮溶液分别通入装置中的微流通道内，经培养后，往某个微流通道内注入药物或纯水5-40分钟后，再揭掉聚二甲基硅氧烷印章，继续培养，实现选择性损伤培养细胞。

[0008] 优选地，所述步骤1)的装置中，所述聚二甲基硅氧烷印章的一个微凹槽单元包括：一条位于中间的直线型中间凹槽，和至少一条位于所述直线型中间凹槽的左侧和/或右侧的直线型侧凹槽，且所述直线型中间凹槽与直线型侧凹槽的中间段不相交，所述直线型侧凹槽中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；优选地，所述各个凹槽的槽端处分别设有与相应凹槽相通的通孔；更优选地，所述各个凹槽的长度为1200～2000微米，宽度为50～2000微米，两相邻凹槽槽壁之间的间距为50～1000微米。

[0009] 优选地，所述步骤1)的装置中，所述基底为细胞可以粘附的任何基底，例如培养皿、玻璃、蒸镀有金层的玻璃、修饰了自组装单层膜(如甲基结尾的硫醇分子)的表面、修饰了促细胞粘附分子(如胶原，纤维蛋白，透明质酸钠等)的表面、或高分子材料(如聚酯类、聚酸酐和聚丁二烯酸异丙酯等)细胞可贴壁的材料；优选地，所述基底为培养皿。

[0010] 优选地，所述步骤2)中制备的细胞悬浮溶液为同种细胞悬浮液，或者不同种细胞悬浮溶液。

[0011] 优选地，所述步骤2)中制备的细胞悬浮溶液中，细胞密度为105～107个/mL。

[0012] 另一方面，本发明提供了采用上述方法建立的选择性损伤细胞模型。

[0013] 优选地，所述模型为正常细胞-损伤细胞-正常细胞排列的模拟伤口愈合模型。

[0014] 此外，本发明还提供了上述选择性损伤细胞模型在伤口愈合过程研究或药物筛选中的用途。

[0015] 优选地，所述伤口愈合过程研究包括炎症阶段或上皮再生阶段的信号通路、细胞迁移、分化或增殖过程。

[0016] 在一个优选实施方案中，本发明提供的制备将多种细胞粘附于同一基底并对其进行选择性损伤的装置，包括以下步骤：

[0017] 1)利用光刻技术，在硅片上制备至少一个凸型微结构单元；

[0018] 2)用聚二甲基硅氧烷(PDMS)对步骤1)得到的具有至少一个凸型微结构单元一的硅片进行翻模，得到一与所述凸型条微结构单元相对应的聚二甲基硅氧烷印章；所制备的聚二甲基硅氧烷印章，其下表面的微凹槽单元包括：一条位于中间的直线型凹槽；设置于所述直线型中间凹槽左侧或/和右侧的至少一条直线型侧凹槽；所述直线型侧凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽不相交，所述直线型侧凹槽中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型侧凹槽和所述直线型侧凹槽的槽端处分别设有与相应凹槽相通的垂向通道；所述直线型中间凹槽和所述直线型侧凹槽的长度均在1.2-2厘米范围内，宽度均为50-2000微米；两相邻凹槽槽壁间间距为50微米-1000微米；

[0019] 3)一基底，如培养皿；

[0020] 4)将步骤2)得到的聚二甲基硅氧烷印章具有微凹槽单元的面朝下与步骤3)的基底表面相接触，所述聚二甲基硅氧烷印章上的直线型凹槽与所述基底形成封闭的微流通道；

[0021] 5)往步骤4)得到的微流通道分别通入一定浓度的胞外基质蛋白溶液孵育2小时；其中所述胞外基质蛋白为纤维结合蛋白、胶原蛋白或层粘连蛋白等；

[0022] 6)制备一定密度的不同种细胞的悬浮溶液，然后把不同种细胞通入相应的微流通道中，于37℃，二氧化碳体积浓度5％的细胞培养箱中培养，至细胞粘附在微流通管内的基底表面上；

[0023] 7)待细胞贴壁后，往某个通道注入药物或纯水处理一定时间后，再揭掉聚二甲基硅氧烷印章，实现多种细胞粘附于同一基底并对其进行选择性损伤共培养模型。

[0024] 本发明所使用的“选择性损伤”，是指在揭掉PDMS之前，对某一个通道里的细胞进行处理，在揭掉PDMS之后，可以在一个平面产生正常细胞-处理组细胞(损伤)-正常细胞的排列，与伤口模型相对应，即在一个伤口，中间是坏死或受损的细胞，两旁是正常细胞。本发明提供的方法克服了目前模拟伤口用一个尖锐的东西在一个细胞平面(就是一层细胞)划一下的技术产生的伤口的缺点，一是有死亡损伤细胞，二是有受到机械力作用的细胞，而这两种因素对细胞的影响又是通过不同的信号途径来发生作用，而采用本发明提供的装置和方法，可以把这两种情况分开，独立研究无机械力作用下的细胞信号转导，作为一个简化的伤口愈合模型，针对不同的伤口情况，可以控制同时加药的类型和程度，这是目前研究伤口愈合的模型无法达到的。

[0025] 综上所述，本发明利用微流控技术，在通道内对细胞进行损伤，为研究特定生理过程中，细胞相互作用下的迁移行为提供有利工具。本发明提供的方法，可以用来模拟伤口愈合这一生理过程的多细胞损伤环境，为伤口愈合过程中炎症阶段，上皮再生阶段的信号通路和细胞迁移，分化，增殖过程研究提供基础支持。本发明提供的方法还可用于影响伤口愈合，组织工程构建的药物和分子筛选，研究药物在细胞相互作用下的作用和功能。

附图说明

[0026] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0027] 图1为本发明实施例1所制备装置的结构示意图，其中1-基底；2-微流通道；

[0028] 图2为使用本发明实施例1对位于同一基底的同种细胞进行选择性损伤的实验结果图；

[0029] 图3为使用本发明实施例3对位于同一基底的不同种细胞进行选择性损伤的实验结果图；

[0030] 图4为本发明实施例4所制备装置的结构示意图，其中a为在微流通道内进行硫醇再组装前，b为在微流通道内进行硫醇再组装后，其中1-基底；2-微流通道；3-以甲基结尾的硫醇区域；4-以聚乙二醇结尾的硫醇区域；

[0031] 图5为使用本发明实施例4所制备装置对位于同一基底的组合排列的细胞进行选择性损伤的实验结果图。

具体实施方式

[0032] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

[0033] 实施例1 对位于同一基底的同种细胞进行选择性损伤

[0034] 本实施例为对位于同一基底的同种细胞进行选择性损伤。首先制备选择性损伤细胞的装置，然后通过本发明提供的方法在同一平面得到正常细胞与损伤细胞的排列，建立选择性损伤模型。具体详述如下。

[0035] 本实施例制备使用的装置如图1所示。

[0036] 1)聚二甲基硅氧烷印章模板的制备，主要过程为光刻，即利用光刻胶在紫外线照射下可改变性质的特点在硅片上制备至少一个凸型微结构单元，具体制备方法可参加Y.Xia，G.Whitesides，Annual Review of Materials Science，1998，28，15；

[0037] 2)聚二甲基硅氧烷印章的制备，方法为软刻蚀技术，制备材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS，polydimethylsiloxane，184 silicone elastomer，购自Dow Corning)，其在普通状态下是透明而粘稠的液体，经与固化剂反应(184 silicone elastomer curing agent，购自Dow Corning)并加热后可固化。利用PDMS可以将硅片模板上的突起图形转换为对应的凹型图形，从而得到一与所述凸型条微结构单元相对应的聚二甲基硅氧烷印章；

[0038] 所制备的聚二甲基硅氧烷印章，其下表面的微凹槽单元包括：一条位于中间的直线型凹槽；设置于所述直线型中间凹槽左侧或/和右侧的至少一条直线型侧凹槽；所述直线型侧凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽不相交，所述直线型侧凹槽中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型侧凹槽和所述直线型侧凹槽的槽端处分别设有与相应凹槽相通的垂向通道；所述直线型中间凹槽和所述直线型侧凹槽的长度均为1.5厘米，宽度均为1000微米；两相邻凹槽槽壁间间距为100微米；

[0039] 3)一基底，为细胞培养皿；

[0040] 4)将步骤2)得到的聚二甲基硅氧烷印章具有微凹槽单元的面朝下与步骤3)的培养皿表面相接触，所述聚二甲基硅氧烷印章上的直线型凹槽与所述基底形成封闭的微流通道；

[0041] 5)往步骤4)得到的微流通道分别通入20微克/毫升的纤粘连蛋白，于37℃孵育2小时；

[0042] 6)制备MDCK细胞(购自协和医院)的悬浮溶液(具体制备方法参见Xingyu7
Jiang，PNAS，2005，102，975-978)，调整细胞密度为10 个/ml。然后把该MDCK细胞悬浮溶液通入微流通道，再放入细胞培养箱，在37℃，二氧化碳体积浓度5％，培养2小时，至细胞粘附在微流通管内的基底表面上；

[0043] 7)待细胞贴壁后，往中间通道注入纯水处理10分钟后，再揭掉聚二甲基硅氧烷印章，实现多种细胞粘附于同一基底并对其进行选择性损伤共培养模型。

[0044] 实验结果见图2。如图2中的a所示，在揭掉微流通道前，在中间通道通入纯水后，MDCK细胞在纯水处理10分钟后，收缩变圆，而两侧未作处理的MDCK细胞形态正常。在揭掉微流通道后，如图2中的b所示，在同一基底上，正常的MDCK细胞连续条带位于基底的左右两侧，被损伤的细胞连续条带位于基底的中间。

[0045] 实施例2 对位于同一基底的同种细胞进行选择性损伤

[0046] 本实施例为对位于同一基底的同种细胞进行选择性损伤。首先制备选择性损伤细胞的装置，然后通过本发明提供的方法在同一平面得到正常细胞与损伤细胞的排列，建立选择性损伤模型。具体详述如下。

[0047] 本实施例制备使用的装置，与实施例1所使用装置的区别仅在于在玻璃基底上蒸镀金层，利用真空电子束蒸镀，在干净的玻璃基底上表面上先蒸镀10纳米的钛层，然后再在其上蒸镀40纳米的金层(具体方法见George M.Whitesides，Annu.Rev.Mater.Sci.1998.28：153-84)；

[0048] 其余操作与实施例1完全相同。

[0049] 实施例3 对位于同一基底的不同种细胞进行选择性损伤

[0050] 本实施例为对位于同一基底的不同种细胞进行选择性损伤。首先制备选择性损伤细胞的装置，然后通过本发明提供的方法在同一平面得到正常的成纤维细胞细胞与损伤的上皮细胞的排列，建立选择性损伤模型模型。具体详述如下。

[0051] 本实施例制备使用的装置与实施例1相同，仅在步骤6)中制备了两种不同细胞的7
悬浮溶液：MDCK(购自协和医院)，细胞密度为10 个/ml和NIH 3T3(购自ATCC)，细胞密度
5
为10 个/ml。然后把MDCK通入左右两个微流通道，NIH 3T3通入中间的微流通道，再放入细胞培养箱，在37℃，二氧化碳体积浓度5％，培养2小时，至细胞粘附在微流通管内的基底表面上；其余步骤7)也与实施例1相同。

[0052] 实验结果见图3。如图3中的a所示，在揭掉微流通道前，在中间通道通入纯水后，MDCK细胞在纯水处理10分钟后，收缩变圆，而两侧未作处理的NIH 3T3细胞形态正常。揭掉微流通道后，如图3中的b所示，在同一基底上，正常的NIH 3T3细胞连续条带位于基底的左右两侧，被损伤的MDCK细胞连续条带位于基底的中间。

[0053] 实施例4 对位于同一基底的组合排列的细胞进行选择性损伤

[0054] 本实施例为对位于同一基底的组合排列的细胞进行选择性损伤。首先制备一种将同种细胞以特定组合的排列和密度存在于同一基底的装置，并用于选择性损伤培养细胞，在同一平面得到正常细胞与损伤细胞的排列，建立选择性损伤模型。具体详述如下。

[0055] 本实施例制备使用的装置如图4所示。

[0056] 1)聚二甲基硅氧烷印章模板的制备，主要过程为光刻，即利用光刻胶在紫外线照射下可改变性质的特点制作与设计好的掩模上的图案完全一致的光刻胶硅片模板，具体制备方法可参加Y.Xia，G.Whitesides，Annual Review of Materials Science，1998，28，15，在商用晶面为<111>的单晶硅片上制备具有一个微凸型线结构单元一；

[0057] 2)聚二甲基硅氧烷印章的制备，方法为软刻蚀技术，制备材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS，polydimethylsiloxane，184 silicone elastomer，购自Dow Corning)，其在普通状态下是透明而粘稠的液体，经与固化剂反应(184 silicone elastomer curing agent，购自Dow Corning)并加热后可固化。利用PDMS可以将硅片模板上的突起图形转换为对应的凹型图形，从而得到一与所述凸型条微结构单元相对应的聚二甲基硅氧烷印章一；

[0058] 所制备的聚二甲基硅氧烷印章一，其下表面的微凹槽单元包括：

[0059] 一条位于中间的直线型凹槽；

[0060] 分别设置于所述直线型中间凹槽左侧和右侧的两条直线型侧凹槽；

[0061] 所述直线型侧凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽平行，所述直线型侧凹槽中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；

[0062] 所述直线型侧凹槽和所述直线型侧凹槽的槽端处分别设有与相应凹槽相通的垂向通道；

[0063] 所述直线型中间凹槽和所述直线型侧凹槽的长度为1.5厘米，宽度为500微米；两相邻凹槽槽壁间间距为100微米；

[0064] 3)利用真空电子束蒸镀，在干净的玻璃基底上表面上先蒸镀10纳米的钛层，然后再在其上蒸镀40纳米的金层(具体方法见George M.Whitesides，Annu.Rev.Mater.Sci.1998.28：153-84)；

[0065] 4)使用光刻技术，在一硅片上刻制凹型微结构单元二；

[0066] 5)以具有凹型微结构单元二的该硅片作模板，用聚二甲基硅氧烷对其进行翻模，得到与所述平行凹型条带的阵列结构相对应互补的具有若干平行凸型条带的阵列结构的聚二甲基硅氧烷印章二；该聚二甲基硅氧烷印章二的上表面具有平行排列的凸型条带，其宽度为100微米，长度为1.5厘米，间距为300微米；

[0067] 6)将步骤5)得到的聚二甲基硅氧烷印章二放入5mM的HS(CH2)15CH3的乙醇溶液里10秒，然后取出，用氮气吹干，让其具有若干平行凸型条带的阵列结构的一面与步骤3)制备的基底接触，使得聚二甲基硅氧烷印章二表面的硫醇分子转移到基底的金层上，在基底的金层上形成一个宽100微米，长为1.5厘米，间隔为300微米的具有疏水性质的平行硫醇自组装疏水条带；

[0068] 7)将步骤6)得到的具有平行硫醇疏水条带的基底用75％乙醇清洗消毒后吹干；

[0069] 8)将步骤2)得到的聚二甲基硅氧烷印章一具有微凹槽单元的面朝下与步骤7)的基底表面相接触，所述聚二甲基硅氧烷印章一上的直线型凹槽与所述基底的平行硫醇自组装疏水条带垂直相交，形成封闭的微流通道；

[0070] 9)往步骤8)得到的微流通道分别通入2mM抗拒蛋白质和细胞粘附的HS(CH2)11(OCH2OCH2)6OH的乙醇溶液或5mM促进蛋白质和细胞粘附的HS(CH2)15CH3的乙醇溶液；

[0071] 在中间通道通入聚乙二醇结尾的硫醇，两侧通道通入甲基结尾的硫醇；

[0072] 聚乙二醇结尾的硫醇在微流通道中，于室温(15-30℃)孵育20分钟后用75％的乙醇和PBS溶液各清洗3次，再通入20微克/毫升的纤粘连蛋白，于37℃孵育2小时；

[0073] HS(CH2)15CH3在微流通道中室温(15-30℃)下孵育2分钟后用75％的乙醇和PBS溶液各清洗3次，再通入20微克/毫升的纤粘连蛋白，于37℃孵育2小时；

[0074] 在两侧通道内部形成均一的细胞可贴附区域，即均一甲基结尾的硫醇自组装区域，在中间通道局部细胞可贴附区域，即甲基结尾的硫醇自组装条带和聚乙二醇结尾的硫醇自组装条带交替出现的区域。

[0075] 10)制备MDCK细胞的悬浮溶液(具体方法参见Xingyu Jiang，PNAS，2005，102，7
975-978)，MDCK(购自协和医院)，细胞密度为10 个/ml然后把MDCK通入左中右三个微流通道，再放入细胞培养箱，在37℃，二氧化碳体积浓度5％，培养2小时，细胞粘附在流通管腔内的金表面上；

[0076] 11)待细胞贴壁后，往中间通道注入纯水处理10分钟，揭掉聚二甲基硅氧烷印章一后，在同一平面得到正常细胞与损伤细胞的排列实现选择性损伤模型。

[0077] 实验结果见图5，步骤10)的结果如图5中的a，由该图可见，位于基底左右两侧的MDCK细胞为连续的细胞条带，且横向宽度为500微米(与微流通道的宽度一致)；位于基底中间的MDCK细胞为间隔300微米排列的细胞条带，该细胞条带的纵向宽为100微米，横向宽度为500微米(与微流通道的宽度一致)。用纯水在中间通道损伤细胞10分钟的结果图如图5中的b，由该图可见，位于基底中间的MDCK细胞在纯水处理10分钟后，收缩变圆，而两侧未作处理的MDCK细胞形态正常。揭掉通道后在同一基底得到正常细胞与损伤细胞的排列结果如图5中的c所示，可见在揭掉微流通道后，在同一基底上，正常的MDCK细胞连续条带位于左右两侧，被损伤的细胞以一定排列位于中间。