大豆胞囊线虫RNA解旋酶CGH-1及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种大豆胞囊线虫RNA解旋酶CGH-1及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大豆胞囊线虫发育相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供了大豆胞囊线虫RNA解旋酶CGH-1及其编码基因，并基于该编码基因设计了RNAi表达载体，将该RNAi表达载体导入植物，可在植物中所述基因的dsRNA，当病虫在摄入转基因植物后，生殖或发育产生严重障碍，从而抑制病虫的侵染和传播。通过本发明的方法可以获得具有很强抗虫活性的转基因植物，为进一步培育广谱抗虫性的大豆新品种奠定基础。

权利要求

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1）或2）所述的DNA分子：

1）序列表的序列2自5’末端第499至1839核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.含有双链DNA片段A和双链DNA片段B的重组质粒；所述双链DNA片段B与所述双链DNA片段A为反向互补序列；所述双链DNA片段A如序列2的序列2自5’末端523至

1090位核苷酸所示。

6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒是在载体pZH01的不同多克隆位点分别插入所述双链DNA片段A和所述DNA片段B得到的重组质粒。

7.如权利要求6所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒为在骨架载体pZH01的XbaⅠ和Sa1Ⅰ酶切位点之间插入所述双链DNA片段A、KpnⅠ和SacⅠ酶切位点之间插入所述双链DNA片段B得到的重组质粒。

8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求5至7中任一所述重组质粒导入目的植物中，得到大豆胞囊线虫抗性高于所述目的植物的转基因植物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为大豆。

11.权利要求1所述蛋白，或权利要求2或3所述基因，或权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或权利要求5至7中任一所述重组质粒在培育抗大豆胞囊线虫植物中的应用。

说明书

大豆胞囊线虫RNA解旋酶CGH-1及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种大豆胞囊线虫RNA解旋酶CGH-1及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 大豆起源于中国，是人类蛋白和食用油的重要来源，全世界食用油的31％来自大豆。我国是大豆消费大国，年消费总量超过4000万吨，而国内大豆年总产量却只有不足1700万吨。因此，必须依靠大量进口来填补空缺。我国大豆生产的主要问题是单产低，2008年平均单产只有114公斤/亩，仅为世界平均单产的70％，与美国等先进国家相比差距更大。造成我国大豆产量低的原因除了品种和种植等问题外，病虫害是重要原因。

[0003] 大豆胞囊线虫病是世界范围内对大豆生产危害最为严重的病虫害之一。在我国，大豆胞囊线虫病是仅次于大豆花叶病毒病的第二大病害，它主要分布于东北和黄淮两个大豆主产区。其中尤以多年连作区和干旱及沙碱老豆区最为严重。大豆受胞囊线虫病侵害后，轻者减产20％～30％，严重者减产达70％～80％，更为甚者会发生大面积种植地的绝收。大豆胞囊线虫病由胞囊线虫(Heterodera glycines，Soybean cyst nematode，SCN)引起，在大豆整个生长过程中均可发生。胞囊线虫寄生于大豆根上，导致主根和侧根发育不良，须根增多，整个根系呈须发状。须根上着生白色至黄白色的大小约0.5毫米的凸起，为线虫的胞囊。受害植株病根的根瘤很少或不结瘤；地上部分生长迟缓，幼苗期子叶及真叶变黄大；
重病苗生长停止，乃至死亡。受害植株一般表现为矮小，叶片发黄，花芽簇生，节间缩短，开花期延迟，结荚少或不能结荚。

[0004] 有鉴于此，胞囊线虫病的防治是大豆生产所长期面临的艰巨任务。使用高毒性的杀虫剂如DDT、呋喃丹、涕灭威等虽然可以杀死线虫，但会造成严重的环境污染，因而已被禁用或限制使用。利用传统的育种程序培育大豆抗性品种遇到的问题是回交程序烦琐，抗性鉴定复杂。通过回交育种方法选育一个品种，至少需要十年时间，大大地限制了抗大豆胞囊线虫新品种的选育。

[0005] RNA干扰技术(RNAi)的出现使通过转基因技术获得具有广谱抗胞囊线虫的高产大豆品种及其它作物品种成为可能。RNAi现象最先发现于植物中并在非寄生性线虫-秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中得以揭示，随后在植物、果蝇和脊椎动物中动物中被进一步证实。秀丽线虫在摄入含dsRNA的大肠杆菌后，在其肠道中消化，其中的dsRNA可被吸收并在细胞间传递，到达大部分组织和细胞中，造成靶基因所编码mRNA的特异性降解，从而影响目的基因的功能。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种大豆胞囊线虫RNA解旋酶CGH-1及其编码基因与应用。

[0007] 本发明提供的蛋白质，获自大豆胞囊线虫(Heterodera glycines，Soybean cyst nematode)，是如下(a)或(b)：

[0008] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0009] (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大豆胞囊线虫发育相关的由序列1衍生的蛋白质。

[0010] 为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0011] 表1标签的序列

[0012]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0013] 上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0014] 编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

[0015] 所述基因可为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

[0016] 1)序列表的序列2自5’末端第499至1839核苷酸所示的DNA分子；

[0017] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；

[0018] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码大豆胞囊线虫发育相关蛋白的DNA分子；

[0019] 4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码大豆胞囊线虫发育相关蛋白的DNA分子。

[0020] 上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

[0021] 含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

[0022] 本发明还保护含有双链DNA片段A和双链DNA片段B的重组质粒(干扰质粒)；所述双链DNA片段B与所述双链DNA片段A为反向互补序列；所述双链DNA片段A如序列
2的序列2自5’末端523至1090位核苷酸所示。所述重组质粒还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。构建所述重组质粒时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；构建所述重组质粒时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物进行鉴定及筛选，可对所用重组质粒进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组质粒可为在载体pZH01的不同多克隆位点分别插入所述双链DNA片段A和所述DNA片段B得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为在骨架载体pZH01的Xba I和Sal I酶切位点之间插入所述双链DNA片段A、Kpn I和Sac I酶切位点之间插入所述双链DNA片段B得到的重组质粒。

[0023] 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述重组质粒导入目的植物中，得到大豆胞囊线虫抗性高于所述目的植物的转基因植物。所述重组质粒可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导(如发根农杆菌K599)、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述双子叶植物具体可为大豆，如大豆科丰1号。所述大豆胞囊线虫具体可为大豆胞囊线虫4号生理小种。

[0024] 所述蛋白，或所述基因，或所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或所述重组质粒均可用于植物育种，如培育抗大豆胞囊线虫植物。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述双子叶植物具体可为大豆，如大豆科丰1号。所述大豆胞囊线虫具体可为大豆胞囊线虫4号生理小种。

[0025] 本发明提供了大豆胞囊线虫RNA解旋酶CGH-1及其编码基因，并基于该编码基因设计了一种RNAi表达载体，将该RNAi表达载体导入植物，可以在植物中所述基因的dsRNA，当病虫在摄入转基因植物后，dsRNA进入肠道，产生的siRNA能进一步进入其它的组织和细胞中，引发所述基因的失活，使病虫的生殖或发育产生严重障碍，从而抑制病虫的侵染和传播。通过本发明提供的方法可以获得具有很强抗虫活性的转基因植物，为进一步培育具有广谱抗虫性的大豆新品种奠定基础。

附图说明

[0026] 图1为用KOD Plus DNA聚合酶扩增SCN cgh-1基因片段的电泳结果；2为SCN cgh-1基因片段；M为分子量标记；其它泳道均为与本专利无关的样本。

[0027] 图2为胶回收获得的片段的电泳结果；3为SCN cgh-1基因片段；M为分子量标记；其它泳道均为与本专利无关的样本。

[0028] 图3为5’-RACE和3’-RACE扩增获得的片段的电泳结果；2：SCN cgh-15’-RACE；7、8：SCN cgh-13’-RACE；M为分子量标记；其它泳道均为与本专利无关的样本。

[0029] 图4为SCN cgh-1RNAi表达载体的结构示意图。

[0030] 图5为重组农杆菌菌液的PCR鉴定电泳图；M：2000bp Marker；泳道3为重组农杆菌菌液的PCR扩增产物(cgh-1基因片段)。

[0031] 图6为GUS组织化学染色的照片。

[0032] 图7为各组大豆的总RNA的电泳图；1-5：实验组大豆的根系总RNA；CK：对照组甲大豆的根系总RNA。

[0033] 图8为各组大豆的RT-PCR鉴定电泳图；M：2000bp Marker；1-5：实验组大豆的PCR扩增产物；CK：对照组甲大豆的PCR扩增产物。

具体实施方式

[0034] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0035] X-Gluc溶液(pH 7.0)溶剂为水；溶质及其浓度如下：50mM Na3PO4，10mM Na2EDTA，0.1％(体积比)Triton X-100，0.1M K3[Fe(CN)6]，0.1M K4[Fe(CN)6]，0.5g/L X-Gluc和
20％(体积比)甲醇。

[0036] 大豆胞囊线虫(4号生理小种)：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：卢为国，盖钧镒，李卫东黄淮地区大豆胞囊线虫生理小种的抽样调查与研究.中国农业科学，2006，39(2)：306-312。

[0037] 大豆科丰1号：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文 献：Qi-Yun Zhou，Ai-Guo Tian，Hong-Feng Zou，Zong-Ming Xie，Gang Lei，Jian Huang，Chun-Mei Wang，Hui-Wen Wang，Jin-Song Zhang，and Shou-Yi Chen.Soybean WRKY-type transcription factor genes，GmWRKY13，GmWRKY21，and GmWRKY54，confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenic Arabidopsis plants.Plant Biotechnology Journal，2008，6，486-503。

[0038] 大豆感病品种Lee：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：卢为国，袁道华，李金英，李海朝，文自翔，张辉.大豆抗胞囊线虫基因不同世代遗传率的变化，河南农业科学，2010，(2)：24-27。

[0039] 载体pZH01：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：Junhuang Zou，Shuying Zhang，Weiping Zhang，Gang Li，Zongxiang Chen，Wenxue Zhai，Xianfeng Zhao，Xuebiao Pan，Qi Xie and Lihuang Zhu.The rice HIGH-TILLERING DWARF1 encoding an ortholog of Arabidopsis MAX3 is required for negative regulation of the outgrowth of axillary buds.The Plant Journal，2006，48，687-696。

[0040] 发根农杆菌K599：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参 考 文 献：Attila Kereszt，Dongxue Li，Arief Indrasumunar，Cuc DT Nguyen，Sureeporn Nontachaiyapoom，Mark Kinkema & Peter M Gresshoff.Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology，NATURE PROTOCOLS，2007，2(4)：948-952。

[0041] 实施例1、大豆胞囊线虫SCN cgh-1蛋白及其编码基因的发现

[0042] 一、大豆胞囊线虫SCN cgh-1蛋白及其编码基因的选择

[0043] 在NCBI的数据库中，截至2009年5月，大豆胞囊线虫的相关序列共有108045条，其中包括81873条核甘酸序列，26172条EST序列，183条mRNA和252条蛋白质序列。Alkharouf et al对大豆胞囊线虫的24438条EST序列和231条基因组序列进行处理，并与秀丽线虫的基因序列比对发现，二者之间有8334个基因序列相似，而这其中，有1508个基因在线虫中有致死表型，根据序列相似程度对这些有致死表型的基因进行分组，共分6组，其中最相似的(E-values在0和1E-100)基因有150条。发明人比对了150条基因和人类的亲缘关系，以及考虑氨基酸序列长度等因素选择了13条候选的致死基因进行克隆，其中一个基因即为本发明发现并保护的基因。

[0044] 二、大豆胞囊线虫SCN cgh-1蛋白及其编码基因的发现

[0045] 1、TRIZOL法从大豆胞囊线虫(4号生理小种)的胞囊中提取总RNA。

[0046] 2、将总RNA反转录为cDNA(用Clontech的RACE试剂盒：SMART RACE cDNA Amplification Kit，Cat No.634923)。

[0047] 3、基因片段的获得

[0048] (1)通过在NCBI的数据库中比对与秀丽线虫cgh-1同源的大豆胞囊线虫EST序列，并根据EST序列设计如下引物对(靶序列628bp)：

[0049] cgh-1HG Nhe I NS：5’-CCGCTAGCGTTTCTTCTTCGCGTCCGAT-3’；

[0050] cgh-1HG Xho I CAS：5’-GGCTCGAGTAGAAACTGAACAAGACGGTC-3’。

[0051] (2)以步骤2的cDNA为模板，用步骤3设计的引物对进行PCR扩增。

[0052] PCR扩增体系：cDNA 2ul，两条引物各2ul，MgSO4溶液2ul，KOD Plus DNA聚合酶1ul，KOD Plus DNA聚合酶缓冲液5ul，dNTP 5ul，DMSO 1ul，ddH2O 30ul。

[0053] PCR扩 增 程 序(BIO-RAD iCycler)：94 ℃2min，35×(94 ℃ 15s，57 ℃ 30s，68℃2min)，68℃5min，12℃保存。

[0054] PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

[0055] (3)用OMEGA Gel Extraction Kit(D2500-01)切胶回收条带，回收条带的琼脂糖凝胶电泳图见图2。

[0056] (4)用NEB限制性内切酶酶切回收的PCR片段。

[0057] 酶切体系：胶回收产物43.5ul，Nhe I 1ul，Xho I 1ul，Buffer 25ul，BSA 0.5ul。37℃酶切过夜，然后用OMEGA Gel Extraction Kit(D2500-01)切胶回收。

[0058] (5)用NEB限制性内切酶酶切载体pPD129.36。

[0059] 酶切体系：pPD129.365ul，Hind III 1ul，Xho I 1ul，Buffer 25ul，BSA 0.5ul。37℃酶切过夜，然后用OMEGA Gel Extraction Kit(D2500-01)切胶回收。

[0060] (6)将步骤(4)和步骤(5)回收的片段用NEB T4 Ligase连接。

[0061] 连接体系：pPD129.36(酶切后)1ul，基因片段(酶切后)12ul，T4 Ligase Buffer1.5ul，T4 Ligase 1ul。

[0062] (7)连接产物热激法转化DH5α感受态细胞，涂LB平板(Amp+)，37℃培养过夜，待长出克隆后，挑单克隆用Cloning PCR方法鉴定，得到阳性克隆(8)(11)，送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。测序结果见序列表的序列3。

[0063] 4、5’-RACE片段和3’-RACE片段的获得

[0064] (1)准备表2中的PCR Master Mix，并温和的涡旋混匀，过程中避免产生气泡。

[0065] 表2PCR Master Mix组成

[0066]成分 每个反应(ul) 9个反应(ul)
PCR-Grade Water 34.5 310.5
10X Advantage 2PCR Buffer 5.0 45.0
dNTP Mix(10mM) 1.0 9.0
50X Advantage 2Polymerase Mix 1.0 9.0
Total Volume 41.5 373.5

[0067] (2)在步骤(1)的基础上，5’-RACE PCR和3’-RACE PCR的反应成分见表3和表4。

[0068] 表3 5’-RACE PCR的反应组分

[0069]成分 每个反应(ul)
5’-RACE-Ready cDNA 2.5
UPM(10X) 5
GSP1 1
Master Mix 41.5
Total Volume 50.0

[0070] 表4 3’-RACE PCR的反应组分

[0071]成分 每个反应(ul)
5’-RACE-Ready cDNA 2.5
UPM(10X) 5
GSP2 1
Master Mix 41.5
Total Volume 50.0

[0072] (3)使 用BioRad iCycler PCR 仪 运 行 程 序 (Touchdown PCR)，条 件 为：5×(94℃30s，72℃3min)，5×(94℃30s，70℃30s，72℃3min)，27×(94℃30s，68℃30s，
72℃3min)，4℃for ever。扩增结果见图3。

[0073] (4)琼脂糖凝胶电泳后，用OMEGA Gel Extraction Kit(D2500-01)切胶回收。

[0074] (5)用全式金公司的pEASY-Blunt Simple Cloning Kit构建克隆，得到阳性克隆，并送英潍捷基公司(INVITROGEN)测序，3’-RACE的测序结果见序列表的序列4，5’-RACE的测序结果见序列表的序列5。

[0075] 将序列表的序列1所示蛋白命名为SCN cgh-1蛋白(由446个氨基酸残基组成)，是一种ATP依赖型的RNA解旋酶。将SCN cgh-1蛋白的编码基因命名为SCN cgh-1基因，其cDNA如序列表的序列2所示(2128bp)，5’UTP长498bp、编码区长1341bp(序列表的序列2自5’末端第499-1839位核苷酸)、3’UTR长289bp。

[0076] 实施例2、SCN cgh-1蛋白的功能验证

[0077] 一、SCN cgh-1RNAi表达载体的构建

[0078] 1、从大豆胞囊线虫(4号生理小种)的胞囊中提取总RNA，并反转录为cDNA。

[0079] 2、以cDNA为模板，用Primer-F和Primer-R组成的引物对(靶序列为序列表的序列2自5’末端523-1090位核苷酸，即SCN cgh-1基因片段)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

[0080] Primer-F：5’-CGC TCT AGA GAG CTC CGT CCG ATG GAA GAT TG-3’(下划线标注Xba I酶切识别位点及Sac I酶切识别位点)；

[0081] Primer-R：5’-ACG CGT CGA CGG TAC CGG AAG TCC TGG GAA AGG-3’(下划线标注Sal I酶切识别位点及Kpn I酶切识别位点)；

[0082] PCR 扩 增 体 系 (50μl)：cDNA 1μl，10×buffer 5μl，dNTP(10mM)1μl，Primer-F1μl，Primer-R 1μl，Pfu DNA Polymerase(TaKaRa)1μl，ddH2O 40μl。

[0083] PCR扩增条件：94℃3min；94℃30s、50℃30s、72℃30s，30个循环；72℃10m。

[0084] PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收500bp左右的目的片段。

[0085] 3、SCN cgh-1RNAi表达载体的构建

[0086] ①用限制性内切酶Sac I和Kpn I双酶切步骤2的目的片段，回收酶切产物。

[0087] ②用限制性内切酶Sac I和Kpn I双酶切载体pZH01，回收载体骨架(约11.5Kp)。

[0088] ③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒甲。

[0089] ④用限制性内切酶XbaI 和Sal I双酶切步骤2的目的片段，回收酶切产物。

[0090] ⑤用限制性内切酶Xba I和Sal I双酶切步骤③的重组质粒甲，回收载体骨架(约12Kp)。

[0091] ⑥将步骤④的酶切产物和步骤⑤的载体骨架连接，得到重组质粒乙，即SCNcgh-1RNAi表达载体。根据测序结果，对SCN cgh-1RNAi表达载体进行结构描述如下：骨架载体为pZH01，在骨架载体的Xba I和Sal I酶切位点之间插入了双链DNA片段A(如序列2自5’末端523-1090位核苷酸所示)，在骨架载体的KpnI和Sac I酶切位点之间插入了双链DNA片段B；双链DNA片段B与双链DNA片段A为反向互补序列。SCN cgh-1RNAi表达载体的结构示意图见图4。

[0092] 二、大豆根系的转化与表达鉴定

[0093] 1、将SCN cgh-1RNAi表达载体转化发根农杆菌K599，得到重组农杆菌。重组农杆菌菌液的PCR鉴定(采用Primer-F和Primer-R组成的引物对)电泳图见图5。重组农杆菌菌液扩增到了和目标片段大小一致的条带，说明SCN cgh-1RNAi表达载体已经整合进入发根农杆菌K599。

[0094] 用载体pZH01转化发根农杆菌K599，得到对照农杆菌。

[0095] 2、大豆根系转化

[0096] (1)实验组大豆的转化

[0097] 大豆科丰1号种子消毒，播种于消毒的砋石中；5天后，幼苗萌发；将重组农杆菌菌液接种幼苗的子叶节，然后将幼苗移植，保湿生长；2-3周后，发根出现；当发根5-10厘米时，剪断原初生根，移栽到土壤中(d6cm×h12cm的塑料杯)生长，每个植株一个塑料杯。

[0098] (2)对照组甲大豆的转化

[0099] 将对照农杆菌代替重组农杆菌进行步骤(1)操作。

[0100] (3)对照组乙大豆的转化

[0101] 进行步骤(1)的操作，但不接种重组农杆菌菌液。

[0102] 3、鉴定毛状根GUS基因的表达

[0103] 步骤2中，农杆菌侵染4周后，分别取实验组大豆和对照组乙大豆的根系进行组织化学染色，鉴定GUS基因的表达。具体步骤如下：将根系放入X-Gluc溶液37℃暗培养过夜；然后在室温下用70％(体积比)乙醇水溶液清洗30min；然后将根系放入水中，白色背景下的蓝色即为GUS表达位点。

[0104] 结果见图6。对照组乙大豆的根系没有变蓝，实验组大豆的根均变蓝了，转化效率约100％。GUS染色结果表明，采用重组质粒导入发根农杆菌转化大豆科丰一号技术有效。

[0105] 4、RT-PCR分析SCN cgh-1片段在大豆根部的表达

[0106] 步骤2中，农杆菌侵染4周后，取1株对照组甲大豆和5株实验组大豆的根系，提取总RNA(见图7)，反转录成cDNA，将cDNA模板均稀释5倍，进行cgh-1基因的RT-PCR扩增(采用Primer-F和Primer-R组成的引物对)。以tubulin基因调整模板用量，当扩增产物的亮度基本一致时，可确定模板浓度一致。

[0107] Trizol Reagent购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，TaKaRa Code：D6210A。PCR反应体系(25μl)：cDNA 2μl，Primer-F 1μl，Primer-R 1μl，2×TagPCR Master Mix 12.5μl，ddH2O 8.5μl。PCR扩增程序：94℃4min；94℃40s；52℃40s；72℃50s(30cycles)；72℃5min；10℃1h。

[0108] 图7中，所提RNA 28S核糖体RNA与18S核糖体RNA的带型比较清晰，无拖尾现象，说明提取的RNA有较好的完整性。

[0109] 扩增结果如图8所示，对照组甲大豆没有扩增出目的条带，而5株实验组大豆根系均扩增出568bp的目标条带。表明胞囊线虫cgh-1基因片段在大豆根系基因组中得到了正确转录。

[0110] 5、对大豆胞囊线虫的抗性鉴定

[0111] 步骤2中，农杆菌侵染4周后，在每个塑料杯中加入5ml致病液(每毫升含有约400个大豆胞囊线虫4号生理小种的卵)。接种致病液后保持土壤温度在24-30℃，30天后计算胞囊数。实验进行三次重复，结果取平均值。大豆株系对大豆胞囊线虫的抗性程度一般以寄生指数表示。寄生指数在0-9之间为高抗品种，10-30之间为中抗，31-60之间为中感，大于60为感病品种。

[0112] 寄生指数＝(测试植株每克根上着生的胞囊数/大豆感病品种Lee每克根上着生的胞囊数)×100。

[0113] 各组寄生指数的统计结果见表5。

[0114] 表5各组寄生指数的统计结果

[0115]实验组大豆 对照组甲大豆 对照组乙大豆 大豆感病品种Lee
接种株数 32 37 5 22
平均胞囊数/g根 65 111 109 276
P值 0.0002
寄生指数 23 40 39 100
IP鉴定结果 中抗 中感 中感
虫卵个数/g根 8798 18811
P值 ＜0.0001
单个胞囊虫内含有卵的个数 128 194
P值 0.122

[0116] 表5的结果表明，导入SCN cgh-1RNAi表达载体的植株每克根上胞囊的个数显著降低、每克根上的虫卵个数显著减低、单个胞囊内含有卵的个数也大大降低，即SCNcgh-1RNAi表达载体抑制了胞囊线虫的生长发育能力和繁殖能力。根据寄生指数判断标准，由表5可知，含实验组大豆的寄生指数为23，寄生指数鉴定标准为中抗，由于大豆科丰1号常年鉴定结果证明是一个中感大豆胞囊线虫4号生理小种的品种(寄生指数40左右)，因此SCN cgh-1RNAi表达载体的转入显著提高了大豆根系对胞囊线虫的抗性。