手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物及其制备和在制备抗癌药物中的应用

摘要

本发明提供了一类具有抗肿瘤活性的手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物，其结构式中如下：R1为取代或未取代的芳香基；R2为异丙基、异丁基、叔丁基；R3为乙基、苄基。本发明通过经典的体内、体外实验证实：手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物对乳腺癌、或膀胱癌、或前列腺癌、或肝癌、或宫颈癌的各类肿瘤具有增殖抑制作用。

权利要求

1.一类手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物，其结构式如下所示：

R1为苯基、卤代苯基、甲基取代苯基、甲氧基取代苯基、硝基取代苯基、氰基取代苯基、萘基或噻吩基；

R2 为异丙基、异丁基、叔丁基；

R3 为乙基、苄基。

2.如权利要求1所述手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物的制备方法，是以将2,4-二取代-噻唑酮与硝基苯乙烯为原料，以手性配体奎宁胺-松香硫脲为催化剂，甲基叔丁基醚为溶剂，在搅拌下，于0~5℃反应6~12h，浓缩反应液，硅胶柱层析纯化，得到目标产物；

所述手性配体奎宁胺-松香硫脲的结构式为。

3.如权利要求2所述手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物的制备方法，其特征在于：所述2,4-二取代-噻唑酮如下：

R2 为异丙基、异丁基、叔丁基；

R3 为乙基、苄基。

4.如权利要求2所述手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物的制备方法，其特征在于：所述2,4-二取代-噻唑酮与硝基苯乙烯的摩尔比为1.5:1~1.2。

5.如权利要求2所述手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物的制备方法，其特征在于：所述催化剂手性配体奎宁胺-松香硫脲的用量为硝基苯乙烯摩尔量的1~10 %。

6.如权利要求1所述手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物作为活性物质在制备抗癌药物中的应用。

说明书

手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物及其制备和在制备抗癌

药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于化学合成技术领域，涉及一类手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物及其制备方法；本发明同时还涉及这类手性化合物在制备抗癌药物方面的应用。

背景技术

[0002] 手性药物是由具有药理活性的手性化合物组成，它在人体内通过与生物大分子间相互手性匹配和分子识别而发挥治疗作用。虽然对应异构体药物在体外的物理化学性质基本上相同，但是，由于药物分子所作用的受体或靶位是由氨基酸、核苷、膜等组成的手性蛋白和核酸大分子等，它们对与其结合的药物分子的空间立体构型有一定的要求，因此，对映异构体药物在体内往往呈现很大的药效学、代谢动力学等方面的差异。在二十世纪末，随着人们对对映异构体药物的研究与认识不断深入，FDA等药政部门于1992年开始把对应异构体药物当做混合物加以审批，要求生产厂家提供对应异构体药物各个异构体的研究数据。这一措施大大促进了手性药物的研制与开发。世界手性药物的年销售额在1993,1994,1995,1996年分别为356,452,614,729亿美元，平均每年以20%以上的幅度增长。到2000年世界手性药物年销售额增至1233亿美元，达药物年销售总额（2000年3900亿美元）的三分之一 （StinsonS.C, Chem & Eng News. 2001, Oct14,15）。与对映异构体药物相比，单一组分的手性药物还具有用量少，疗效高，不良反应低等优点。

[0003] 目前的手性药物获取方法主要有三种：1）从天然产物中提取。该方法应用比较早，并且提取出了一些很有价值的手性药物，如紫杉醇；2）拆分法分离手性药物。通过拆分外消旋体来获得手性药物是一种很常用的方法，根据外消旋体的存在类型可以选择不同的方法。如使用右旋樟脑磺酸拆分D-苯基甘氨酸，年产量已达1000吨；3）不对称催化法合成手性药物，这也是目前应用最广泛的方法。近年来，随着合成方法的发展和先进分析技术的出现，越来越多的手性化合物已可以通过手性合成方法得到，因此不对称合成已成为获取手性药物的重要手段，也是最有希望和活力的研究领域。

[0004] 噻唑环类化合物作为一种具有重要生物活性的杂环，广泛存在于具有生物活性的分子中，并且应用于抗生素和消炎药的制备（Van Muijlwijk-Koezen J.E., Timmerman H., Vollinga R.C.,et al. J.Med.Chem.2001,44,749）。到目前为止，已经有许多的含有这类杂环的化合物应用于药物市场。例如已发现的噻唑烷酮就具有抗菌以及改善免疫力的作用；而氨基噻唑环则应用于治疗HIV，高血压和炎症。但是到目前为止，对噻唑类药物的研究依然局限于非手性以及消旋类化合物。因此，开发一种简单有效，绿色环保的有机不对称催化方法来合成手性噻唑类药物，对于降低药物生产成本，提高疗效，以及进一步研究药物代谢动力学都具有很重要的意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一类手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物。

[0006] 本发明的另一目的是提供一类手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物的制备方法。

[0007] 本发明的再一目的是提供一类手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物作为活性在制备抗癌药物中的应用。

[0008] （一）手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物

[0009] 本发明的手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物,其结构式如下所示：

[0010]

[0011] R1为苯基、卤代苯基、甲基取代苯基、甲氧基取代苯基、硝基取代苯基、氰基取代苯基、萘基或噻吩基；

[0012] R2 为异丙基、异丁基、叔丁基；

[0013] R3 为乙基、苄基。

[0014] （二）手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物的制备

[0015] 手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物的制备方法，是以将2,4-二取代-噻唑酮与硝基苯乙烯为原料，以手性配体奎宁胺-松香硫脲为催化剂，甲基叔丁基醚为溶剂，在搅拌下，于0~5℃反应6~12h，浓缩反应液，硅胶柱层析纯化，得到目标产物。

[0016] 所述2,4-二取代-噻唑酮结构为：

[0017]

[0018] 式中：

[0019] R2 为异丙基、异丁基、叔丁基；

[0020] R3 为乙基、苄基。

[0021] 所述2,4-二取代-噻唑酮与硝基苯乙烯的摩尔比为1.5:1~1.2:1（优选1.5:1）。

[0022] 所述催化剂手性配体奎宁胺-松香硫脲的用量为硝基苯乙烯摩尔量的1~10%（优选10%）。

[0023] 手性2-乙硫基-噻唑酮的制备化学式如下：

[0024]

[0025] 本发明制备的产物经质谱、核磁、红外鉴定，高效液相（HPLC）测定，高对应选择性和立体选择性合成了目标产物——手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物。通过检测其生物活性，发现该化合物具有很好的抗癌活性，可作为抗癌活性物质，应用在制备抗癌药物中。

[0026] （三）手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物的抗癌活性实验

[0027] 1、细胞培养的一般方法

[0028] 肿瘤细胞HepG-2，PC-3，MDA，Hela，T-24购自武汉中国典型培养物保藏中心，用添加10%小牛血清、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 μg/ml）、NaHCO3（2.0 mg/ml）的RPMI1640或者DMEM培养液在37℃、5% CO2条件下常规培养，取对数生长期细胞实验。

[0029] 1.1 MTT肿瘤细胞药物筛选实验

[0030] 实 验 方 法：MTT 全 称 为 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以用酶标仪在570nm 处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会有反应。指数生长的癌细胞，用D-Hanks 缓冲液配置的0.25 %胰蛋白酶消化以后，吹打使之成为单细胞悬液。计数使细胞浓度为5×104/ml, 90 μl细胞液加入到96 孔板中，放置过夜24 小时，然后加入10 μl 不同浓度的药物，每浓度平行六孔。共同再培养48小时后，每孔加入 10 μl的MTT（5mg/ml），并在37°C培养箱中共培养4小时。然后将培养液弃掉，每孔加入150μl DMSO来溶解甲臜。将细胞培养板在微孔震荡器上震荡使甲臜完全溶解，然后再 Bio-Rad 680酶标仪上测定490 nm处的吸光值。实验中每个浓度重复6孔，每次实验至少重复3次。分别测试不同浓度的药物作用，结果用IC50来表示。

[0031] 实验结果：所有实施例（1~23）的化合物对于肿瘤细胞均具有抑制增殖作用（表1）。所有的实施例（1~23）的化合物在10μM左右都表现出比较好的癌细胞的抑制作用。同时进行了药物光学活性的对比（见表2），发现只有光学活性的化合物表现出很好的活性，而消旋的化合物的活性基本丧失。

[0032] 表1

[0033]

[0034] 表2

[0035]

[0036] 1.2Annexin V/ PI 双染测定细胞凋亡

[0037] 实验方法：使用1×106MDA细胞培养24h后，加入不同浓度的药物，共同再培养48小时后，胰蛋白酶消化悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集，用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）。然后加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞，再加入5μl Annexin V/FITC混匀，最后加入5 μl Propidium Iodide混匀。将细胞置于室温、避光环境，反应
5～15min，使用 Epics XL-4流式细胞仪（BECKMAN-Coulter，USA）检测。

[0038] 实验结果：选取代表性的化合物DT-19进行试验，其结果显示如图1~4。实验结果进一步证实该化合物的作用是使癌细胞发生凋亡，随着时间的增加凋亡数目也在增加，48小时后晚期凋亡数目增加，死细胞数目也增加。这说明在生理浓度的作用下，该化合物对于细胞凋亡的程度的影响是与时间的长短成正比，而在全血清的作用下，化合物并没有降解，而是持续的发挥作用。其它化合物的作用结果基本相似。

[0039] 1.3 体内抗肿瘤实验

[0040] 实验方法：使用小鼠移植性肿瘤S180，购自肿瘤医院，使用的小鼠是清洁级母鼠，体重18-22g，由兰州大学医学院动物实验中心购入。将S180肉瘤以107每只小鼠0.2ml接种在母鼠腋下。第二天再给接种了S180的小鼠随机进行腹腔给药，给药量为0.2ml，每日给药一次，连续11d。停药次日断椎处死，称体重，解剖剥离皮下瘤体，称瘤重。按下式计算抑瘤率：

[0041] 抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

[0042] 实验结果：选取代表性的化合物DT-19进行实验，结果显示如表3以及图5。结果显示：在离体条件下化合物可以剂量依赖的减小肿瘤的体积，抑制肿瘤的生长，并在10mg以下计量毒性较低，对于小鼠的生命延长没有影响。所有实施例化合物的作用结果基本相似。

[0043] 表3

[0044]瘤重/g 1 2 3 4 5 6 7 8
对照组 0.62 0.76 0.42 0.49 0.54 0.43 0.47 0.78
1mg/kg 0.35 0.22 0.45 0.30 0.22 0.25 0.58 0.31
5mg/kg 0.30 0.33 0.25 0.39 0.41 0.19 0.39 0.16
10mg/kg 0.17 0.28 0.26 0.27 0.19 0.25 0.21 0.28

[0045] 综上所述，本发明制备的手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物具有以下特点：

[0046] 1、本发明的化合物为单一手性抗癌药物，相对于外消旋混合物有更好的疗效，并且药效代谢动力学更易研究。

[0047] 2、本发明手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物应用于抑制肿瘤细胞MDA，T-24，Hela，HepG-2的生长，取得了很好的效果。使用Annexin V/ PI 双染测定细胞凋亡发现化合物通过是癌细胞产生凋亡来抑制癌细胞的生长；应用于对于小鼠体内实体瘤生长的抑制，同样表现出明显的作用。

[0048] 3、本发明以2,4-二取代-噻唑酮与硝基苯乙烯为原料，以手性配体奎宁胺-松香硫脲为催化剂，合成原料简单、廉价易得，合成工艺简单、反应条件温和，副产物少，原子转化效率高；无需任何其他添加剂，操作无需苛刻的无水无氧条件，简便可行；反应中没有使用任何金属试剂，对环境友好；在合成过程中，只需一步简单的反应就可以得到具有一个四级手性中心碳的手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物，其中的合成产率可以达到87%并且具有97%和10:1的对应选择性和立体选择性。

附图说明

[0049] 图 1为Annexin V/ PI 双染未使用DT-19号药物作用的MDA细胞。

[0050] 图2为Annexin V/ PI 双染5μM DT-19号药物作用12h的MDA细胞。

[0051] 图3为Annexin V/ PI 双染5μM DT-19号药物作用24h的MDA细胞。

[0052] 图4为Annexin V/ PI 双染5μM DT-19号药物作用48h的MDA细胞。

[0053] 图5为化合物DT-19体内抗肿瘤实验图。

具体实施方式

[0054] 下面通过具体实施例对本发明手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物的结构和制备作进一步的说明。

[0055] 实施例1~23中，采用不同取代基的2,4-二取代-噻唑酮为原料，采用下述制备方法，得到了对应的手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物（DT-1~ DT-23）。

[0056] 具体手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物的制备方法为：将2,4-二取代-噻唑酮（0.15 mmol，1.5 eqv）和手性配体奎宁胺-松香硫脲（0.01 mmol，0.1eqv）加入装有磁子的圆底烧瓶中，加入1mL甲基叔丁基醚，在0℃的冰浴中冷却10min后加入硝基苯乙烯（0.1 mmol，1eqv），在0℃搅拌反应，点高效板检测反应完毕（6-12h）。浓缩反应液，硅胶柱层析纯化（石油醚/乙酸乙酯=15:1）得到产物。

[0057] 2,4-二取代-噻唑酮的结构式为：

[0058]

[0059] R2 为异丙基、异丁基、叔丁基；

[0060] R3 为乙基、苄基。

[0061] 制得对应的手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物的结构式为：

[0062]

[0063] R1为苯基、卤代苯基、甲基取代苯基、甲氧基取代苯基、硝基取代苯基、氰基取代苯基、萘基或噻吩基；

[0064] R2 为异丙基、异丁基、叔丁基；

[0065] R3 为乙基、苄基。

[0066] 手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物的质谱、核磁、红外鉴定数据及高效液相（HPLC）测定的对应选择性和立体选择性数据见表4。

[0067] 表4

[0068]

[0069]

[0070]

[0071]

[0072]