聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种聚乙烯亚胺衍生物，该聚乙烯亚胺衍生物为泊洛沙姆修饰的聚乙烯亚胺。本发明还公开了该聚乙烯亚胺衍生物的制备方法和应用。本发明的聚乙烯亚胺衍生物，不仅细胞毒性小，而且转染效率高，非常适于作为基因载体应用。

权利要求

1.一种聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，该聚乙烯亚胺衍生物为泊洛沙姆修饰的聚乙烯亚胺，其化学结构式如下：式中，PEI为聚乙烯亚胺，x＝2-80，y＝10-40，所述聚乙烯亚胺的分子量为2000。

2.根据权利要求1所述的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，所述泊洛沙姆选自：型号为F68、P105、P123或L61的泊洛沙姆。

3.根据权利要求1所述的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，所述泊洛沙姆和聚乙烯亚胺的反应摩尔比为1∶2-10。

4.根据权利要求3所述的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，所述泊洛沙姆和聚乙烯亚胺的反应摩尔比为1∶5-10。

5.根据权利要求4所述的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，所述泊洛沙姆和聚乙烯亚胺的反应摩尔比为1∶10。

6.权利要求1所述聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：用三光气和N-羟基琥珀酰亚胺活化泊洛沙姆两端羟基；

将活化的泊洛沙姆与聚乙烯亚胺反应，得泊洛沙姆修饰的聚乙烯亚胺。

7.权利要求1所述聚乙烯亚胺衍生物作为基因载体的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基因载体承载DNA或RNA。

说明书

聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种泊洛沙姆(Ploxamer，商品名Pluronic)修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用。因体内存在多种可以降解DNA或RNA的酶以及不同类型的生物屏障，所以治疗基因要想有效地到达靶部位，必须借助于一定的载体运输。质粒DNA一般进入细胞核后可有效表达，而RNA(siRNA或miRNA)则是在细胞质中发挥其调节作用，因此，如何构建不同类型的载体，使其或者可以在细胞质中聚集，或者可以穿透核膜而在细胞核中富集，是现在基因载体所关注的热点和难点。聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是目前应用较为广泛的一类非病毒基因载体，在体内外均有较高的转染效率，PEI的转染效率与其分子量相关，其分子量大于22000时才可获得满意的转染效果，但同时也具有较高的细胞毒性，而小分子量的PEI(Mw＝2000)细胞毒性很小，但其转染效率低下，无法达到治疗的目的。而且PEI与DNA形成的复合物在体内极易聚集(如沉积于肺毛细血管床，则导致严重的肺栓塞)，其载体系统的粒径和分散稳定性对缓冲盐体系和血清都非常敏感，导致应用于体内时毒性大、转染效率低、药代动力学和体内分布不佳。为了克服其缺点，一般使用生物相容性的亲水性聚合物如聚乙二醇(PEG)修饰PEI，以提高PEI/DNA复合物的稳定性，降低毒性，但是由于PEI被亲水性聚合物修饰后与细胞的亲和力降低，使得目的基因无法进入细胞，转染效率下降。如何通过化学修饰的手段提高PEI的体内外转染效率，同时降低细胞毒性，是目前研究的热点。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种聚乙烯亚胺衍生物，该聚乙烯亚胺衍生物是泊洛沙姆修饰的聚乙烯亚胺，其在体内外的稳定性好，细胞毒性小，且转染效率高。

[0004] 此外，还需要提供一种聚乙烯亚胺衍生物的制备方法及其作为基因载体的应用。

[0005] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

[0006] 在本发明的一个方面，提供了一种聚乙烯亚胺衍生物，该聚乙烯亚胺衍生物为泊洛沙姆修饰的聚乙烯亚胺，其化学结构式如下：

[0007]

[0008] 式中，PEI为聚乙烯亚胺，x＝2-80，y＝10-40。

[0009] 优选的，所述聚乙烯亚胺的分子量为2000。

[0010] 泊洛沙姆为两亲性聚合物，由亲水性的聚氧乙烯链(EO)和亲脂性的聚氧丙烯链(PO)组成，其化学结构式如下：

[0011]

[0012] EO链形成亲水性外壳，可以增加载体材料的胶体稳定性，降低PEI的细胞毒性；而PO链形成亲脂性内核，可以增加材料的亲脂性，提高对细胞的亲和力，进而提高转染效率。

[0013] 由于聚氧乙烯链的亲水性和聚氧丙烯链的亲脂性，使泊洛沙姆这类共聚物具有极不相同的表面活性，属于非离子型表面活性剂。根据亲水亲油平衡值(HLB)，泊洛沙姆具有从极端疏水性的Ploxamer 401(HLB＝0.5)到极端亲水性的Ploxamer 108(HLB＝30.5)的多种产品。

[0014] 优选的，本发明的泊洛沙姆选自：型号分别为F68、P105、P123、L61(Mw＝8594、6554、5780、2022)的泊洛沙姆。对于泊洛沙姆的商品型号，其识别码为一个表示其室温下物理形态的字母(L：液体，P：糊状，F：片状(固体))后缀两位或者三位数字，第一位数(及三位数字情况下的前两位数)乘以300表示疏水物聚氧丙烯的近似分子质量，后一位数x
10为聚氧乙烯所占的百分比(例如L61表示分子质量为1800g/mol的聚氧丙烯带有10％的聚氧乙烯构成的泊洛沙姆)。

[0015] 优选的，所述泊洛沙姆和聚乙烯亚胺的反应摩尔比为1∶2-10；更优选的，所述泊洛沙姆和聚乙烯亚胺的反应摩尔比为1∶5-10；最优选的，所述泊洛沙姆和聚乙烯亚胺的反应摩尔比为1∶10。

[0016] 在本发明的另一方面，提供了一种上述聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，包括以下步骤：

[0017] 用三光气和N-羟基琥珀酰亚胺活化泊洛沙姆两端羟基；

[0018] 将活化的泊洛沙姆与聚乙烯亚胺反应，得泊洛沙姆修饰的聚乙烯亚胺。

[0019] 在本发明的另一方面，还提供了上述聚乙烯亚胺衍生物作为基因载体的应用。

[0020] 本发明的聚乙烯亚胺衍生物，经细胞毒性实验和体外转染细胞实验证明，不仅细胞毒性小，而且转染效率高，适于作为基因载体应用。

附图说明

[0021] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

[0022] 图1是本发明PEI 2000-g-泊洛沙姆合成的反应路线图；

[0023] 图2是本发明实施例1修饰后的PEI 2000的NMR图谱图；

[0024] 图3是本发明实施例2修饰后的PEI 2000与PEI 25kd细胞毒性测定结果图；

[0025] 图4是本发明实施例3修饰后的PEI 2000与未修饰的PEI 2000体外转染实验测定结果图；

[0026] 图5是本发明实施例4利用共聚焦显微镜观察修饰后的PEI 2000随时间变化的入胞情况图。

具体实施方式

[0027] 本发明的聚乙烯亚胺衍生物是利用泊洛沙姆作为桥链分子串联低分子量聚乙烯亚胺而形成的聚合物，其作为基因载体，不仅细胞毒性小，而且转染效率高。

[0028] 本发明聚乙烯亚胺衍生物的制备方法如下(见图1)：

[0029] (A)泊洛沙姆两端羟基的活化

[0030] 称取适量除水后的泊洛沙姆，加入两倍摩尔量的三光气，溶于无水甲苯和无水二氯甲烷的混合溶液中，室温下磁力搅拌反应过夜。真空旋蒸除去溶剂，再用适量无水甲苯和无水二氯甲烷溶解，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺适量，磁力搅拌下，将无水三乙胺(溶于4ml无水二氯甲烷)逐滴加入反应液中，继续搅拌反应约4h。待反应完全后，将反应液过滤并再次真空旋蒸除去溶剂，所得残渣溶解于50ml乙酸乙酯中，高速离心后取上清液，旋转蒸发，挥去乙酸乙酯，冷却固化反应物，保存于-20℃干燥条件下，得双羟基活化后的产物。

[0031] (B)活化后的泊洛沙姆修饰聚乙烯亚胺

[0032] 将PEI 2000除水后溶于10ml无水二氯甲烷中，双活化的泊洛沙姆溶于10ml无水二氯甲烷中，同时将上述两液缓慢的滴入10ml无水二氯甲烷底液中，氮气饱和后室温磁力搅拌过夜，高速离心后取上清，旋转蒸发，得初产物。初产物用去离子后的双蒸水溶解，置于Mwco＝7000的透析袋中在4℃下透析4天，每24h换一次透析介质。将透析后所得的溶液冷冻干燥，-20℃保存。取适量纯化后的聚合物，一部分溶于水，利用渗透凝胶色谱法(GPC)测定其分子量；另一部分溶于D20，进行1H-NMR分析，确定结构。

[0033] 所得的接枝聚合物的命名为PEI 2000-ag-泊洛沙姆(Pluronic)，其中，a表示该聚合物中PEI与泊洛沙姆的反应投料比，本发明中，a可以选取2、5、10，即该聚合物中PEI与泊洛沙姆的反应投料比可以为2、5、10。所得接枝聚合物的具体命名可以分 别 为 PEI 2000-2g-F68、PEI 2000-5g-F68、PEI 2000-10g-F68、PEI 2000-2g-P123、PEI 2000-5g-P123、PEI 2000-10g-P123、PEI 2000-2g-P105、PEI 2000-5g-P105、PEI2000-10g-P105、PEI 2000-2g-L61、PEI 2000-5g-L61、PEI 2000-10g-L61。

[0034] 实施例1 泊洛沙姆修饰的聚乙烯亚胺的制备

[0035] 称取除水后的泊洛沙姆1.2mmol(F68＝10.31g，P105＝7.86g，P123＝6.94g，L61＝2.43g，德国巴斯夫公司)，溶于无水甲苯和无水二氯甲烷的混合溶液中，加入0.712g三光气(2.4mmol)，室温下磁力搅拌反应过夜。真空旋蒸除去溶剂，再用适量无水甲苯和无水二氯甲烷溶解，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺0.274g(2.4mmol)，磁力搅拌下，将无水三乙胺(0.4ml溶于4ml无水二氯甲烷)逐滴加入反应液中，继续搅拌反应约4h。待反应完全后，将反应液过滤并再次真空旋蒸除去溶剂，所得残渣溶解于50ml乙酸乙酯中，高速离心后取上清液，旋转蒸发，挥去乙酸乙酯，冷却固化反应物，得到活化后的泊洛沙姆，保存于-20℃干燥条件下。

[0036] 将PEI(0.10mmol，Mw＝2000，sigma公司)除水后溶于10ml无水二氯甲烷中，取双活化后的泊洛沙姆(0.01、0.02、0.05mmol)分别溶于10ml无水二氯甲烷中，同时将上述两液缓慢的滴入10ml无水二氯甲烷底液中，氮气饱和后室温磁力搅拌过夜，高速离心后取上清，旋转蒸发，得初产物。用去离子后的双蒸水溶解，置于Mwco＝7000的透析袋中在4℃下透析4天，每24h换一次透析介质。将透析后所得的溶液冷冻干燥，得到纯化后的反应终产物，-20℃下保存。取适量纯化后的聚合物，一部分溶于水，利用渗透凝胶色谱法1
(GPC)测定其分子量；另一部分溶于D2O，进行 H-NMR分析，确定结构。图2为一代表性聚合物的NMR图谱，从图2中可以看出，3.7-3.9ppm的峰为-CH2CH2O-单元质子峰，3.6-4.3ppm为-CH2CH2NH-单元质子峰，1.1-1.4ppm的峰为-CH3单元质子峰。NMR谱中未见其它峰，说明该聚合物具有较高的纯度。

[0037] 实施例2 泊洛沙姆修饰的聚乙烯亚胺的细胞毒性评价实验

[0038] 将Hela细胞接种在96孔板上，每孔约10,000个细胞，培养24小时后分别加入一系列浓度(0、4、6、8、16、24、32μg/ml)的PEI 25kd和修饰后的PEI 2000，继续培养24h，MTT法测定细胞毒性。从图3中可以看出经修饰的PEI 2000与PEI 25kd相比，在各个浓度都显示出了较强的细胞活性，尤其是在高浓度时，用修饰后的PEI 2000处理过的Hela细胞仍表现出很高的生物活性，为解决PEI作为基因载体细胞毒性过大的问题提供了一条有效的途径，究其主要原因是因为低分子量的PEI与泊洛沙姆的聚合产物在体内可以降解为小分子的片段，可以被体细胞代谢并排出，减少了聚集。

[0039] 实施例3 泊洛沙姆修饰的聚乙烯亚胺的体外基因转染实验

[0040] 转染前一天用0.1％胰酶+0.02％EDTA消化Hela细胞，均匀接种在24孔板上，使细胞汇合度达到50％，每孔加入DMEM培养基(含10％胎牛血清)1ml，培养24h，使Hela细胞汇合度达到70％-80％。转染前，换上无血清的DMEM培养基，分别将未修饰的PEI 2000和经修饰的PEI 2000(PEI 2000-g-Pluronic)与质粒pGL3形成复合物(w∶w＝10∶1，含质粒3μg)，加入到24孔板中，每种复合物重复做3孔，轻轻摇动24孔板使复合物铺匀，孵育4h后换含有10％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养。48小时后测定虫荧光素酶活性。

[0041] 从图4中可以看到，除了F68，各种泊洛沙姆修饰的PEI都比未修饰的PEI显示出更好的转染效率，并且，随着PEI投料比的增加，载体材料表面的正电荷越来越强，转染效率也随之增大。F68为水溶性较强的泊洛沙姆，其在促进载体穿透细胞膜方面能力相对较差，因此经其修饰的载体材料转染效率提高不明显。

[0042] 实施例4 共聚焦显微镜观察泊洛沙姆修饰的聚乙烯亚胺的入胞情况[0043] 将Hela细胞接种在六孔板(预放入无菌盖玻片)，每孔5×105细胞，培养24h后，将藻红蛋白标记过的PEI衍生物(泊洛沙姆修饰的聚乙烯亚胺)与DNA混合，孵育30min后转染细胞。实验分四组，分别为PEI 2000-10g-F68组，PEI 2000-10g-P123组，PEI
2000-10g-P105组和PEI 2000-10g-L61。按不同的时间点，于1min、5min、10min、20min后将盖玻片从六孔板中捞起，放在预先滴有20ul甘油的载玻片上，细胞面向载玻片，然后盖玻片中性树胶封片，激光共聚焦显微镜检测，结果如图5所示：

[0044] A(PEI2000-10g-F68，HLB＝29)：F68为水溶性较强的泊洛沙姆，它能在水中形成稳定的胶束结构，适合于难溶性药物的增溶。但因其亲脂作用较弱，故在透膜上有一定的困难，其在细胞内分散比较均匀，因此适合那种不需要一定进入细胞核表达才有效的药物；

[0045] B(PEI2000-10g-P105，HLB＝15)：相比于F68，P105的PO/EO比值变小，分子中亲水性成分变小，HLB值越小，因此脂溶性增大，更易透过细胞膜，从图5中可以看出，在30min时，大部分载体均已进入细胞，部分聚集于细胞核膜上；

[0046] C(PEI2000-10g-P123，HLB＝8)：同F68和P105相比，P123的PO/EO比值更小，脂溶性更大，更易透过细胞膜。在30min时，载体完全进入细胞，且有相当一部分已经穿过核膜，进入细胞核内。在所选的四种型号的泊洛沙姆中，B和C的HLB值比较适中，载体的溶解性能较好，透膜能力较强，实用性较强；

[0047] D(PEI2000-10g-L61，HLB＝3)：L61在这四种泊洛沙姆中是脂溶性最强的，也就具有最强的透膜能力，细胞内和核内分布最多，在30min时，大多数载体都已进入细胞核，因此，该载体更适合于需要进入细胞核的药物。

[0048] 以上实验结果表明经泊洛沙姆修饰的PEI作为基因载体，毒性小，转染效率高，且不同HLB值的泊洛沙姆修饰后得到载体材料，在转染基因时表现出不同的细胞内分布特点，可根据其在溶解性能及细胞膜穿透能力方面的差异，分别设计其作为DNA或RNA的转运载体。

[0049] 以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。