一种阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基转让专利
申请号 : CN201110371685.7
文献号 : CN102391971B
文献日 : 2012-12-26
发明人 : 张颖 , 王志刚 , 汪洋 , 郭火生 , 孟东芳 , 姜召 , 曹博
申请人 : 东北农业大学
摘要 :
一种阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基，它涉及一种发酵培养基。它解决了现有培养阿特拉津降解菌的培养基存在成本高、发酵后生物量低及不适合于发酵培养阿特拉津降解菌DNS32的问题。发酵培养基由玉米粉、豆饼粉、CaCO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl和蒸馏水组成。本发明中阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基的成本低，发酵周期短，发酵生物量高达7.194×108CFU/mL，比优化前提高了31.2％；从生物量上看，阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基每生产100亿个菌落的费用为0.038元，比无机盐培养降低了75.75％，比LB和牛肉膏蛋白胨培养基降低了95.25％和94.87％。
权利要求 :
1.一种阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基，其特征在于阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基由39.49g的玉米粉、25.64g的豆饼粉、3g的CaCO3、3.27g的K2HPO4、0.2g的MgSO4·7H2O、0.2g的NaCl和1000mL的蒸馏水组成。
2.根据权利要求1所述的一种阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基，其特征在于阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基在经过121℃灭菌30min后使用。
说明书 :
一种阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基
技术领域
[0001] 本发明涉及一种发酵培养基。
背景技术
[0002] 除草剂是保证农业的重要生产资料，给人类带来了巨大的经济效益的同时也由于除草剂的长残留、具有生物毒性等特点，一旦进入土壤、空气和水体后，也给各生态环境带来了严重污染。微生物修复技术被视为最有效的修复手段。
[0003] 阿特拉津降解菌，它为不动杆菌(Acinetobacter sp.)DNS32，可称为阿特拉津降解菌DNS32，该菌已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号.中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.5365，保藏日期为2011年10月21日；该菌实际在土壤中降解率可达88.97％。
[0004] 目前，用于培养阿特拉津降解菌的培养基主要有无机盐培养基包括两种方式以阿特拉津为氮源和以阿特拉津为碳源利用，除此之外还有LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。阿特拉津降解菌DNS32经试验验证，结果表明阿特拉津降解菌DNS32是以阿特拉津为氮源被利用的。
[0005] 通常使用的无机盐培养基和LB培养基配方如下：
[0006] 无机盐培养基由3g的葡萄糖、1.6g的K2HPO4、0.4g的KH2PO4、0.2g的MgSO4、0.4g的NaCl、0.1g的阿特拉津粉末和1000mL的蒸馏水组成；
[0007] LB培养基由5g的酵母膏、10g的蛋白胨、10g的NaCl和1000mL蒸馏水组成；
[0008] 牛肉膏蛋白胨由3g的牛肉膏、10g的蛋白胨、5gNaCl和1000mL的蒸馏水组成。
[0009] 根据市场价格配制1L无机盐培养需要0.67元费用，从其产生的活菌生物量成本方面看，每生产100亿个菌落需花费0.16元；配制1L LB培养基需要4.05元的费用，每生产100亿个菌落需花费0.81元；配制1L牛肉膏蛋白胨培养基需要3.75元，每生产100亿个菌落需花费0.75元。
[0010] 由此可见，无机盐培养基培养虽然成本较低，但是培养时间长，一般需要三到四天，不适合实际生产应用；LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基是实验室中常用来快速生产微生物的营养基，但是由于其成本过高，很难在实际发酵生产菌株中使用。
发明内容
[0011] 本发明目的是为了解决现有培养阿特拉津降解菌的培养基存在成本高、发酵后生物量低及不适合于发酵培养阿特拉津降解菌DNS32的问题，而提供了一种阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基。
[0012] 阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基由39.49g的玉米粉、25.64g的豆饼粉、3g的CaCO3、3.27g的K2HPO4、0.2g的MgSO4·7H2O、0.2g的NaCl和1000mL的蒸馏水组成。
[0013] 本发明中阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基，是专门针对阿特拉津降解菌DNS32而设计的，其主要基质北方地区玉米粉和豆饼粉是廉价的农副产品，容易获取，不需要深加工等优点，因此极大地降低了阿特拉津降解菌DNS32发酵培养基的成本；CaCO3可以稳定发酵液酸碱平衡，其他营养物质都是微生物生长所需要的。发酵周期短，培养时间为24小时。
[0014] 本发明中阿特拉津降解菌DNS32经发酵培养发酵生物量高达7.194×108CFU/mL，比优化前提高了31.2％；配制1L阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基需要0.27元，比无机盐培养基成本降低了40.71％，与LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基相比，成本都大幅度降低分别为93.16％和92.62％。从生物量成本上看，阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基每生产100亿个菌落的费用为0.038元，比无机盐培养降低了75.75％，比LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基降低了95.25％和94.87％。
附图说明
[0015] 图1为具体实施方式一的实验中实际生物量与预测生物量比较图，“□”表示以实际生物量为X坐标，预测生物量为Y坐标作图得到各点，“-”表示以各点为基础所得到的趋势线，其相关系数为95.84％。
具体实施方式
[0016] 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
[0017] 具体实施方式一：本实施方式阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基由39.49g的玉米粉、25.64g的豆饼粉、3g的CaCO3、3.27g的K2HPO4、0.2g的MgSO4·7H2O、0.2g的NaCl和1000mL的蒸馏水组成，121℃灭菌30min后使用。
[0018] 过程如下：
[0019] DNS32单菌落在装有无机盐培养基的50mL三角瓶中培养3-4天获得菌悬液，培养条件为温度30℃，装液量为30mL，转速为120rpm；将菌悬液的浓度稀释到OD600nm值为0.920后，以0.2％的接种量接入装有阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基的150mL三角瓶中扩大培养，摇瓶发酵条件为温度30℃，pH调到7.2，装液量为50mL，转速为120rpm，培养时间24h。
[0020] 其中无机盐培养基由1.6g的K2HPO4、0.4g的KH2PO4、0.2g的MgSO4、0.4g的NaCl、3.0g的葡萄糖、0.1g的阿特拉津粉末和1000mL的蒸馏水组成，121℃灭菌30min。
[0021] 经最优发酵培养后，DNS32的产量可到达7.194×108CFU/mL。用八层灭菌纱布过滤发酵液，得到菌悬液于50％甘油超低温冻结保存。
[0022] 实验：
[0023] 本实施方式中阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基选用低廉的用农副产品玉米粉，豆饼及少量的营养盐作为发酵基质，通过大量试验包括Plackett-Burman试验，响应面中心旋转组合试验和神经网络模型拟合、仿真及优化，结合统计学及生物学方法系统、全面的优化了其各组分的配比，最终得到发酵培养基的配方。
[0024] Plackett-Burman试验通过对培养基中6种基质成分进行重要性筛选，得到对发酵量影响显著的3种基质即玉米粉，豆饼粉和K2HPO4，之后通过响应面法中心旋转设计对已筛选出的3个重要成分做进一步优化试验，通过统计学分析和神经网络模型拟合、仿真研究各因素及各因素交互作用对发酵生物量的影响，最终确定优化条件和最优发酵生物量。
[0025] 验证试验结果表明，实际测得发酵后生物量与预测值十分相近，可以确定优化培养基成分为上述配方。
[0026] Plackett-Burman试验设计的因素水平及效应分析：Plackett-Burman试验以可信度大于90％作为筛选重要因素的条件，即P值(P＞|t|)小于0.1；结果由表1可知，6种培养基成分的重要性排序为玉米粉＞豆饼粉＞K2HPO4＞NaCl＞MgSO4·7H2O＞CaCO3，根据筛选条件选出前三个成分为重要因素进行进一步优化试验。
[0027] 表1
[0028]因素 E(Xi) T值 P＞|t| 重要性
玉米粉(g/L) -0.0783 -16.963 0.0375 1
豆饼粉(g/L) -0.0486 -10.800 0.0588 2
CaCO3(g/L) -0.0122 -2.634 0.231 6
K2HPO4(g/L) 0.0438 9.485 0.0669 3
MgSO4·7H2O(g/L) -0.0130 -2.824 0.217 5
NaCl(g/L) -0.0250 -5.405 0.116 4
玉米粉(g/L) -0.0783 -16.963 0.0375 1
豆饼粉(g/L) -0.0486 -10.800 0.0588 2
CaCO3(g/L) -0.0122 -2.634 0.231 6
K2HPO4(g/L) 0.0438 9.485 0.0669 3
MgSO4·7H2O(g/L) -0.0130 -2.824 0.217 5
NaCl(g/L) -0.0250 -5.405 0.116 4
[0029] 响应面中心旋转组合优化试验得到的回归方程的方差分析：通过进一步对重要因素优化试验，得到拟合方程，对方程进行方差分析见表2，结果表明，模型的F值为25.598，P值(Pr＞F)＜0.0001＜0.01，说明回归方程描述各因子与响应值之间的非线性方程关系2
是显著的，即这种试验方法是可靠的，回归方程也是高度显著的。调整后的决定系数Adj.R＝92.1％，说明响应值(发酵活菌生物量)的变化有92.1％来源于所选变量(三个重要培养基成分)。因此，回归方程很好地描述了各因素与响应值之间的真实关系，可以用来预测阿特拉津降解菌DNS32最佳发酵培养基成分含量。
是显著的，即这种试验方法是可靠的，回归方程也是高度显著的。调整后的决定系数Adj.R＝92.1％，说明响应值(发酵活菌生物量)的变化有92.1％来源于所选变量(三个重要培养基成分)。因此，回归方程很好地描述了各因素与响应值之间的真实关系，可以用来预测阿特拉津降解菌DNS32最佳发酵培养基成分含量。
[0030] 表2
[0031]方差来源 自由度 平方和 均方 F值 P＞F
线性部分 3 0.0106 - 4.420 0.0318
平方项部分 3 0.167 - 69.430 ＜0.0001
交互项部分 3 0.00706 - 2.940 0.0854
模型 9 0.184 0.0205 25.598 ＜0.0001
总误差 10 0.008 0.0008 - -
线性部分 3 0.0106 - 4.420 0.0318
平方项部分 3 0.167 - 69.430 ＜0.0001
交互项部分 3 0.00706 - 2.940 0.0854
模型 9 0.184 0.0205 25.598 ＜0.0001
总误差 10 0.008 0.0008 - -
[0032] 注：R2＝95.84％；Adj.R2＝92.1％；CV＝0.324。
[0033] 实际生物量与预测生物量比较：由图1可知，通过试验预测的最优条件及最优值2
与实际在最优条件下获得的生物量基本一致，相关系数R 为95.84％，说明通过该试验设计优化培养基成分含量是可行且有实际意义的。
与实际在最优条件下获得的生物量基本一致，相关系数R 为95.84％，说明通过该试验设计优化培养基成分含量是可行且有实际意义的。
[0034] 从实验结果中可知，阿特拉津降解菌DNS32经发酵培养发酵生物量高达8
7.194×10CFU/mL，比优化前提高了31.2％；配制1L阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基需要0.27元，比无机盐培养基成本降低了40.71％，与LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基相比，成本都大幅度降低分别为93.16％和92.62％。从生物量成本上看，发酵培养基每生产
100亿个菌落的费用为0.038元，比无机盐培养降低了75.75％，比LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基降低了95.25％和94.87％。
7.194×10CFU/mL，比优化前提高了31.2％；配制1L阿特拉津降解菌DNS32的发酵培养基需要0.27元，比无机盐培养基成本降低了40.71％，与LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基相比，成本都大幅度降低分别为93.16％和92.62％。从生物量成本上看，发酵培养基每生产
100亿个菌落的费用为0.038元，比无机盐培养降低了75.75％，比LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基降低了95.25％和94.87％。