一种微生物发酵生产二羟基丙酮的菌株HD924和方法

摘要

本发明属于涉及一种微生物发酵生产二羟基丙酮的菌株HD924，其分类属醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter）弗托氏葡萄糖酸杆菌（Gluconobacterfrateurii），该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCCNo.5397。本发明还给出了利用该菌株发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，其在好氧条件下能显著地积累二羟基丙酮，最高达到170g/L，可实现工业化生产。

权利要求

1.一种微生物发酵生产二羟基丙酮的菌株HD924，其分类属醋酸杆菌科

（Acetobacteraceae）葡萄糖 酸杆菌属（Gluconobacter）弗托氏 葡萄糖酸杆 菌（Gluconobacter frateurii），该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No. 5397。

2.利用权利要求1所述菌株HD924发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，其特征在于：包括如下步骤：将菌株HD924按1～10%的接种量接入发酵培养基，在好氧条件下于28～

30℃发酵培养48～72 h；所述发酵培养基组成为：甘油50～350g/L，氮源5～20g/L，碳酸钙0.1～15g/L，培养基pH 4～7。

3.根据权利要求2所述发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，其特征在于，将菌株HD924先按1～10%的接种量接种到一级种子培养基中，于28～30℃好氧培养4～24 h；然后将培养好的一级种子按1～10%的接种量接入二级种子培养基中，8～10 h后将培养好的二级种子按1～10%的接种量再接入发酵培养基；其中，所述一级种子培养基的组成为：甘油

30～50g/L，酵母粉5～15g/L，KH2PO4 0.1～0.5g/L，pH自然；所述二级种子培养基的组成为：甘油30～50g/L，酵母粉5～15g/L，CaCO3 0.1～0.5g/L，pH 4.0～7.0。

4.根据权利要求2或3所述发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，其特征在于，所述甘油选自食品级甘油、工业级甘油或皂化粗甘油。

5.根据权利要求2或3所述发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，其特征在于，所述氮源选自酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、尿素或无机铵盐。

说明书

一种微生物发酵生产二羟基丙酮的菌株HD924和方法

[0001] 技术领域

[0002] 本发明属于生物制造领域，具体涉及到用一种好氧微生物发酵甘油生产二羟基丙酮的菌株HD924和利用该菌株发酵甘油生产二羟基丙酮的方法。

背景技术

[0003] 二羟基丙酮，又称1,3-二羟基丙酮，英文名为1,3-dihydroxyacetone或dihydroxyacetone,简写为DHA，分子式为C3H6O3，分子量为90.08，是最简单的三碳酮糖，外观是白色或类白色粉末状结晶，具有甜、凉的味道，易吸湿并分解。一般状态下是二聚体(1,4-Dioxane)的结晶，经溶解或加热后变为单体。

[0004] 二羟基丙酮是一种天然存在、水溶性的最简单的酮糖，具有生物可降解性，可食用且对人体和环境无毒害；其分子中带有几个活泼集团，可催化多种反应。其衍生物是有机化学合成中非常重要的一类中间体。因此作为一种重要的化工原料、医药中间体和功能添加剂在国外已经得到了广泛的实际应用。因为二羟基丙酮分子中含有三种官能团，化学性质活泼，广泛参与诸如聚合、缩合等化学反应，是一种重要的化学合成中间体。在工业上，DHA可有效还原丁二烯—苯乙烯复合物；能有效催化甲醛到羟醛、羟酮的缩合反应；可合成杂环化合物、、甘油三酯、酮位取代化合物；还可用于合成无毒可降解的生物材料产品。此外，二羟基丙酮还可作为一种良好的活性着色成份被广泛应用到化妆品中。DHA最大特点之一就是具有极强的防晒性，可与皮肤表层自由氨基结合在皮肤表面形成一细密的薄膜，反射太阳光，屏蔽紫外线，阻止皮肤水分过度蒸发，起到很好的保湿及防晒作用。目前，DHA作为药物已经应用在低血糖与糖尿病的治疗及某些病毒性皮肤病（如对白斑和白癜风就具有显著疗效）的治疗上。作为医药中间体，DHA能合成一些治疗心血管疾病的药物。同时它还可直接作为一种抗病毒试剂，如在鸡蛋胚胎培养中，使用DHA能大大抑制鸡瘟病毒的感染，杀死51~100%的鸡瘟病毒。另外以DHA作为中间体合成相应的衍生物，可具有抗艾滋病病毒的作用。在农业及食品方面，二羟基丙酮可用作饲料添加剂，在猪饲料中加入一定量的二羟基丙酮和丙酮酸盐的混合物，能减少猪肉的脂肪含量增加瘦肉率。在膳食中添加二羟基丙酮可提高有氧耐力，也可以改变机体代谢率和底物利用血脂的变化等方面。

[0005] 二羟基丙酮的工业化生产主要是利用含有甘油脱氢酶微生物以甘油为底物发酵生产。目前报道最多的能产甘油脱氢酶的微生物为葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter）和醋杆菌属（Acetobacter），能产生二羟基丙酮的主要微生物资源如下： Bacillus xylinum、Acinetobacter sp. strain JC1 DSM 3803、Acetobacter xylinum A-9、Gluconobacter melanogenus IFO 3293、Gluconobacter melanogenus IFO 3294、Hansenula polymorpha CBS 4732、Candida boidinii 2201、Klebsiella aerogenes、Escherichia coli (strain ECFS)、Gluconobacter oxydans ATCC 621、Pichia membranifaciens、Bacillus licheniformis B-05571、Acetomonassp等。国内外关于高产二羟基丙酮的微生物资源报道较少。因此，自主创新地筛选出能够耐受高浓度甘油的微生物菌株，并且研究出一种能够生产高浓度二羟基丙酮的方法迫在眉睫。

[0006] 发明内容

[0007] 本发明目的在于提供一种对高浓度甘油有一定耐受性的菌株HD924，该菌株可用于微生物发酵生产二羟基丙酮。本发明还给出了利用该菌株HD924发酵生产二羟基丙酮的方法，该方法以廉价的甘油为原料，甘油转化率较高。

[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0009] 一种微生物发酵生产二羟基丙酮的菌株HD924，其分类属醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）葡萄糖 酸杆菌属（Gluconobacter）弗托氏 葡萄糖酸杆 菌（Gluconobacter frateurii），该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No. 5397，保藏日期2011年10月28日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0010] 利用所述菌株HD924发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，具体为：将菌株HD924按1～10%的接种量接入发酵培养基，在好氧条件下于28～30℃发酵培养48～72h；所述发酵培养基组成为：甘油50～350g/L，氮源5～20g/L，碳酸钙0.1～15g/L，用水配制，培养基pH 4～7。

[0011] 较好的，也可以将菌株HD924先按1～10%的接种量接种到一级种子培养基中，于28～30℃好氧培养4～24 h；然后将培养好的一级种子按1～10%的接种量接入二级种子培养基中，8～10 h后将培养好的二级种子按1～10%的接种量再接入发酵培养基；其中，所述一级种子培养基的组成为：甘油30～50g/L，酵母粉5～15g/L，KH2PO4 0.1～0.5g/L，用水配制，pH自然；所述二级种子培养基的组成为：甘油30～50g/L，酵母粉5～15g/L，CaCO3 0.1～0.5g/L，用水配制，pH 4.0～7.0。

[0012] 具体的，所述甘油优选为食品级甘油、工业级甘油或皂化粗甘油等。所述氮源选自酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、尿素或无机铵盐等。

[0013] 可通过本领域的常规方法来调节培养基的pH值，如添加盐酸、氢氧化钠、碳酸钠等无机酸碱盐。其中，所述发酵培养基、一级种子培养基及二级种子培养基的灭菌条件为115～121℃，15～25min。

[0014] 在本发明中，建立了一个筛选高产二羟基丙酮的模型。由于具有甘油脱氢酶的微生物能利用甘油做为碳源生长，并产生二羟基丙酮，因此设计出以甘油为唯一碳源的选择性平板，筛选出能够利用甘油的菌株。在平板上挑出较大的菌落至摇瓶发酵筛选。本发明的特点是从腐烂的水果中分离得到能有效产生二羟基丙酮的弗托氏葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter frateurii）HD924，其在好氧条件下能显著地积累二羟基丙酮（40－170 g/L），最高达到170 g/L，可实现工业化生产。本发明方法的突出优点是利用廉价的甘油为原料来发酵生产二羟基丙酮，该方法可持续生产，且对环境友好。

附图说明

[0015] 图1为弗托氏葡萄糖酸杆菌HD924的平板菌落照片（×10）；

[0016] 图2为弗托氏葡萄糖酸杆菌HD924的扫描电镜照片（×10000）；

[0017] 图3为弗托氏葡萄糖酸杆菌HD924的16S rDNA全序列测序结果；

[0018] 图4为基于BLAST结果构建的进化树。

具体实施方式

[0019] （一）弗托氏葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter frateurii）HD924的筛选：

[0020] 1、初筛：

[0021] 从腐烂的水果中取样，粉碎后，取10g加入90mL无菌生理盐水，振荡1 h，取上清-5 -6 -7液，稀释成一系列浓度梯度。取10 、10 、10 三个梯度0.2 mL涂布于平板培养基（平板培养基组成为：甘油30g/L，酵母粉15g/L，琼脂粉15g/L，KH2PO4 3g/L，pH自然），28℃培养3~4 d，获得单菌落。选取菌落均匀的平板，从其上挑取10－20个较大菌落分别接种至发酵培养基（每株菌株做一个摇瓶，发酵培养基组成为：甘油100 g/L，酵母粉10g/L，KH2PO4 3g/L，pH自然），28℃发酵培养48h。

[0022] 然后取1.5mL发酵液12000转/分离心5 min，取0.5 mL上清液，加入4.5mL二苯胺溶液（二苯胺溶液按下述方法配制：将0.6g二苯胺与54 mL无水乙酸混匀，再缓缓加入6mL浓硫酸，混匀即得），沸水浴15min后测定OD608，并依此计算出二羟基丙酮含量（具体的测定方法可参见：刘宇鹏，李华等，发酵液中1,3―二羟基丙酮的分光光度法测定，中国医药工业杂志,2011,42(11), 834－837）。

[0023] 选取产二羟基丙酮较高的百余株菌株，于4℃条件下保存其相应斜面（斜面培养基组成为：甘油30g/L，酵母粉15g/L，琼脂粉15g/L，KH2PO4 3g/L，pH自然，甘油为食品级）。

[0024] 2、复筛：

[0025] 将初筛保留的菌株转接于装有30mL发酵培养基的三角瓶中（每株菌株做三个摇瓶平行样，发酵培养基组成与初筛中的发酵培养基相同），200转/分，28℃好氧培养48h。

[0026] 取1.5mL发酵液12000转/分离心5min，取上清液，稀释后用HPLC法测定二羟基丙酮含量。HPLC条件如下：色谱柱 Aminex HPX-87H柱（7.8 mm×300 mm，9 μm）；流动相：8 mmol/L硫酸；检测器：RI检测器，UV检测器（检测波长215 nm）；柱温50℃；流速0.5 ml/min；进样量20 μl。

[0027] 多数菌株二羟基丙酮含量较低，仅有3-8-4号菌株（实验室该菌株编号为HD924）产二羟基丙酮显著，为45.7 g/L。表1中给出了产二羟基丙酮效果较好的数十余株菌株。

[0028]

[0029] （二）弗托氏葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter frateurii）HD924的鉴定：

[0030] 筛选得到的能有效积累二羟基丙酮且效果显著的微生物菌株HD924：该菌的细胞呈短杆状，不运动，无芽孢。革兰氏阴性，菌落在甘油平板上28℃条件下培养3～4d后菌落较小、湿润、圆形、隆起、边缘整齐、半透明、呈淡黄色，直径可达1.6－2.5 mm（见图1和图2）。

[0031] 按《伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）》、《葡萄糖酸杆菌属分类及其主要应用的研究进展》（冯静等，微生物学杂志，2010,30（2）:86-90）和《Gluconobacter sphaericus (Ameyama 1975) comb. nov, a brown pigment-producing acetic acid bacterium in the Alphaproteobacteria》（Taweesak Malimas et al., J Gen Appl Microbiol,2008,54:211-220）进行生理生化特性鉴定（结果见表2）。

[0032] 根据革兰氏染色、接触酶、氧化酶、还原硝酸盐、液化明胶、产吲哚、氧化乙醇到乙酸、氧化乙醇到乙酸、氧化乙酸盐到CO2和H2O、多醇类生酮、水解淀粉、D-木糖产酸、D-葡萄糖产酸、二羟基丙酮等Gluconobacter属的特征生理生化反应结果鉴定该菌株属于Gluconobacter 属。根据形成5-酮基葡萄糖酸、GYC上产色素、麦芽糖产酸、D-阿拉伯糖醇生长、赤藓糖醇、无烟酸时生长等种间生理生化特性鉴定该菌株属于Gluconobacter frateurii，拟命名为Gluconobacter frateurii HD924。

[0033] 同时，委托大连宝生物工程有限公司对HD924菌株进行16S rDNA全序列测序（共1364bp，结果见图3）。在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rDNA基因序列（见表3），用MEGA 4.0软件构建进化树分析（见图4）。基于16S rDNA序列分析和构建进化树分析得出HD924与Gluconobacter frateurii、Gluconobacter oxydans、Gluconobacter thailandicus 亲缘关系较近，菌株HD924可以确定为Gluconobacter 属。

[0034] 由上述鉴定结果可知，菌株HD924属醋酸菌科(Acetobacteraceae)葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter)弗托氏葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter frateurii），该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No. 5397。

[0035]

[0036]

[0037] （三）利用菌株HD924发酵生产二羟基丙酮：

[0038] 实施例1

[0039] 利用所述菌株HD924发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，具体为：将菌株HD924先按10%的接种量接种到一级种子培养基中（所述一级种子培养基的组成为：甘油30g/L，酵母粉15g/L，KH2PO4 0.3g/L，pH自然），于28℃好氧培养24h；然后将培养好的一级种子按5%的接种量接入二级种子培养基中（所述二级种子培养基的组成为：甘油30g/L，酵母粉15g/L，CaCO3 0.3g/L，pH 6.0），8 h后将培养好的二级种子按5%的接种量分别接入含不同甘油浓度的发酵培养基中（250mL三角瓶，装液量50mL）转速200转/分，28℃条件下发酵48 h，测定二羟基丙酮含量，实验结果见表4。

[0040] 其中，所述发酵培养基组成为：甘油50~350g/L，酵母粉10g/L，CaCO3 3g/L，pH6.0，甘油为食品级。（采用三角瓶培养时，种子灭菌温度121℃，15 min；发酵培养基灭菌温度115℃，25 min，CaCO3 160℃干热灭菌1 h；下同）。

[0041]

[0042] 实施例2

[0043] 将培养好的二级种子按5%的接种量分别接入甘油（甘油分别来自食品级甘油、工业级甘油和皂化粗甘油）浓度为100g/L的发酵培养基中（250mL三角瓶，装液量50mL）转速200转/分，28℃条件下发酵72h，测定二羟基丙酮含量，实验结果见表5。其中，所述发酵培养基组成为：甘油100g/L，酵母粉10g/L，CaCO3 3g/L，pH 6.0；食品级甘油纯度为99.5%，工业级甘油纯度为95%，皂化粗甘油为制皂工业废甘油（纯度60%）。一、二级种子的培养与实施例1相同。

[0044]

[0045] 实施例3

[0046] 利用所述菌株HD924发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，具体为：将菌株HD924按3%的接种量直接接入发酵培养基（250mL三角瓶，装液量50mL；所述发酵培养基组成为：食品级甘油100g/L，蛋白胨8g/L，碳酸钙5g/L，培养基pH 7）中，转速200转/分，在好氧条件下于30℃发酵培养72 h；测得发酵液中二羟基丙酮含量为67.4 g/L。

[0047] 实施例4

[0048] 利用所述菌株HD924发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，具体为：将菌株HD924按8%的接种量直接接入发酵培养基（250mL三角瓶，装液量50mL；所述发酵培养基组成为：食品级甘油100g/L，玉米浆20g/L，碳酸钙10g/L，培养基pH5）中，转速200转/分，在好氧条件下于30℃发酵培养72 h；测得发酵液中二羟基丙酮含量为73.9 g/L。

[0049] 实施例5

[0050] 利用所述菌株HD924发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，具体为：将菌株HD924按2%的接种量直接接入发酵培养基（250mL三角瓶，装液量50mL；所述发酵培养基组成为：食品级甘油100g/L，尿素8g/L，碳酸钙12g/L，培养基pH4）中，转速200转/分，在好氧条件下于28℃发酵培养48 h；测得发酵液中二羟基丙酮含量为10.5 g/L。

[0051] 实施例6

[0052] 利用所述菌株HD924发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，具体为：将培养好的二级种子按10%的接种量直接接入发酵培养基（250 mL三角瓶，装液量50 mL；所述发酵培养基组成为：食品级甘油100g/L，牛肉膏10 g/L，碳酸钙15g/L，培养基pH7）中，转速200转/分，在好氧条件下于28℃发酵培养48 h；测得发酵液中二羟基丙酮含量为69.9 g/L。一、二级种子的培养与实施例1相同。

[0053] 实施例7

[0054] 利用所述菌株HD924发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，具体为：将培养好的二级种子按5%的接种量接入装液量为4 L的7 L发酵罐（发酵培养基配方为：甘油160g/L，酵母粉15g/L，CaCO3 3g/L，pH6.0，甘油为食品级）中，转速400转/分，通气量2.5vvm。28℃条件下发酵48h，测得发酵液中二羟基丙酮含量为122.4 g/L。一、二级种子的培养与实施例1相同。

[0055] 实施例8

[0056] 利用所述菌株HD924发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，具体为：将菌株HD924按3%的接种量接种到一级种子培养基中，200转/分，28℃条件下好氧培养1天。然后按5%的接种量将培养好的一级种子接入装有二级种子培养基的250 mL三角瓶中（装液量为50 mL），8 h后按5%的接种量将培养好的二级种子接入装液量为100L的发酵罐中进行补料分批发酵。发酵罐转速200转/分，通气量1.0 vvm，28℃条件下发酵48h，测定发酵液中二羟基丙酮和残余甘油含量。一、二级种子培养基组成与实施例1相同。

[0057] 初始发酵培养基配方：甘油50g/L，酵母粉15g/L，CaCO3 1g/L，pH调至6.0。补料液甘油浓度100g/L，124℃灭菌40 min备用。当发酵液中初始甘油浓度下降到15g/L以下时，开始流加补入补料液将发酵液中甘油浓度控制在5～15g/L，所用甘油为食品级。

[0058] 分别在发酵第0h、2h、4h、8h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h测定发酵液中二羟基丙酮和残余甘油含量，实验结果见表6。

[0059] 发酵48 h，下罐时二羟基丙酮含量171.2 g/L，总计投入甘油（初始培养基中甘油加上补料甘油）折算后为193.4 g/L，残余甘油6.4 g/L，二羟基丙酮转化率（DHA/投入甘油，w/w）为88.5%。

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