家蚕BmSpry基因及其应用转让专利
申请号 : CN201110378304.8
文献号 : CN102392025B
文献日 : 2012-11-14
发明人 : 夏庆友 , 蒋亮 , 金盛凯 , 程廷才 , 陆改 , 徐汉福 , 王根洪
申请人 : 西南大学
摘要 :
本发明涉及生物基因领域，特别是涉自于家蚕的控制家蚕对核型多角体病毒（BmNPV）抗性的关键基因，所述家蚕BmSpry基因含有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；其以家蚕cDNA为模板进行PCR扩增而得，其在调节家蚕型多角体病毒抗性中的应用；BmSpry基因表达量降低一半导致家蚕对BmNPV的抵抗性降低了100倍，本发明克隆和鉴定一个影响家蚕对BmNPV抗性的关键基因；BmSpry基因在培育家蚕抗BmNPV品种的理论研究和生产应用中都具有重要的价值。
权利要求 :
1.家蚕BmSpry 基因，其特征在于，所述家蚕BmSpry 基因的编码区序列是如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的家蚕BmSpry基因，其特征在于，所述家蚕BmSpry基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1所述的家蚕BmSpry基因的制备方法，其特征在于：以家蚕大造品种全蚕或者组织cDNA为模板进行PCR扩增，设计的上游引物为 F：5'- cggtcgtttcgttggagc-3'，设计的下游引物为R：5'- atttgcgtagaatccaaaatactaac-3'，PCR反应条件为：94℃预变性
4分钟，然后94℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸
10分钟，得如SEQ ID NO:2所示的家蚕BmSpry 基因。
4.权利要求1所述的家蚕BmSpry 基因在培育家蚕抗核型多角体病毒品种中的应用。
说明书 :
家蚕BmSpry 基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物基因领域，特别是涉及家蚕的控制家蚕对核型多角体病毒（BmNPV）抗性的关键基因。
背景技术
[0002] 蚕桑生产是丝绸工业的基础，在我国很多农村地区，养蚕业是当地经济的支柱性产业和农民的主要经济收入来源，蚕丝业每年为蚕农创收上百亿元。核型多角体病毒病是蚕业生产上最常见而且危害最严重的一类蚕病，引起该病的病原为核型多角体病毒（BmNPV），该病的传染力极强并且难以控制，全国各蚕业主产区经常因为该病的爆发而造成严重的经济损失。
[0003] 由于BmNPV在蚕业生产上危害严重，科研工作者对它的病原特性、感染性和抵抗性作了持续深入的研究。目前的研究结果显示：不同的家蚕品种对BmNPV的抵抗性不一样，家蚕对BmNPV的抵抗性是由多基因控制的，其中至少有一个是主效基因。对家蚕抗性关键基因及其调控序列进行克隆和鉴定，为阐明家蚕抵抗BmNPV的机制，以及培育抗性品种应用于蚕业生产有着重要的理论价值和实践意义。
发明内容
[0004] 本发明的目的之一在于提供一段核苷酸序列及其制备方法，该序列为家蚕调控核型多角体病毒抗性的关键基因。
[0005] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0006] 家蚕BmSpry基因，所述家蚕BmSpry基因的核苷酸序列含有如SEQ ID NO:1所示。
[0007] 进一步，所述家蚕BmSpry 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008] 所述的家蚕BmSpry基因的制备方法，以家蚕大造品种全蚕或者组织cDNA为模板进行PCR扩增，设计的上游引物为 F：5'- cggtcgtttcgttggagc-3'，设计的下游引物为R：5'- atttgcgtagaatccaaaatactaac-3'，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性
40秒、58℃退火40秒、72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟，得如SEQ ID NO:2所示的家蚕BmSpry 基因。
40秒、58℃退火40秒、72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟，得如SEQ ID NO:2所示的家蚕BmSpry 基因。
[0009] 本发明的目的之二在于提供家蚕BmSpry 基因的应用，该应用为调控家蚕核型多角体病毒抗性提供了新方法。
[0010] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0011] 所述的家蚕BmSpry 基因在调节家蚕型多角体病毒抗性中的应用。
[0012] 本发明的有益效果在于：通过对转基因家蚕敏感系统LI-S进行检测，克隆得到了一个家蚕抗性关键基因BmSpry全长序列，包括213bp的5’非翻译区序列（5’Untranslated region，5’UTR）、642bp编码区序列（Coding sequence，CDS）和332 bp的3’非翻译区序列（3’UTR）。BmSpry 基因表达量降低一半导致家蚕对BmNPV的抵抗性降低了100倍，本发明克隆和鉴定了一个影响家蚕对BmNPV抗性的关键基因。BmSpry基因在培育家蚕抗BmNPV品种的理论研究和生产应用中都具有重要的价值。
附图说明
[0013] 图1为LI-S和正常大造添食不同浓度BmNPV以后的死亡率统计结果。
[0014] 图2为LI-S外源片段在家蚕基因组和染色体上的插入位点分析。
[0015] 图3为RT-PCR检测正常大造和LI-A以及LI-S中BmSpry 的表达量。
[0016] 图4为定量PCR检测正常大造和LI-A以及LI-S中BmSpry 的表达量。
[0017] 图5为插入位点附近其他基因RT-PCR检测结果。
[0018] 图6为BmSpry 基因的结构示意图（上）和全长序列及对应的氨基酸序列（下）。
具体实施方式
[0019] 实施例1 转基因家蚕LI-S和LI-A的构建
[0020] 一 构建转基因增量表达载体pBac[IE1P- lipase-1-3×P3-EGFPafm][0021] 1 用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切载体pBSII-IE1-orf，回收获得IE1启动子片段，并把其连入L4440载体，用SV40引物（SV40 F: 5‘-tgctctagaagatcataatcagccata-3’, SV40 R: 5‘-ggaagatctgcagtgaaaaaaatgctt-3’）从piggyBac [3×p3 EGFP afm]中扩增出SV40终止信号，由于引物两端分别加有Xba Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切位点，以此两个酶双酶切把SV40加入已经带有IE1启动子的L4440载体，这样重组载体L4440-IE1P-SV40中既包含IE1启动子序列，又含有SV40终止信号。
[0022] 2用Bmlipase-1引物（Lipase-1 F: 5‘-ccggaattcatgcctgatggcgagggtgt- 3’, Lipase-1 R: 5‘-ctagtctagattagaaaggccaactgctgcc-3’）从家蚕中肠cDNA中扩增出Bmlipase-1的CDS序列（如SEQ ID NO:3所示），TA克隆连入pMD19-T simple载体，进行PCR和酶切检测确定无误，并送由上海生物工程有限公司测序做进一步验证。
[0023] 3 用XbaⅠ和EcoRⅠ分别双酶切L4440-IE1P-SV40和Bmlipase-1 T克隆质粒，连接重组后，得到含有增量表达骨架结构（包含启动子、表达基因序列和终止信号）的L4440- IE1P- Bmlipase-1-SV40重组载体。
[0024] 4 用KpnⅠ 和Bgl Ⅱ 分 别 酶 切 pSLfa1180fa 载 体 和 L4440- IE1P- Bmlipase-1-SV40重组载体，连接重组后，得1180- IE1P- Bmlipase-1-SV40重组载体。
[0025] 5用 限 制 性 内 切 酶Asc Ⅰ 分 别 酶 切1180- IE1P- Bmlipase-1-SV40 及piggyBac[3×p3 EGFP afm]质粒。由于pSLfa1180fa载体骨架在多克隆位点两端都含有一个AscⅠ位点，切下的增量表达骨架结构便可与经AscⅠ酶切后5’端去磷酸化的piggyBac3×p3 EGFP afm线性片段连接，形成最终的转基因增量表达载体pBac[IE1P-Bmlipase-1-sv40-3×P3-EGFPafm]。
[0026] 上述实验的完成参见了西南大学陈杰的《增量表达抗病毒蛋白Bmlipase-1的家蚕转基因系统的建立》一文。
[0027] 二 转基因显微注射和阳性个体的筛选
[0028] 1 将家蚕大造品种蚕卵浸酸解除滞育以后，放于15℃和80%湿度的黑暗环境中催青直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养，化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4h，拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵，用于下一步的显微注射；
[0029] 2 将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐，在蚕卵产后2h 用Eppendorf显微注射仪将实施例1所得的转基因增量表达载体pBac[IE1P-Bmlipase-1-sv40-3×P3-EGFPafm]和辅助质粒A3H，一起注射进932粒大造蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度80%的环境中催青孵化，将孵化的510头G0代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾；
[0030] 3 G0代蚕蛾通过自交或回交共获得32蛾圈G1代蚕卵，用 Olympus®电动宏观荧光显微镜观察筛选并获得7个阳性蛾圈，转化效率为21.88%。
[0031] 三 转基因系统的抗性检测
[0032] 1 将实施例2所得的7个阳性蛾圈各自单蛾圈饲养，继代扩大得到7个转基因系统LI，随机选择3个转基因系统进行后续的抗性检测。
[0033] 2 取3个转基因系统和正常大造品种，在4龄起蚕时期以半致死剂量单头经口添食BmNPV病毒，4个系统各设置3个重复区，每个重复区100头蚕，同时每个系统设置3个不攻毒对照区，死亡率统计到化蛾时期；
[0034] 3 攻毒结果显示3个转基因系统中有两个系统(分别命名为LI-A和LI-B)提高了家蚕对BmNPV的抗性（符合我们的预期结果），但其中一个系统（命名为LI-S）对BmNPV的抗性明显降低。抗性检测结果显示：和正常大造系统相比较，转基因系统LIA一直具有明显的抗性效果，能降低35%左右的死亡率。LI-S对BmNPV的抵抗性比正常亲本低了100倍左右。具体为：
[0035] （1）将LI-A、LI-S和正常大造蚕卵浸酸（盐酸比重为1.073，温度为46℃，时间为5分钟）解除滞育以后，放于25℃和85%湿度的环境中催青10天左右直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养（温度：25℃，湿度：80%）。
[0036] （2）在四龄起蚕经口添食BmNPV病毒检测抗性。将新鲜的桑叶切成直径一厘米的小块，然后将病原涂抹在切好的桑叶小块上面，一头蚕单独吃一小块涂抹过病原的桑叶，只有将这小块桑叶吃完了的蚕才被挑选出来继续饲养，统计死亡率到化蛾。攻毒数据统计结4
果（图1）显示，在四龄起蚕以10 多角体/头经口添食感染BmNPV后，正常亲本（大造）和
6
LI-S的死亡率分别为10%和50%左右；在以10 多角体/头经口添食感染BmNPV后，正常亲本（大造）和LI-S的死亡率分别为50%和80%左右。和正常亲本相比，LI-S对BmNPV的抵抗性降低了100倍左右。
果（图1）显示，在四龄起蚕以10 多角体/头经口添食感染BmNPV后，正常亲本（大造）和
6
LI-S的死亡率分别为10%和50%左右；在以10 多角体/头经口添食感染BmNPV后，正常亲本（大造）和LI-S的死亡率分别为50%和80%左右。和正常亲本相比，LI-S对BmNPV的抵抗性降低了100倍左右。
[0037] 实施例2检测LI-S中外源片段的插入位点
[0038] 一 反向PCR鉴定LI-S外源片段的插入位点
[0039] 取20 μg实施例1提及的LI-S的基因组在37℃用 HaeⅢ酶切过夜，酶切产物纯化后用Solution Ⅰ（购买自TaKaRa）进行连接，以自连产物为模板，用转座子特异的引物进行PCR扩增(pb-left F: 5‘-atcagtgacacttaccgcattgaca-3’, pb-left R: 5‘-tgacgagcttgttggtgaggattct-3’)，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、54℃退火40秒、72℃延伸2分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pMD19-T载体连接，连接反应在T4 DNA 连接酶作用下，16℃过夜连接，然后转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序。将测序结果在家蚕基因组数据库中进行比对，结果（图2）显示外源片段插入在nscaf1898的12392322处，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示， 其距离最近的上游基因35.8Kb，距离最近的下游基因14.6Kb。
[0040] 二 LI-S外源片段插入位点的再次确定
[0041] 根据反向PCR的结果和家蚕基因组序列，设计两对引物对插入位点再次进行检测（LIS-Pb-1 F：5'-acaagcacgcctcacgg-3'，R：5'-tacaacaagcaaacatagcga-3'；LIS-Pb-2 F：5'- taccgcattgacaagcac-3'，R：5'-actcgatatgcctgctcc-3'），每对引物的上游引物在插入的载体序列上，下游引物在家蚕基因组上。以LI-S基因组为模板，用LIS-Pb-1和LIS-Pb-2两对引物进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、52℃退火40秒、72℃延伸35秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出目地条带，将目的条带回收连接转化，挑取阳性克隆测序。测序结果显示反向PCR的结果是正确的，LI-S的外源片段确实插入在家蚕基因组nscaf1898的12392322处（图2）。
[0042] 实施例3 检测LI-S外源片段插入位点附近基因的表达量变化情况[0043] 在家蚕基因组数据库中下载插入位点附近的基因序列和对应的EST序列，结果显示在距离插入位点150kb范围内，插入位点上游基因BGI000882、BGI001264、BGI001265（上述基因详见家蚕基因组数据库）有EST证据，插入位点下游基因BGI000879、BGI001266、BGI001267、BGI001268、BGI001269（上述基因详见家蚕基因组数据库）有EST证据。选择上述基因设计检测引物（BGI001266QRT F：5'-cgtgaaggcgctgttctacca-3'，R：5'-gcggcgggactagataatactgg-3'；其他基因检测引物略）。
[0044] 插入位点下游距离最近的基因为BGI001266基因。通过RT-PCR进行检测，RT-PCR的反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现除了LI-S中BGI001266基因表达量降低以外（图3），其他基因的表达量在LI-A、LI-S和正常大造中没有区别（图5）；定量PCR的结果显示，和正常大造和LI-A相比，LI-S中BGI001266的表达量降低了一半（图4）。LI-A外源片段插入在家蚕基因组12号染色体的nscaf2987上（TTACAGCGACTTAAACTTCTTTAA-piggyBac-TTAAAGTTGCTATTTTCATCAG），LI-A插入位点附近的基因表达量没有受到影响。由于LI-S和LI-A唯一的区别就是外源片段在家蚕基因组上的插入位点不一样，所以，LI-S对BmNPV病毒抵抗性大幅降低是由外源片段的插入导致BGI001266表达量降低引起的。
[0045] 实施例4 克隆BGI001266基因全长序列
[0046] 在家蚕基因组数据库中下载该基因的EST序列，根据家蚕基因组序列和该基因的EST序列，设计引物克隆该基因（BGI001266qc F：5'-cggtcgtttcgttggagc-3'，R：5'- atttgcgtagaatccaaaatactaac-3'）。以家蚕大造品种5龄3天幼虫cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出目地条带，将目的条带回收连接转化，挑取阳性克隆测序。
[0047] 测序结果显示我们克隆了BGI001266的1190bp全长序列，如SEQ ID NO:2所示，包括213bp的5’UTR、642bp CDS（如SEQ ID NO:1所示）和332 bp的3’UTR。
[0048] 该基因的GC含量高达71.5%，有两个外显子，编码区序列（Coding sequence，CDS）位于第2外显子上面。LI-S外源片段的插入位点距离该基因有14.6Kb。
[0049] 生物信息学分析发现该基因具有一个Spry的结构域，我们将其命名为BmSpry。在NCBI站点上用BLAST完成序列同源性分析，结果没有发现该基因的报道，说明BmSpry 基因是一个新基因。BmSpry 的全长序列以及对应的氨基酸序列如图6所示。
[0050] 查阅相关文献报道（Hong Joo Kim. Modulation of signalling by Sprouty: a developing story. (J) NATURE REVIEWS. 2004; Mark A. Lemmon.Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. (J) Cell. 2010; Susumu Katsuma. ERK- and JNK-Dependent Signaling Pathways Contribute to Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus Infection. (J) J Virol. 2007），我们发现Spry基因是MAPKs信号传导通路上游的一个负调控因子，BmNPV感染家蚕后利用MAPKs信号通路来进行复制增殖，当用抑制剂分别抑制家蚕细胞中MAPKs信号传导通路的ERK和JNK蛋白后，家蚕细胞中的病毒含量明显减少。
[0051] 在LI-S系统中，由于外源片段插入到BmSpry基因上游，可能破坏了BmSpry基因的调控序列，从而导致BmSpry的表达量降低一半，导致对MAPKs信号通路的抑制能力减弱。当BmNPV感染家蚕后，病毒能更加容易的利用该信号通路进行复制增殖，最终导致家蚕对BmNPV的抵抗性严重降低。所以，BmSpry基因是控制家蚕对BmNPV的抵抗性的关键基因。
[0052] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。